综述：利用微流控技术实现固相生物合成碳水化合物

《Green Synthesis and Catalysis》：Microfluidic-enabled solid-phase biosynthesis of carbohydrates

　　安奇通|英辰王|穆罕默德·索海尔|涛俊华|张星|郑杰
中国南京师范大学食品科学与制药工程学院微生物技术国家重点实验室，南京210046

**摘要**
碳水化合物在生物体中作为必需的能量来源、结构成分和生物活性物质，因此研究其合成方法成为化学和生物学的重要焦点。糖类的生物合成主要涉及两种策略：微生物合成和酶法合成。全细胞合成因其原料和催化剂再生成本低、效率高以及适合大规模生产而具有优势。酶催化则以其高效性、高选择性、温和的反应条件、环保性和精确的产品结构而著称。这两种策略广泛应用于精细化工、制药和食品工业。然而，它们都面临挑战，包括产品纯化困难、稳定性差以及成本高昂等问题——全细胞合成中的下游分离成本较高，而酶法合成中的酶制备和活化糖供体价格昂贵。微流控技术在糖类合成方面具有独特的优势，如精确调控、减少消耗和高度自动化，有效克服了全细胞合成和酶法合成的局限性。本综述旨在概述碳水化合物的基本概念、当前的合成方法及其各自的优缺点，并探讨液滴微流控合成的优势。此外，还提出了解决微流控技术不足的未来方案，为糖类合成研究提供新的见解和方法。

**1. 引言**
碳水化合物在自然界中无处不在，可以根据其结构和复杂性分为几类，包括单糖、双糖、寡糖、多糖和糖缀合物[1]。单糖不仅是新陈代谢的主要能量来源，也是糖类和糖缀合物的基本构建单元。如图1a所示，只有九种常见的己糖参与了真核生物糖类和糖缀合物的结构复杂性：葡萄糖（Glc）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、半乳糖（Gal）、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、葡萄糖醛酸（GlcA）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、岩藻糖（Fuc）和N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）[1]、[2]、[3]、[4]。各种单糖和糖苷键结合形成结构和功能多样的糖类[4]。一些糖类与生物分子结合（图1b），形成糖缀合物、糖蛋白、糖脂和糖RNA[5]、[6]、[7]、[8]，这些化合物存在于真核细胞或原核细胞以及病毒的表面或内部[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。它们在免疫反应、细胞间相互作用、病原体附着和癌症转移等关键生理过程中起着重要作用[8]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。

**2. 微流控技术辅助的生物制造**
微流控技术能够在微米尺度上精确控制流体，实现化学反应和生物测定。其优势包括精确的反应参数控制[41]、减少试剂消耗和废物产生[42]、高效的混合和质量传输[43]、集成和自动化[44]、高通量筛选和优化[45]、提高反应安全性和适用性[46]。这些优点有助于优化碳水化合物化合物的合成，提高合成效率、产品纯度和结构精度，同时降低生产成本和环境影响。微流控技术促进了碳水化合物的合成，为该领域的持续创新和发展铺平了道路。在本综述中，我们将从固定化酶、固定化底物和固定化细菌三个方面深入分析微流控糖类合成的原理和应用。通过研究现有方法的优点和局限性，我们探索微流控方法的潜在优势，期望为碳水化合物合成研究提供新的思路和方法，推动该领域的持续进步。

**2.1 微流控技术支持的生物制造**
微流控技术能够在微米尺度上精密控制流体，尤其是在亚微米级别[47]。这一领域融合了多个学科，包括化学、流体力学、微电子学、新材料、生物学和生物医学工程[44]、[48]、[49]、[50]、[51]、[52]，是一种跨学科的综合性方法。微流控技术的核心在于利用微通道处理或操纵微量流体，这些微通道的尺寸通常在数十到数百微米之间。微流控芯片根据制造材料可分为基于硅的、基于玻璃的、基于聚合物的、基于纸张的和混合集成类型[53]、[54]。

