一种基于杨树不定芽形成的新型、无需组织培养的多倍体化方法

《Industrial Crops and Products》：A novel and tissue-culture-free polyploidization method based on adventitious bud formation of Populus

　　王学芳|李静|张瑶云|任宇欣|崔成成|王军
中国北京林业大学林木遗传与育种国家重点实验室，北京100083

**摘要**
多倍体育种是开发新品种和推动森林种质创新的重要方法之一。现有的体细胞染色体加倍方法严重依赖于组织培养的无丝分裂特性以及基因型特异性再生系统的建立。因此，需要开发一种新型、高效、无需组织培养且适用于多基因型的多倍体诱导方法。本研究以一年生杂交杨树‘Huilin88’的插条作为植物材料，将‘Huilin88’插条切面上的愈伤组织发育和不定芽形成整个过程分为五个阶段。当愈伤组织切面的宽度在0.50–1.00毫米范围内、高度在0.30–0.70毫米范围内时，S期细胞的比例达到峰值。在此阶段用500毫克/升的秋水仙素处理愈伤组织24小时后，四倍体的诱导率最高，达到56.51%。一年生嫁接的四倍体幼苗表现出显著的茎干直径、叶片和气孔增大，表明其具有优异的生长潜力。秋水仙素处理期间，与染色体分离相关的基因（包括TBA、H2A.5和KIN-12F）的表达下调。转录因子NAC071、RITF1和ERF105可能在此过程中发挥关键调控作用。此外，五种二倍体材料及五种三倍体材料的四倍体诱导率分别为50.00%至72.73%和33.33%至61.11%。本研究首次基于多种杨树基因型的不定芽形成，创新了一种无需组织培养的多倍体诱导方法，为杨树的多倍体育种奠定了坚实的技术基础。

**1. 引言**
多倍体化是物种形成和进化的重要驱动力，因为多倍体植物具有更强的生长能力和抗逆性（Li等人，2024；Rice等人，2019）。研究表明，多倍体化还能增加某些植物（如大豆和Erysimum cheiri）的组织和细胞大小以及植物化学成分（Fakhrzad和Jowkar，2023；Zhai等人，2025）。近年来，多倍体育种在森林种质创新和新品种培育中发挥了重要作用（R?bild等人，2024）。在Eucalyptus urophylla中，三倍体在株高、茎干直径、叶面积和光合参数等关键性状上优于二倍体（Yang等人，2018）。同样，在Annona cherimola × A. squamosa的杂交后代中，三倍体和四倍体的导管宽度是二倍体的1.5倍（Losada等人，2023）。在中国杨树中，由(Populus tomentosa × P. bolleana)和(P. alba × P. glandulosa)杂交育成的三倍体品种‘Beilinxiongzhu 1’和‘Beilinxiongzhu 2’不仅生长迅速，树形优良，而且不产生葇荑花序（Kang等人，2000）。这些品种在中国多个地区的城市和农村绿化项目中得到广泛应用。
体细胞染色体加倍是多倍体育种的基本技术，通常应用于植物种子、顶芽和愈伤组织（Dhooghe等人，2011）。特别是利用秋水仙素诱导的不定芽染色体加倍方法因适用材料广泛且适用于多种植物而受到广泛研究。Lin等人（2023）和Jiang等人（2025）分别通过叶外植体的不定芽秋水仙素处理，获得了最高的四倍体诱导率（Broussonetia papyrifera为18.70%，Acacia melanoxylon为12.26%）。然而，现有的不定芽染色体加倍方法依赖于组织培养的无丝分裂特性和基因型特异性再生系统的建立（Long等人，2022）。因此，需要开发一种新型的、无需组织培养的多倍体诱导方法，以实现高效、便捷地适用于多种基因型。

