《International Journal of Biological Macromolecules》：Friedelane-type oxidosqualene cyclases in friedelin production: Advances in biosynthesis, functional characterization, structure–function relationships, and engineering strategies
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Friedelin的生物合成依赖复杂的2,3-oxidosqualene cyclases（OSCs）催化机制，其结构多样性源于 carbocation 重排和酶特异性。近年通过多组学整合和冷冻电镜解析了OSCs的“cation shuttle-run”机制，并在酵母中成功重构了 friedelane 型生物合成途径。代谢工程、蛋白工程和亚细胞定位策略显著提升了异源生产效率，为可持续生产Friedelin及其衍生物（如抗炎的celastrol）奠定基础。未来需结合系统生物学和计算设计进一步优化生产体系。
吕云|刘春|邹雅|周璐|周燕|魏华|李秦川|谢芳清|龚淑坤|王继甸
四川大学华西医学院药学系，四川大学附属成都第二人民医院，成都第二人民医院，四川成都，610017，中国
摘要
弗里德林（Friedelin）是一种独特的弗里德兰型五环三萜类化合物，具有多种药理活性，是生物活性化合物（如抗肥胖剂卫矛醇）的关键生物合成前体。然而，由于其结构复杂性（由2,3-氧代角鲨烯环化酶（OSCs）催化的广泛碳正离子重排级联反应引起），以及其在植物中的低含量，使得其可持续生产面临重大挑战。多组学整合技术的进步促进了弗里德兰型OSCs的鉴定和表征，目前已鉴定出18种此类酶。包括首次通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）获得的植物OSC结构在内的关键结构研究，阐明了独特的“碳正离子穿梭运行”机制，为理解催化特异性和效率的结构-功能关系提供了宝贵见解。同时，合成生物学策略使得在工程化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中重建弗里德林的生物合成途径成为可能。本综述全面总结了研究进展，从弗里德兰型OSCs的功能表征和结构-功能关系，到综合生物技术策略的开发（包括代谢途径工程、蛋白质工程和亚细胞区室化），这些策略实现了弗里德林的高产从头合成。我们还讨论了探索OSCs多样性的未来前景，以及整合系统生物学、合成生物学和计算设计以实现弗里德林及其高价值衍生物的可持续生物制造，同时解决了工业应用中可能遇到的挑战。
引言
目前，从多种天然来源中已鉴定出超过30,000种三萜类化合物，占植物代谢产物的很大比例[1]。然而，三萜类化合物的显著结构多样性仅来源于约200种由2,3-氧代角鲨烯环化酶（OSCs）生成的核心骨架[2]。这些骨架的形成是三萜类化合物多样化的关键步骤；随后的广泛结构修饰（主要是通过细胞色素P450单加氧酶（CYP450s）的氧化和糖基转移酶（GTs）的糖基化）产生了大量的最终三萜类化合物[1][3]。五环和四环三萜类化合物占三萜类化合物的绝大多数。五环三萜类化合物主要包括弗里德兰型、橄榄烷型、乌尔萨烷型和狼烷型结构，而四环三萜类化合物主要由达玛兰型、环阿塔烷型、羊毛烷型、葫芦烷型和原萜烷型结构组成[4][5]。弗里德林及其衍生物（如卫矛醇、波普诺尼酸和威尔福里酸A[6]）属于弗里德兰型五环三萜类化合物，在自然界中作为植物的次级代谢产物广泛分布[7]。自1807年首次从树皮中分离出弗里德林以来[8]，随后在包括卫矛科（Celastraceae）、蔷薇科（Rosaceae）、豆科（Fabaceae）和杜鹃花科（Ericaceae）等多种植物中发现了它的存在[9][10][11]。此外，也有报道指出弗里德林存在于地衣[13]和藻类[14]等物种中。由于弗里德林具有广泛的生物活性（包括抗氧化[15]、抗炎[16]、抗癌[17]、抗菌[18]和抗糖尿病[19]作用），因此吸引了越来越多的研究兴趣。此外，由于其显著的抗虫生物活性和可能对土壤微生物群落动态的调节作用，弗里德林在农业中也发挥着重要作用[20][21]。
三萜类化合物主要通过甲羟戊酸途径（mevalonate pathway）进行生物合成[22]。特别是，OSCs作为关键酶，催化线性异戊二烯底物2,3-氧代角鲨烯环化为多种三萜类骨架，这一过程被认为是萜类代谢中最复杂和精确的酶促反应之一[23]。OSCs催化的多环化级联反应可以直接从碳正离子中间体的环化和重排生成四个到五个脂肪环和多达九个立体中心，这体现了自然界中酶选择性的最显著表现之一[23][24][25]。具体而言，弗里德兰型OSCs介导2,3-氧代角鲨烯环化为弗里德林，伴随着复杂的重排步骤和催化机制[7]。迄今为止，已有约200种OSCs被生化鉴定，包括β-阿米尔醇合成酶（β-amyrin synthases）、环阿塔烯醇合成酶（cycloartenol synthases）、卢佩醇合成酶（lupeol synthases）、多功能弗里德林合成酶（multifunctional friedelin synthases）和羊毛甾醇合成酶（lanosterol synthases）[26][27]。此外，OSCs的催化机制也引起了广泛的研究兴趣。定点突变和底物兼容性研究被认为是探索OSCs结构-功能关系的方法。研究表明，与Y118、Y410、M(W/L)C(Y/H)CR基序、DCTAE基序及其相邻位置、C末端和其他残基相关的特定氨基酸残基的变化可能导致酶功能或催化活性的改变[26]。此外，TwOSC（称为TwOSC1）的冷冻电子显微镜结构研究进一步加深了对弗里德兰型OSCs环化机制的理解[27]。然而，要完全阐明其完整的催化机制，仍需对其蛋白质结构和关键氨基酸残基进行进一步研究。