微流控技术在多个领域具有广泛的应用[55]、[56]、[57]。在生物医学领域，它用于细胞分析[58]、基因测序[59]、[60]、[61]、药物筛选和疾病诊断[44]。此外，它在化学分析[62]、[63]、环境监测[64]和食品安全[65]、[66]中也发挥着重要作用。该技术具有许多独特优势，如快速样品处理、精确的流体操控、减少样品和试剂用量、降低废物产生、提高能源效率以及缩短分析时间，使其成为传统实验方法的理想替代方案。在生物制造领域，微流控技术通过实现对整个生物生产工作流程的精确控制，从单细胞分析和高通量筛选到合成生物模块的构建，正在深刻改变这一领域。它促进了仿生“器官芯片”模型的设计，用于高效评估生物活性，并作为多功能微反应器，加速酶催化剂和工程微生物菌株的筛选和进化[67]、[68]。此外，基于液滴的微流控系统为合成生物学提供了理想的高通量平台，显著提高了人工细胞工厂的构建和优化效率。凭借其在通量、集成和自动化方面的优势，微流控技术正推动生物制造向更加精确、高效和智能的方向发展（图2）[69]、[70]、[71]、[72]、[73]。结合微流控技术和糖生物学的跨学科研究为碳水化合物科学家解决了糖类合成中的瓶颈问题。