杨树作为森林模型物种受到广泛研究，因其生长速度快、易于克隆繁殖且基因组规模较小（Han等人，2026；Lin等人，2018；Sun等人，2025）。与二倍体对照相比，杨树的多倍体具有更强的抗逆性（Liu等人，2025），是培育耐逆品种的关键种质资源，适用于三北防护林工程。这些多倍体也是研究性状形成的分子和表观遗传机制的理想材料（Chen等人，2025；Qin等人，2024；Xia等人，2024）。因此，本研究利用一年生杂交杨树‘Huilin88’的插条，研究了愈伤组织发育和不定芽形成过程中的各个阶段，确定了秋水仙素诱导不定芽染色体加倍的最佳参数，并验证了该方法在多种杨树基因型中的适用性。这项研究为杨树的多倍体育种提供了关键技术支持。

**2. 材料与方法**
**2.1. 植物材料及培养条件**
‘Huilin88’是P. simonii与P. cathayana的天然杂交种，具有快速生长和优异的抗逆性，在中国内蒙古自治区被评为优良品种（Wang等人，2016）。2024年休眠期从通辽林业草原科学研究院实验研究中心采集了一年生‘Huilin88’的插条，用保鲜膜包裹后储存在-5°C环境中。使用修枝剪剪取长度为10–15厘米的插条，先用75%乙醇进行表面消毒，随后浸泡在1%（体积比）NaClO溶液中5–8分钟，并用 autoclaved水冲洗三次。每个插条种植在装有3:1:1（体积比）泥炭土、珍珠岩和蛭石混合物的10厘米×15厘米透明塑料杯中。所有材料在25±2°C的人工气候箱（RXZ-436，江南仪器）中培养。

为了验证本研究提出的染色体加倍方法的多基因型适用性，选择了十种杨树基因型的一年生插条，包括四个二倍体品种和一个优良品系：P. deltoides × P. cathayana ‘Zhongheifang 17’（ZHF17）、(P. simonii × P. nigra) × (P. nigra × P. simonii) ‘Heilin 2’（HL2）、P. simonii × P. euphratica ‘Liaohu2’（LH2）、P. × popularis（QZY）和P. simonii ‘Jinzhong 2’（JZ2）。此外，还包括五种三倍体基因型（Tri-805、Tri-725、Tri-170、Tri-703和Tri-879），它们是通过将P. pseudo-simonii × P. nigra ‘Zheyin3#’的2n雌配子与P. × beijingensis的正常花粉杂交获得的（Wang等人，2010）。预处理步骤和培养条件与‘Huilin88’相同。

**2.2. 形态学和组织学鉴定**
从愈伤组织增殖到不定芽形成的整个过程中，使用数码相机测量三个生物学重复组的愈伤组织切面的宽度和高度。从切面上切除愈伤组织后，将其固定在Formalin-Aceto-Alcohol（FAA）固定剂[70%乙醇、38%甲醛和乙酸，18:1:1（体积比）]中24小时。随后通过梯度乙醇系列（70%、80%、90%、100%）脱水，再用乙醇-二甲苯混合物[1:1（体积比）和纯二甲苯清洗，最后用二甲苯-石蜡混合物[1:1（体积比）渗透，放入60°C的纯石蜡中。最后将样本嵌入石蜡块，使用German Leica RM2016切片机切片至8微米厚度。使用1%番红花红O（水溶液）和0.5% fast green FCF（95%乙醇溶液）进行切片染色，并在OlympusBX51光学显微镜下观察愈伤组织发育和不定芽形成过程中的组织学变化。通过YF? Click-iT EdU Universal Cell Proliferation Test Kit（BN16043，Biorigin Biotech，中国）进行细胞增殖检测，利用荧光显微镜（BX53，Olympus，日本）可视化并记录结果。根据形态和解剖学特征对整个过程进行分期。

**2.3. 不定芽的染色体加倍和倍性鉴定**
为了诱导不定芽的染色体加倍，将不同阶段的愈伤组织包裹在浸有不同浓度秋水仙素的棉球中（0、100、300、500、700、1000毫克/升），并在黑暗环境中放置24小时。之后用autoclaved水彻底清洗以去除残留的诱变剂。未经处理的插条（CK）与秋水仙素处理的插条同时置于16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下培养。每个处理包含三个生物学重复组，每个重复组有三根插条。培养30天后，当这些不定芽的主茎长度超过0.5厘米时，统计不定芽总数和每个切片上的不定芽数量。