传统的弗里德林生产方法依赖于从源植物中提取[28]，这种方法效率低、处理时间长、能耗高，并且大规模生物质收割可能对生态环境造成损害，严重限制了其工业规模生产。相比之下，利用合成生物学生产天然产物越来越被视为一种有前景的替代方案，具有高产量、供应灵活、能耗低、环境友好和可持续性等显著优势[29]。因此，工程化微生物底盘细胞用于天然产物生物合成显示出巨大潜力，例如成功合成了高价值的生物活性化合物青蒿素[30]和紫杉醇[31][32]。酵母表达系统凭借其发达的内膜系统和内源性甲羟戊酸途径（MVA pathway），已成为萜类生物合成的首选宿主[33]。已成功应用多种策略构建工程化菌株，包括调节和优化底盘细胞的代谢途径[34]、通过蛋白质工程提高酶的特异性和催化活性[35]、通过亚细胞器官工程设计专门的代谢工程区室[36]，以及通过重新设计宿主细胞代谢来减轻代谢负担[37]。因此，构建能够高产弗里德林的工程化微生物底盘细胞可以实现其可持续生产，并为合成弗里德兰型三萜类衍生物（如卫矛醇）提供足够的前体。
本综述旨在重点介绍弗里德兰型OSCs催化功能的最新研究进展、它们在弗里德林生物合成中的作用，以及OSCs的结构-功能关系。此外，本文还总结了构建高效异源生产弗里德林的生物技术策略。
三萜类化合物生物合成途径
高等植物中的萜类化合物生物合成起源于细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径和质体中的2-C-甲基-?-赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径[38]。其中，三萜类化合物是通过MVA途径合成的异戊二烯类化合物，同时还有甾醇和倍半萜类化合物[23]。相比之下，MEP途径主要负责质体中单萜类和二萜类化合物的生物合成[39]。乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）是MVA途径的初始底物
弗里德兰型OSCs的表征及其功能
自1993年从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中首次分离并鉴定出第一种植物OSC（AtCAS1）以来[57]，目前已生化鉴定出200多种植物OSCs[26][27]（表1）。这些OSCs主要催化生成β-阿米尔醇（β-amyrin）、α-阿米尔醇（a-amyrin）、环阿塔烯醇（cycloartenol）、卢佩醇（lupeol）、弗里德林（friedelin）、葫芦二烯醇（cucurbitadienol）、 germanicol和塔拉克索醇（taraxerol）等化合物。通常，一个植物物种内存在多种OSC同源物，它们负责合成甾醇前体环阿塔烯醇和其他化合物
弗里德兰型OSCs的结构-功能关系
OSCs的催化过程非常复杂，在萜类合成酶中以其精确性和复杂性著称，这给人工反应设计带来了挑战[161]。该过程主要涉及四个关键阶段：(a)底物结合和构象预组织（折叠）；(b)通过环氧基团的质子化启动；(c)碳正离子中间体的环化和重排；(d)通过脱质子化或捕获水分子终止，从而产生多种三萜类骨架
用于高效生产弗里德林的酵母工程策略
植物来源的弗里德林产量低以及化学提取方法效率低下，促使人们开发了用于异源生产弗里德林的微生物细胞工厂。这种方法显示出高效、可持续性和大规模生产的明显优势，已被用于多种具有显著生物活性的化合物的生物合成[6][30][32]。由于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有内源性甲羟戊酸（MVA）途径
结论与未来展望
弗里德林是许多传统中药（TCMs）中的关键活性成分和生物合成前体，例如雷公藤（Tripterygium wilfordii）和五月茶（Maytenus ilicifolia），由于其多种药理活性而引起了广泛的研究兴趣[60]。植物化学、结构生物学和合成生物学的结合极大地推进了我们对其生物合成的理解，为这种宝贵天然产物的可持续生产奠定了基础。
CRediT作者贡献声明
吕云：撰写——原始草稿、研究、概念化。刘春：监督、资源提供、概念化。邹雅：资源提供、方法学设计、研究。周璐：资源提供、方法学设计、研究。周燕：可视化处理、研究、数据分析。魏华：可视化处理、研究、数据分析。李秦川：验证、监督。谢芳清：验证、监督。龚淑坤：撰写——审稿与编辑、资源提供、数据分析。王继甸：撰写——
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
本工作得到了四川省科技计划（项目编号2025ZNSFSC1127）的支持。