**3. 微流控辅助的固相生物合成**
微流控技术的精确性和固相酶平台的效率相结合，为结构明确的糖类生物合成提供了一种新兴模型（图3）。如图3a所示，微流控系统提供模块化架构，可以配置为串联、并行或多通道格式，灵活集成多个反应单元，从而提高通量和扩大生产规模。串联通道设计特别适合多步骤或级联糖基化反应，而并行和多通道配置通过在相同反应条件下同时操作，解决了微尺度反应器的固有限制。将糖类前体或酶固定在微流控通道内的固体支持物上（图3b），可实现高通量、自动化和空间可控的糖类组装，同时减少试剂消耗并加速反应动力学[74]。如图3b所示，不同的固定化策略，包括固定化底物、固定化酶和固定化整个细胞，可以在定义的微环境中精确定位反应物种，从而减少酶的流失并促进受控的停留时间。此外，这种策略还有助于精确控制反应参数，如流速、反应温度和反应物浓度；因此，它提高了产量、稳定性和可扩展性[75]。此外，该系统与下游分析单元的兼容性允许实时感应和纯化，增强了用于各种功能糖组学和治疗应用的多糖库的合成[74]。这些集成策略不仅增强了微流控技术在多糖合成方面的应用，还提高了生产和优化效率（图3），概述了提高微流控反应效率和扩大生产的策略。下载：下载高分辨率图像（258KB）下载：下载全尺寸图像图3. 提高微流控反应效率和扩大生产的策略。(a) 微流控提供了多功能模块化平台，便于整合多个处理单元并增加吞吐量。单通道模型可以以串行和并行方式配置，以优化反应条件和处理流程。多通道模型通过允许多通道同时操作来扩展功能，从而进一步提高系统的吞吐量和效率。(b) 微流控系统被设计为底物、酶和细胞的固定化平台，以实现高效的反应处理。3.1. 与固定化糖酶相结合的微流控平台在碳水化合物生物合成中，一个核心的机制挑战在于协调具有不同且通常不兼容的催化要求的多种糖酶，包括最佳pH值、辅因子、底物特异性以及对抑制的敏感性差异。传统的罐式 batch 系统经常受到酶交叉抑制、中间产物降解和总体转化率降低的影响，尤其是在涉及糖核苷酸合成和糖基化的多酶级联反应中。在这种情况下，将固定化糖酶与微流控平台相结合不仅提供了普遍的过程优势，还为这些长期存在的限制提供了具体的机制解决方案。固定化酶代表了一种特殊的异相催化形式，因为它们可以被回收和再利用，通常能在较长时间内保持其活性，并适应各种工艺格式。在过去的二十年中，固定化酶技术越来越多地与微流控技术结合，以增强糖酶的性能。高表面积与体积比和缩短的扩散路径在微尺度条件下提高了混合和质量传递效率，促进了不稳定中间产物的快速转化，并最小化了副反应，这在糖核苷酸生物合成中尤为重要。此外，微流控系统允许集成温度控制和传感元件，同时利用层流效应建立适合个别酶的局部pH值或温度微环境，从而解决了多酶反应中的兼容性问题。此外，通过空间固定或液滴封装实现的酶的空间时间分隔，使得在批量系统中通常会相互干扰的酶之间能够协同作用，大大拓宽了级联反应设计的可能性。糖核苷酸是合成复杂多糖的基本构建块，其酶促合成通常需要多种酶组分。罐式多酶级联反应可以显著提高产量。然而，不同酶的底物特异性和不同的反应要求常常导致交叉抑制和不可兼容的反应步骤，从而限制了酶的活性和总体转化率。先前的研究已经展示了用于顺序级联反应的分隔酶固定化，但没有解决连续流动条件下的不兼容性问题。Dietmar博士通过将固定化糖酶与微流控设备结合解决了这一挑战（图4）。在一个微流控设备中建立了由分隔水凝胶固定的三种酶的级联反应。用于糖核苷酸CMP-Neu5Ac合成的酶N-酰基-D-葡萄糖胺2-异构酶（AGE）、N-乙酰神经胺酶（NAL）和CMP-唾液酸合成酶（CSS）被固定到块状水凝胶和微结构水凝胶-酶点阵列中，然后将其集成到微流控设备中（图4a和4c）。将酶分隔到不同的反应室中消除了交叉抑制，并允许使用更高的底物浓度。实现了高达25%的固定化效率和持续数周的长期酶活性。此外，固定化酶对抑制的敏感性降低，固定化酶之间的底物通道化提高了三酶级联反应的总体转化率。使用分隔微流控设备成功合成了CMP-Neu5Ac [76]。下载：下载高分辨率图像（403KB）下载：下载全尺寸图像图4. 用于合成CMP-Neu5Ac的三酶级联反应。(a) 用于CMP-Neu5Ac合成的三种酶被固定到块状水凝胶和微结构酶点阵列中，然后集成到微流控设备中。(b) 使用非分隔酶的三酶级联反应。(c) 在微流控设备中使用分隔酶的三酶级联反应。Aap：表观活性；Amax：最大活性。酶的固定化效率是根据反应溶液中ManNAc、Neu5Ac和CMP-Neu5Ac的浓度计算得出的。除了解决酶的不兼容性问题外，分隔微流控系统还有助于处理和纯化复杂多糖合成中的中间产物。涉及糖核苷酸合成的酶与糖基转移酶的结合，便于直接从单糖合成目标寡糖。Matthias及其同事报告了一种自动分隔流动微反应器系统，用于合成非硫酸化的人类自然杀伤细胞-1（HNK-1）糖肽。这种分隔流动微反应器系统包括六个磁性酶珠（MEBs），它们形成了分别用于合成尿苷5′-二磷酸-α-D-半乳糖（UDP-Gal）和尿苷5′-二磷酸-α-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）的酶级联，以及Leloir糖基转移酶β4-半乳糖转移酶和β3-葡萄糖醛酸转移酶。这种模块化组织使得反应中间产物能够在下游步骤中立即被消耗，从而最小化了积累和降解。非硫酸化HNK-1糖肽的合成实现了96%的产量。此外，由于微反应器的模块化和多路复用能力，通过增加额外的平行反应管或采用包含更多酶的更复杂级联反应，可以提高生产力。通过固定额外的核苷糖合成酶和糖基转移酶活性，可以在分隔流动微反应器中自动合成更复杂的多糖，解决了可扩展性和路径适应性问题[77]。微流控分隔还进一步实现了合成和纯化的整合，从而解决了通常主导多糖生物制造成本和复杂性的下游瓶颈问题。Aquino及其同事的工作标志着从单反应向多步骤、模块化连续生产的飞跃。