对于每个符合标准的不定芽，随机选取三片叶子，加入改良的Galbraith缓冲液[45 mM MgCl2、20 mM 3-(N-morpholin)propanesulfonic acid（MOPS）、30 mM citrate、0.5% Triton X-100，pH 7.0]中共同捣碎。核悬液通过40微米尼龙网过滤后，与5微克/毫升的4,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）混合（Zhang等人，2024）。使用Ploidy Analyzer（CyFlow Cube 6，Sysmex，日本）进行倍性分析。此外，根据Kang（1996）的方法，收集疑似四倍体不定芽的顶端，先用饱和1,4-二氯苯溶液处理3–5小时，再进行0.075 M KCl溶液的预渗透处理0.5小时。然后用双蒸水彻底冲洗顶端，然后将其转移到含有2.5% Cellulase和2.5% Pectinase的酶混合物中处理3小时。酶解后，用双蒸水进行后渗透处理10–30分钟。将材料悬浮在Carnoy固定剂[乙醇:乙酸，3:1（体积比）]中，将细胞悬液滴在载玻片上。在酒精灯上短暂加热后，空气干燥并用20倍稀释的Giemsa溶液（pH 6.8）染色。在显微镜（BX51，Olympus，日本）下观察中期细胞，每个样本至少检查20个中期细胞，确定四倍体的总数和每个切片上的四倍体数量，以及杂倍体的总数和诱导率。

**2.4. 四倍体和二倍体后代的克隆繁殖及表型鉴定**
当不定芽长到15厘米高时，将获得的四倍体和二倍体后代移栽到室外。所有材料在休眠期进行修剪，然后嫁接在二倍体‘Huilin 88’的砧木上进行克隆繁殖。五个月后，测量存活的嫁接二倍体和四倍体植物（每种倍性至少三株）的高度，以及嫁接部位以上5厘米处的茎干直径。使用手持式激光叶面积仪（CI-203，CID Bio-Science，美国）测量这些植物第五片叶子的长度、宽度和面积。然后用游标卡尺测量叶厚，并使用数码相机拍摄图像。为了研究气孔特征，选择每个倍性水平上三株生长均匀的植物，使用指甲油压印技术提取第五片叶子的气孔。在光学显微镜下拍摄二十个随机视野，使用StoManager1 v1.0.0软件测量气孔的长度、宽度和面积。

**2.5. RNA制备、测序及差异基因表达分析**
在三种条件下从愈伤组织中提取总RNA：水处理（0毫克/升秋水仙素）24小时（Wat-24h）、500毫克/升秋水仙素处理24小时（Col-24h）和CK组，使用RNAprep Pure Plant Kit（DP432，Tiangen Biotech，中国）。每个样本包含三个生物学重复组。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Fisher Scientific，美国）检测RNA的质量和浓度。使用DNBSEQ T7平台进行测序，生成配对末端读段。使用HISAT2 v2.2.1软件（Kim等人，2019）将清洁读段与P. trichocarpa v4.1的基因组对齐，去除含有接头和低质量信息的读段及低质量读段。然后使用Samtools v1.21软件进行排序和索引（Li等人，2009）。根据每百万转录本的片段数（FPKM）计算基因表达水平。使用R包DESeq2 v1.38.3（Love等人，2014）进行差异基因表达分析，识别|log2Fold Change| > 1且假发现率（FDR）< 0.05的差异表达基因（DEGs）。为了研究差异表达基因（DEGs）的生物学意义，使用了R包clusterProfiler v4.6.2（Yu等人，2012年）进行了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，校正后的p值小于0.05。2.6. 通过定量实时PCR进行验证：CK、Wat-24h和Col-24h的cDNA是使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆转录试剂盒（R223–01，Vazyme Biotech，中国）合成的。定量实时PCR（RT-qPCR）在20 μL的反应液中进行，其中包含1 μL的正向和反向引物、3 μL的ddH2O、5 μL的cDNA和10 μL的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711–02，Vazyme Biotech，中国）。扩增在实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems? QuantStudio? 6 Flex，Thermo Fisher Scientific，美国）上完成，方案如下：95°C加热2分钟，然后是40个循环，每个循环95°C 15秒、55°C 30秒和72°C 10秒，最后是默认的熔解曲线阶段。选择P. tomentosa的PtActin基因（登录号：EF418792.1）作为参考基因。目标基因的相对表达水平使用2-ΔΔCt方法计算（Livak和Schmittgen，2001年）。所有引物序列列在补充表S1.2.7中。3. 数据分析：四倍体和混倍体的诱导率通过单向方差分析（ANOVA）进行。当ANOVA显示显著差异（p < 0.05）时，应用Duncan多重范围的检验进行事后比较。由于不同发育阶段的愈伤组织的高度和宽度数据不满足正态性和同方差性的假设，因此使用Kruskal-Wallis H检验来评估差异的显著性（p < 0.05）。四倍体和二倍体之间的表型差异通过Student’s t检验分析（p < 0.05）。所有百分比数据在分析前都进行了反正弦转换，所有统计计算在R v4.5.2环境中完成。调控网络和工作流程图分别使用Cytoscape v3.10.0和Adobe Illustrator 2025软件可视化。3. 结果：3.1. ‘Huilin88’插条横截面上的愈伤组织发育和不定芽形成：根据愈伤组织的形态和组织学特征，将‘Huilin88’插条横截面上的愈伤组织发育和不定芽形成的整个过程分为五个阶段（图1）。在第一阶段（阶段1），切割面保持新鲜，没有可见的愈伤组织增殖（图1A）。在第二阶段（阶段2），韧皮部逐渐变成棕色并产生宽度为0.72 ± 0.17毫米（范围从0.50毫米到1.00毫米）和高度为0.50 ± 0.13毫米（范围从0.30毫米到0.70毫米）的愈伤组织（图1B）。愈伤细胞排列松散，没有明显的暗区（图1G）。在第三阶段（阶段3），愈伤组织变得半透明并继续增殖（图1C），尺寸达到宽度2.47 ± 0.17毫米和高度1.71 ± 0.10毫米（图1P–Q），这明显大于阶段2。内部出现了更暗的颜色区域，表明形成了一些分生组织细胞簇（图1H）。在第四阶段（阶段4），愈伤组织的颜色从半透明变为不透明的黄白色，与阶段3相比大小没有显著变化。黄绿色的芽原基逐渐出现（图1D）。到第五阶段（阶段5），不定芽从愈伤组织中分化出来（图1E）。下载：下载高分辨率图像（794KB）下载：下载全尺寸图像。图1. ‘Huilin88’插条横截面上的愈伤组织发育和不定芽形成整个过程中的形态和组织学特征。（A–O）不同阶段愈伤组织发育和不定芽形成过程中的形态变化（A–E）、组织学切片（F–J）以及5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记结果（K–O）。（P–Q）各阶段愈伤组织宽度和高度的统计分析。（H）中的箭头指向分生组织细胞簇。