他们提出了一个用于无细胞系统中连续和分隔合成N-连接糖蛋白的先驱微流控平台。该系统集成了三个模块化操作：无细胞蛋白合成（CFPS）、酶促糖基化和基于亲和力的纯化，每个操作都在串联连接的单独微流控芯片中进行。该设备通过空间分离蛋白合成和糖基化，减少了罐式系统中常见的竞争反应和副产物。使用蛇形PDMS微通道，系统支持连续的反应物流动，从而提高了蛋白产量（高达38.3 μg/mL sfGFP），这归因于改善的混合和更短的扩散路径。一个关键进展是在微通道内固定了糖基转移酶。寡糖基转移酶（CjPglB）被特异性生物素化并通过硅烷-PEG5000-生物素/NeutrAvidin系统固定在微通道表面。这种固定酶的策略实现了重复使用并在连续流动下保持了高糖基化效率。基于post的微流控设计用于捕获带Ni2+电荷的珠子，用于固定金属亲和色谱（IMAC），实现了His标记糖蛋白的在线捕获和富集，回收率约为45%，纯度约为78％。这一结果展示了微流控设计如何直接简化下游处理。该系统是模块化的，允许灵活重新配置不同的糖蛋白靶标和糖基化途径，并通过连接多个芯片来调整停留时间，支持可扩展的生产。这项工作代表了在微流控设备内进行酶促蛋白糖基化的首次演示，结合了无细胞系统的优点和微流控的精度和效率。该平台为糖蛋白的连续生物制造提供了有希望的途径，具有潜在的治疗生产和糖生物学研究应用[78]。这些研究表明，通过实现酶促步骤的空间和时间分离、反应条件的局部优化、高效的中间产物通道化和在线纯化，微流控平台为碳水化合物生物合成中的关键限制提供了具体的解决方案。这些能力对于多酶级联和连续流动过程尤为重要。3.2. 利用固定化底物的微流控技术微流控技术的深入整合，特别是其连续流动和数字液滴形式，与固定化策略的结合，以前所未有的方式推动了合成糖组学的发展，为自动化制备结构明确的多糖缀合物和寡糖提供了强大的工具。早期的工作成功将微流控引入了糖科学领域，奠定了技术基础。Martin等人的研究表明，数字微流控（DMF）的创新用途是创建一个人造高尔基体器官的功能原型（图5）。在这个平台上，肝素硫酸盐（HS）糖胺聚糖被生物素化并固定在链霉亲和素涂层的磁性纳米粒子上，然后在基于电润湿的芯片上的离散纳升液滴中操作（图5a）。这种底物固定和液滴微流控的结合使得D-葡萄糖胺基3-O-硫酸转移酶（3-OST-1）能够精确地修饰HS链，该酶通过单独的液滴传递并与含纳米粒子的液滴在芯片上合并（图5b）。这种方法的关键优势在于它允许在反应步骤之间轻松分离和清洗固定的底物，定位反应环境并最小化试剂消耗。芯片上的成功修饰通过工程HS对荧光标记的抗凝血酶III的结合亲和力的显著增加得到了验证，这一结果与离芯片反应相当。这项工作为使用数字微流控和固定化底物在自动化和微型化格式下进行复杂的多步骤酶促多糖合成建立了重要的概念验证，为高通量糖组学研究和治疗性糖的生物工程铺平了道路。这项工作的重要性在于它证明了将底物固定与液滴操作相结合的可行性，使得特定的酶促反应能够在微型化开放平台上进行，并且产品可以轻松分离，为进一步研究提供了关键灵感[79]。下载：下载高分辨率图像（365KB）下载：下载全尺寸图像图5. 用于生产肝素硫酸盐（HS）的人工高尔基体。(a) 肝素硫酸盐依次经过一系列酶的修饰，分别是N-脱乙酰酶/N-硫酸转移酶（NDST）、C5异构酶和2-OST、6-OST和3-OST。(b) 显示了带有3-OST-1酶修饰的磁性纳米粒子上HS分子的固定。首先，未取代的氨基被N-乙酰化，然后与二氨基吡啶化学结合，再连接到一个生物素分子上。因此生成的糖缀合物可以被黄色的链霉亲和素磁性纳米粒子捕获。接下来，3-OST-1酶使用PAPS作为辅因子催化HS的3-O磺化。为了检测3-O磺化的程度，使用了放射标记的PAPS并通过闪烁计数进行测量，结果显示每2 μg HS转移了1 pmol的3-O磺基。近年来，技术领域朝着完全自动化和可编程的方向发展。Sun等人展示了一个在糖工程方面的重大进展，他们开发了一个数字微流控（DMF）平台，完全自动化了寡糖的酶促合成和降解。核心创新在于将磺酸标记的底物和DEAE磁性珠子集成到基于液滴的系统中，实现了单个芯片上的“合成-纯化”循环。对于合成，团队成功地从标记的乳糖前体通过两个连续的酶模块组装了复杂的人乳寡糖lacto-N-四糖（LNT），并在步骤之间使用磁性珠子自动进行中间产物的捕获和纯化。同样，对于降解，标记的tetra-N-乙酰chitotetraose被外糖苷酶依次分解。这种通过带电标签固定反应中间产物的方法至关重要，因为它允许在每次反应步骤后通过简单的磁清洗和洗脱高效去除酶、副产物和过量试剂，所有这些都在微流控液滴的范围内完成。这项工作突显了DMF和底物固定之间的强大协同作用，提供了前所未有的自动化、最小的试剂消耗和对多步骤酶促过程的卓越控制。因此，该平台为完全自动化的糖合成仪和测序仪的发展奠定了坚实的基础，最终促进了结构明确寡糖的高通量生产和分析[68]。3.3. 微流控技术和微生物的固定化微流控技术为固定微生物以生产糖提供了几个显著的优势。首先，它能够精确控制温度、pH值和底物浓度等参数的微环境，为微生物代谢创造了最佳条件，从而提高了糖的产量和生产率。此外，可以使用微滴封装或表面图案化等先进策略固定细胞，提高了它们的稳定性，并实现了连续的长期生产。通过物理保护细胞、维持营养物质的供应以及屏蔽有害环境，微流控封装技术直接提升了催化效率和产物产量，优于传统的悬液培养方法。此外，基于液滴的隔室化使得单个细胞或小种群能够分离，减少了相互抑制作用，并稳定了细胞完整性，从而在较长时间内保持高催化活性。这些特点表明，微流控固定化不仅保留了微生物的活力，还直接提高了连续流糖生产系统中的生物催化性能。最后，该系统的微型化大大减少了试剂、细胞和能源的消耗，使得实验室规模的生产过程具有很高的成本效益，并减少了废物产生。