（P–Q）中的不同字母表示使用Kruskal-Wallis H检验在不同发育阶段的愈伤组织宽度或高度存在显著差异（p < 0.05）。数据为平均值±标准差。刻度尺：0.5厘米（A–E），50微米（F–J），25微米（K–O）。EdU荧光检测显示，在阶段1时，绿色荧光主要局限于形成层内（图1K）。在阶段2，愈伤组织表面和内部都观察到了强烈的荧光（图1L），反映出该阶段S期细胞比例高且愈伤组织增殖活跃。在阶段3，荧光强度减弱，表明S期细胞数量减少，信号主要集中在愈伤组织表面（图1M）。到阶段4，荧光显著减少，只有分散的S期细胞在愈伤组织上和内部可以检测到（图1N）。在最后阶段（阶段5），荧光重新出现，并在愈伤组织表面和正在发育的不定芽基部聚集（图1O）。3.2. 四倍体‘Huilin88’的诱导：为了确定染色体加倍的最佳时期，将阶段2至阶段5的愈伤组织用500毫克/升的秋水仙碱处理24小时。结果显示，基于阶段2和阶段3的处理分别诱导出了69个和70个四倍体，诱导率分别为56.51 ± 3.26%和30.81 ± 1.49%（表1）。相比之下，在阶段4或阶段5应用秋水仙碱处理时没有得到四倍体。值得注意的是，尽管在阶段3通过秋水仙碱处理产生了更多的不定芽（225个个体）和四倍体，但这种情况下获得的混倍体比例极高（135个个体，58.52 ± 4.67%），不能忽略。因此，我们得出结论，阶段2是这种方法诱导染色体加倍的最佳时期。表1. ‘Huilin88’插条横截面上的不定芽在不同发育阶段的染色体加倍情况。发育阶段 总不定芽数 总四倍体数 每个横截面的不定芽数 每个横截面的四倍体数 四倍体的诱导率（%） 混倍体总数 混倍体的诱导率（%）阶段2 123 69 13.67 ± 1.62 7.67 ± 1.04 56.51 ± 3.26 a阶段3 22 57 25.00 ± 2.73 7.78 ± 0.98 30.81 ± 1.49 b阶段4 11 10 12.33 ± 0.76 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 c阶段5 25 10 27.89 ± 0.84 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 c5 9 23.10 ± 3.91 b同一列中下标不同的字母表示使用Duncan多重范围检验在不同阶段秋水仙碱处理下诱导率存在显著差异（p < 0.05）。数据为平均值±标准误差。基于上述结果，将阶段2的愈伤组织用不同浓度的秋水仙碱处理24小时以确定最佳处理浓度（表2）。倍性检测和染色体计数确认共有227个多倍体为四倍体（图2A–D）。在500毫克/升的秋水仙碱浓度下产生了最多的四倍体（69个），平均每个横截面7.67 ± 1.04个四倍体（表2）。随着秋水仙碱浓度的增加，再生的不定芽总数减少，反映了较高秋水仙碱浓度的强烈毒性作用。然而，在最佳处理下的横截面上的不定芽生长旺盛（图2E）。在不同浓度梯度下，混倍体的诱导率从18.58 ± 4.63%到35.24 ± 3.81%不等，最低诱导率出现在500毫克/升的秋水仙碱浓度下（表2）。总之，最佳秋水仙碱浓度确定为500毫克/升。用该浓度处理宽度在0.50毫米到1.00毫米、高度在0.30毫米到0.70毫米范围内的愈伤组织24小时，产生了最有效的染色体加倍效果。表2. 不同浓度的秋水仙碱对‘Huilin88’插条横截面上的不定芽染色体加倍的影响。秋水仙碱浓度（毫克/升） 总不定芽数 总四倍体数 每个横截面的不定芽数 每个横截面的四倍体数 四倍体的诱导率（%） 混倍体总数 混倍体的诱导率（%）0 23 40 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 e0 0.00 ± 0.00 c10 22 0 27 24.44 ± 0.60 3.00 ± 0.24 12.25 ± 0.91 d5 8 26.34 ± 3.20 ab3 0 16 24 118.00 ± 1.42 4.56 ± 0.38 25.78 ± 1.92 c4 0 24.85 ± 5.04 ab5 0 123 69 13.67 ± 1.62 7.67 ± 1.04 56.51 ± 3.26 a2 3 18.58 ± 4.63 b7 00 122 521 3.56 ± 0.84 5.79 ± 0.43 42.29 ± 1.26 b2 4 19.87 ± 2.88 b10 0 89 389.89 ± 0.79 4.22 ± 0.52 41.69 ± 2.30 b3 23 5.24 ± 3.81 a同一列中下标不同的字母表示使用Duncan多重范围检验在不同阶段秋水仙碱处理下诱导率存在显著差异（p < 0.05）。数据为平均值±标准误差。下载：下载高分辨率图像（607KB）下载：下载全尺寸图像。图2. 经秋水仙碱处理的‘Huilin88’插条横截面上的不定芽的倍性鉴定和生长情况。（A–B）通过流式细胞术显示的二倍体（A）和四倍体（B）不定芽的倍性水平峰值图。（C–D）二倍体（C）和四倍体（D）不定芽的染色体计数。刻度尺：5微米。（E）秋水仙碱处理后7天、14天和50天的不定芽生长情况示例。刻度尺：1厘米。3.3. 