D-阿洛糖是一种高价值替代甜味剂，具有重要的生理活性，如低能量、抗氧化、抗肥胖和抗糖尿病作用。Jia等人开发了一种微流控系统，用于固定重组大肠杆菌全细胞催化剂，以连续高效地从玉米秸秆水解物中生产D-阿洛糖。该微流控装置由一个电机驱动的注射器组成，其中含有全细胞催化剂和海藻酸钠的混合物，然后将其注入氯化钙溶液中形成稳定的海藻酸钙纤维。纤维直径由针头大小控制，流速通过控制器调节，从而可以精确且可重复地制造固定化的细胞纤维。为了确认细胞成功封装，作者将催化酶替换为增强型绿色荧光蛋白（EGFP），利用荧光显微镜可视化追踪纤维内的细胞分布（图6a）。结果证实，细胞在直径为500 μm的纤维内均匀固定（图6b）。固定化的纤维表现出优异的重复使用性，在连续10个反应循环后仍保持了初始活性的84.53%。这些纤维在纯水中（pH约7.5）保持稳定，无需使用可能破坏海藻酸钙基质的缓冲剂，这对可扩展性和降低成本非常重要。这种微流控固定化策略不仅提高了全细胞生物催化剂的操作稳定性和可回收性，还简化了下游处理过程，展示了微流控系统在推进可持续化学生产的整个细胞生物工艺中的重要性[80]。尽管这种方法具有很大潜力，但仍面临诸多挑战，主要集中在放大效应上。此外，这项技术复杂且成本高昂，需要专门的技能和洁净室设施进行芯片制造，同时还涉及复杂的泵、阀门和传感器系统。另外，微环境中的限制生长可能会对微生物产生独特的生理压力，可能影响其长期生产力。