四倍体‘Huilin88’的表型变异：二倍体‘Huilin88’和四倍体‘Huilin88’之间的比较表型分析显示，除了植株高度外，几乎所有测量的性状都有高度显著的差异。具体来说，四倍体的茎直径（19.89 ± 1.76毫米）、叶长（10.27 ± 0.57厘米）、叶宽（12.20 ± 1.16厘米）和叶面积（88.29 ± 8.11厘米2）分别增加了1.36倍、1.48倍和1.78倍（图3A–B，E–H）。四倍体的叶柄长度（5.82 ± 0.84厘米）也显著长于二倍体（图3I）。此外，四倍体的气孔尺寸显著增大，长度（26.79 ± 2.89微米）、宽度（17.79 ± 1.40微米）和面积（392.21 ± 65.53平方微米）分别达到二倍体的1.34倍、1.47倍和1.83倍（图3C–D，J–L）。相比之下，四倍体的气孔密度显著降低，仅为二倍体的64.97%（图3M）。这些发现表明，通过这种新的多倍体诱导方法产生的四倍体具有更强的生物量和更好的生长潜力。下载：下载高分辨率图像（619KB）下载：下载全尺寸图像。图3. 二倍体‘Huilin88’和四倍体‘Huilin88’之间的表型差异。（A–B）二倍体（A）和四倍体（B）的代表性叶片形态。（C–D）二倍体（C）和四倍体（D）的气孔形态。刻度尺：3厘米（A–B），20微米（C–D）。（E）二倍体和四倍体之间的植株高度和茎直径差异。（F–M）二倍体和四倍体的叶片（F–I）和气孔（J–M）性状比较。数据为平均值±标准差。**表示p < 0.01时的显著差异；ns表示无关（Student’s t检验）。3.4. 秋水仙碱处理对基因表达的影响：通过RNA-seq分析了秋水仙碱诱导的‘Huilin88’插条不定芽染色体加倍的基因表达反应。Venn图显示Col-24h和Wat-24h之间存在1305个差异表达基因，表明秋水仙碱处理触发了转录变化（图4A）。所有DEGs的富集分析显示，Wat-24h中的基因与微管活性高度相关（图S1）。进一步分析表明，在Col-24h中显著下调的DEGs在微管相关过程（GO:0007017）、微管结合（GO:0015631）、微管马达活性（GO:0003777）、基于微管的运动（GO:0007018）和微管结合（GO:0008017）中富集（图4C）。然而，在这些通路中，上调的DEGs没有显著富集（图4B），表明秋水仙碱处理主要抑制了微管相关基因的表达。下载：下载高分辨率图像（611KB）下载：下载全尺寸图像。图4. 秋水仙碱诱导的染色体加倍期间不定芽的转录组分析。（A）未处理（CK）、水处理24小时（Wat-24h）和秋水仙碱处理24小时（Col-24h）样本之间差异表达基因（DEGs）的Venn图。（B–C）Col-24h和Wat-24h之间上调（B）和下调（C）DEGs的基因本体论富集分析。（D）以染色体分离相关基因为中心的转录因子（TF）-基因调控网络。中心的橙色圆形节点代表与染色体分离相关的DEGs，周围的梯度着色节点代表其他功能基因，最外层的紫色六边形节点代表关键转录因子。（E）关键转录因子和染色体分离相关基因之间预测的调控相互作用。最外层的紫色六边形节点和内部的橙色圆形节点分别代表关键转录因子和目标基因。实线表示预测的调控关系，虚线表示潜在的相互作用。（F）通过RT-qPCR验证RNA-seq鉴定出的六个枢纽基因的表达水平。为了进一步阐明秋水仙碱诱导的插条横截面不定芽染色体加倍的基因表达反应，构建了一个转录因子（TF）-基因调控网络（图4D）。在这个网络中，如NAC071、RITF1和ERF105这样的转录因子在编码参与染色体分离的蛋白质的基因中起主要调控作用，例如微管α链（TBA）、组蛋白H3.1（H3.1）、动蛋白样蛋白KIN-12F（KIN-12F）和组蛋白H2AX（H2AX）。转录结合元件预测显示，组蛋白H4变体TH011（TH011）和组蛋白H2A.5（H2A.5）是NAC071的潜在靶标，而ERF105可能靶定KIN-12F和组蛋白H2B.3（H2B.3）（图4E）。值得注意的是，NAC071也被预测靶向LOB，这是LBD转录因子家族的成员，表明这些因子在秋水仙碱诱导的染色体加倍过程中可能存在调控相互作用。RT-qPCR验证确认了六个核心基因的表达模式与RNA-seq数据一致（图4F）。3.5.多倍体诱导在多个杨树基因型中的应用
为了验证该方法在杨树多个基因型中的适用性，选择了五个二倍体种质资源和五个三倍体基因型进行多倍体诱导。平均四倍体诱导率为60.55%，其中ZHF17的诱导率最高，达到72.73%；其次是HL2（70.00%）、LH2（60.00%）、JZ2（50.00%）和QZY（50.00%）（图5A–B，F）。六倍体的诱导率在33.33%到61.11%之间，其中Tri-805的诱导率最高（图5D–F）。此外，流式细胞术分析确认从HL2中成功诱导出了两个八倍体个体（图5C），这突显了该方法在杨树多倍体育种中的有效性和广泛适用性。
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图5. 秋水仙素处理对多个杨树基因型染色体倍增的影响。(A–E) 原始二倍体（A）和三倍体（D）以及通过染色体倍增获得的四倍体（B）、八倍体（C）和六倍体（E）的倍性检测。(F) 该方法在十个杨树基因型中的诱导效果。四倍体的诱导率以紫色背景显示，六倍体的诱导率以黄色背景显示。

4. 讨论
多倍体育种是杨树遗传改良的必要途径。无性多倍体化已成为多倍体育种的主要策略之一，因为它具有技术简单性和可控性。先前研究中报道的多倍体诱导率范围为16.89%到37.03%，这取决于组织培养的无菌要求（Liu等人，2018；Ren等人，2021）。最近，Ling等人（2025）开发了一种优化后的‘84K’杨树（P. alba × P. glandulosa）体外四倍体诱导方法，通过同步处理实现了40.90%的诱导率。在本研究中，提出了一种基于杨树不定芽形成的高效多倍体诱导新方法（图6），该方法在适宜的发育阶段将500 mg/L的秋水仙素应用于愈伤组织24小时，显著提高了四倍体诱导率（50.00–72.73%）和六倍体诱导率（33.33–61.11%），并且适用于多种杨树基因型。值得注意的是，诱导产生的多倍体不定芽生长迅速，在不到60天内即可达到图2E所示的状态。这些不定芽足够健壮，可以直接移植到大盆中进行温室管理，从而绕过了通常需要组织培养幼苗的适应期。
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图6. 秋水仙素诱导杨树插条切片上不定芽染色体倍增的工作流程。

一般来说，完整的细胞周期包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有丝分裂期（M期）。用有丝分裂抑制剂处理S期细胞可以将其停滞在中期，从而有效诱导染色体倍增（Dhooghe等人，2011）。EdU（胸苷类似物）被广泛用于检测S期细胞（Liu等人，2020；Salic和Mitchison，2008）。在本研究中，确定愈伤组织中EdU荧光最强的第2阶段为最佳秋水仙素处理时期。这种方法与以往依赖插条预培养时间或结合石蜡切片和流式细胞术等技术的研究不同（Jiang等人，2025；Xu等人，2018）。通过形态学和组织学观察精确确定了最佳秋水仙素处理时期。具体而言，秋水仙素的诱导效率在愈伤组织宽度为0.50–1.00 mm（平均0.72 ± 0.17 mm）和高度为0.30–0.70 mm（平均0.50 ± 0.13 mm）时达到峰值。在此发育阶段，愈伤组织中的S期细胞比例达到最高。未观察到明显的分生组织簇，这与以往研究结果一致（Xu等人，2018）。然而，本研究中获得的四倍体诱导率（56.51%）显著高于Xu等人（2018）的结果（7.9%–13.2%），进一步证明了该方法相对于传统方法的优势。此外，不同杨树基因型所需的插条预培养时间不同，通常在7到14天之间。因此，精确识别这一发育阶段的愈伤组织形态对于高效多倍体化至关重要，尽管该方法减少了对无菌培养的依赖并降低了技术复杂性。