通过微流控合成或生物转化后，产品可以通过集成在芯片上的下游模块进行回收和纯化，无需转移到外部容器中，包括芯片上的分离、连续提取或过滤。微流控系统还可以利用功能性标签或磁分离实现无需色谱法的纯化。产品通常通过芯片出口处的连续流动收集，常与在线分析设备结合使用。与传统工作流程相比，这些策略减少了溶剂消耗、纯化时间和人工操作。

**图6.** 微流控系统用于制备海藻酸钙纤维。(a) 注射器由电机驱动，内含全细胞催化剂和海藻酸钠溶液的混合物。烧杯中的氯化钙溶液与注射器中的纤维反应生成稳定的海藻酸钙纤维。(b) D-葡萄糖被转化为D-阿洛糖。

**4. 结论**
在这篇综述中，我们讨论了微流控技术在糖苷合成方面的最新进展，重点关注固定化酶、固定化底物和固定化微生物。微流控技术在糖苷生物合成中具有显著优势，包括对反应条件的精确控制[81]、[82]、[83]、增强反应物的混合和质量传递[84]、减少底物抑制、提高效率以及便于批次生产[85]。需要注意的是，微流控技术也存在一些局限性，如设备繁琐、操作复杂以及适用范围有限。为应对这些挑战，近年来微流控技术本身一直在不断进化，一系列旨在提高可用性、通用性和实际应用性的策略已在实验层面得到验证。在设备集成和操作简化方面，数字微流控（DMF）等方法通过紧密集成驱动、控制和检测模块，显著提升了便携性和自动化程度。Wu等人报道了在DMF平台上全自动合成十一种人乳寡糖的成功案例，实现了从反应到纯化的完全自动化工作流程[86]。更先进的发展包括基于刺激响应材料（例如pH响应系统）的双室微流控反应器，能够根据反应进程自我调节酶级联反应，从而减少外部干预的需求[87]。然而，微流控技术在碳水化合物合成中的大多数成功应用仍集中在单糖和寡糖（如HMOs）上。最先进的DMF和基于液滴的平台通过精确的控制和集成纯化及分析，展示了在短链糖苷合成中的高度自动化、模块化和高产量的优势。相比之下，利用微流控系统直接从头合成结构明确的、高聚合度的多糖仍处于早期探索阶段。这一差距源于几个根本性挑战：所需的高效率糖基转移酶的可用性和长期稳定性有限；聚合物生长过程中粘度增加导致严重的质量传递和混合问题；以及缺乏适合实时原位监测聚合物长度、分支和分散性的分析工具。这些限制目前制约了微流控平台实现多糖合成闭环控制的能力。

在提高通用性方面，模块化设计和多功能集成已成为关键策略。例如，研究展示了使用能够捕获来自不同来源的细胞外囊泡的通用接口，结合并行反应室，在单一平台上实现多样化的糖基工程[88]。此外，适用于超高通量筛选的微流控解决方案正在成熟，如与商用流式细胞术兼容的多系统，这大大扩展了微流控技术在催化剂筛选和功能评估领域的应用范围。尽管取得了这些进展，但微流控技术在碳水化合物合成从实验室验证到工业化应用的成功转型仍面临巨大挑战。实验室开发通常侧重于快速原型设计和功能验证，常使用聚二甲基硅氧烷等弹性材料，而工业生产则需要基于热塑性材料的低成本、高一致性制造，这往往需要对材料和工艺进行系统性重新设计。此外，通量限制也是一个关键瓶颈：单个微通道的产出较低，需要高度并行的芯片架构来实现实际的生产效率，这又引入了与流体分布、系统集成和长期运行稳定性相关的重大工程挑战。同时，微流控领域尚未形成成熟的标准化供应链和工业生态系统，这进一步提高了技术实施的难度。

因此，未来的研究应更多地关注提升微流控系统的实用性和通用性。一方面，需要深入整合智能控制策略，结合数据驱动的方法与实时传感来实现反应条件的自适应调节，而不是依赖预定义的参数。这样的发展有望提高复杂生物合成过程中的系统稳健性，并扩大兼容应用的范围。另一方面，需要继续努力通过简化设备架构、低成本制造策略以及更紧密地整合流体操控和检测组件来降低系统复杂性及成本。同时，推进微流控功能模块接口和生物相容材料系统的标准化将对于实现模块化设计和系统互操作性至关重要。这些努力将降低技术障碍，促进微流控技术在碳水化合物合成及相关生物制造应用中的更广泛采用。总之，液滴微流控技术在生物合成方面展现出巨大潜力，并有望通过持续创新和解决当前限制来推动糖合成研究和工业应用的发展。

**CRediT作者贡献声明**
Jie Zheng：写作 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取
Xing Zhang：写作 – 审稿与编辑、资金获取
Junhua Tao：可视化
Muhammad Sohail：写作 – 审稿与编辑
Yingchen Wang：写作 – 初始草稿、可视化
Anqi Tong：写作 – 初始草稿、可视化