染色体分离是一个涉及多种蛋白质协同作用的过程，包括微管蛋白、驱动蛋白等。Uppuluri等人（1993）发现秋水仙素可以通过与β-微管蛋白N端16-kDa片段的残基1–46和C端35-kDa片段的残基214–241直接交联形成秋水仙素-微管蛋白复合物。这种相互作用抑制了微管聚合，并阻止了KINID1a和Kin7等驱动蛋白参与纺锤体组装和染色体分离（Hirokawa等人，2009；Nebenführ和Dixit，2018）。与这些机制一致，转录组分析显示秋水仙素处理下调了染色体分离相关基因（如TBA和KIN-12F）的表达（Moschou等人，2016；Wang等人，2022）。同时，许多编码组蛋白的DEGs（包括H2A.5、H3.1和H2AX）在秋水仙素处理后显著下调，可能是由于细胞周期停滞所致（Caperta等人，2006）。参与植物应激反应和发育的转录因子（如NAC071、ERF105和RITF1）也显著下调，可能是由于秋水仙素的细胞毒性（Kurimoto等人，2011）。值得注意的是，这些转录因子可能在秋水仙素诱导染色体倍增过程中发挥重要作用，其具体功能需要通过分子验证进一步研究。

此外，三倍体结合了杂种优势和基因组剂量稳定性，在生长和抗逆性方面表现出显著优势（Li等人，2024；Rice等人，2019）。然而，高倍体水平的植物常常出现基因表达不平衡和生理代谢紊乱等问题，导致生长劣势（Shi等人，2024；Wu等人，2024）。在本研究中，六倍体和八倍体表现出营养生长劣势，限制了其在培育优良品种方面的应用。六倍体的诱导率通常低于四倍体，与先前研究一致（Liu等人，2018；Zeng等人，2021），可能是因为未能在指定时间内达到倍性检测的高度阈值。尽管如此，六倍体仍然是研究等位基因剂量效应、表观遗传修饰和基因组进化的宝贵遗传材料（Chen等人，2025；Xu等人，2020），因此值得进一步研究关注。此外，本研究通过这种无需组织培养的方法从十个杨树基因型中获得了多种多倍体种质资源，包括五个二倍体种质（四个品种和一个种质）和五个三倍体基因型。继银杏（Nie等人，2025；?marda等人，2025）和油菜（?marda等人，2025）的成功案例之后，这些多倍体种质可以为未来的育种计划提供宝贵资源，以拓宽遗传基础并培育出具有优良性状的新杨树品种。

5. 结论
本研究提出了一种基于杨树不定芽形成的高效多倍体诱导新方法，无需组织培养。最佳诱导方案是在宽度为0.50–1.00 mm、高度为0.30–0.70 mm的插条切片上的愈伤组织中应用500 mg/L的秋水仙素处理24小时。获得的四倍体表现出出色的生长潜力。秋水仙素处理后染色体分离相关基因的表达受到抑制。使用这种方法，二倍体背景下的多倍体诱导率超过50.00%，三倍体背景下的诱导率为33.33%，并且育种周期也得到了缩短。本研究提出的染色体倍增方法代表了杨树多倍体育种的关键进展和技术支持。

**CRediT作者贡献声明**
Xuefang Wang：撰写原始草稿、可视化、验证、软件使用、资源准备、方法设计、实验研究、数据管理。
Yuxin Ren：资源准备、实验研究、数据管理。
Yaoyun Zhang：验证、软件使用、资源准备、实验研究。
Jing Li：资源准备、实验研究、数据管理。
Jun Wang：撰写评论与编辑、撰写原始草稿、可视化、监督、资源管理、项目协调、方法设计、资金获取、概念构建。
Chengcheng Cui：可视化、验证、资源准备。