利用膜（来自细胞外囊泡）辅助进行纳米粒子的微流控涂层技术

《ACS Applied Nano Materials》：Microfluidic-Assisted Coating of Nanoparticles by Membranes from Extracellular Vesicles

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基于胞外囊泡（EV）的纳米疗法由于具有靶向性，在癌症纳米医学中展示了广阔的应用前景。然而，在将纳米颗粒（NPs）与EV结合时仍存在两个主要问题：（1）源自癌症的EV因其致癌性质而带来的安全风险；（2）缺乏稳健、可重复且高效的NPs涂覆EV膜的方法。为了克服这些主要挑战，本研究采用微流控平台将先前从肺癌细胞中分离出的EV膜重新组装在荧光二氧化硅纳米颗粒（FSNs）上。这些FSNs利用了二氧化硅纳米颗粒的多功能表面修饰以及其固有的荧光特性，实现了对混合体的精确细胞内追踪，无需使用标记膜表面的荧光探针。在保留天然肺癌来源EV的肿瘤靶向性的同时，所提出的微流控方法提供了更好的处理和操控性，保证了：（1）均匀的EV状涂层（厚度为6.3纳米）；（2）高重现性（87.8%的NPs被成功涂覆）；（3）选择性的肿瘤靶向性（在4小时时，与HeLa细胞和成纤维细胞相比，对亲本A549肿瘤细胞的靶向效果分别增加了8.0倍和4.3倍）。该技术能够在连续过程中以高精度和稳定性制造仿生核心-壳结构，并且更易于扩大生产规模。

**引言**
纳米医学作为改善传统化疗选择性不足问题的有希望的替代方案，受到了广泛关注。传统化疗由于缺乏选择性导致治疗药物在肿瘤组织中的积聚不足，同时常常产生严重的副作用。为了解决这一问题，已有数百种癌症纳米药物被开发并进行了临床试验（截至2019年约有200种纳米药物进入临床试验阶段）。然而，大多数纳米药物都因与化疗相同的限制因素而失败：即无法选择性地将药物递送到肿瘤部位。当纳米颗粒通过系统给药时，它们可能通过被动方式（如增强渗透性和滞留效应）或主动靶向方式（如用抗体或肽修饰纳米颗粒）在肿瘤细胞中积累。然而，正如Wilhelm等人近十年前所证明的那样，无论采用何种靶向方法或纳米颗粒的性质，只有不到1%的剂量能够到达肿瘤，大部分纳米颗粒会因巨噬细胞的识别和摄取而沉积在非肿瘤组织（如肝脏和脾脏）中。

近年来，胞外囊泡（EVs）被认为是一种可以减少巨噬细胞摄取并提高肿瘤靶向性的方法。在我们实验室的早期研究中，我们已经证明，通过将纳米颗粒封装在肿瘤靶向EV中，其生物分布显著改善，从而规避了EPR效应的影响。然而，之前的研究要么采用内源性方法（孵育法），这种过程无法保证EV膜的均匀装载；要么采用基于CO还原法的原位组装方法，但该方法仅适用于贵金属纳米颗粒。如果能开发出一种通用方法，能够快速、可扩展且可重复地将任何纳米颗粒封装在EV膜中，将会非常理想。

EV在靶向方面的巨大潜力源于源自癌症的EV膜具有独特的特征，这些特征使其能够优先趋向于来源细胞。因此，使用由肿瘤细胞产生的EV似乎是实现纳米药物向癌细胞选择性递送的最佳途径，事实上，源自癌症的EV确实表现出对同类肿瘤细胞的特异性导向。然而，使用肿瘤EV作为递送载体存在一个重大限制：由于其生物活性成分，它们被发现是促进转移前微环境形成、血管生成和肿瘤进展的关键介质。为了解决这一问题，一些研究者提出仅使用EV膜而舍弃其内部成分。EV的靶向识别特性主要体现在膜上，其中蛋白质（四跨膜蛋白、整联蛋白、蛋白质糖基化模式等）和脂质特征对于靶细胞的识别和摄取至关重要。利用这些EV膜的分子模式同时去除其内部的肿瘤相关物质，对于安全、特异性的基于EV的疗法至关重要。已经研究了多种方法来清空肿瘤EV并收获其膜，随后将其与所需的治疗物质（如RNA、siRNA或纳米颗粒）结合，以创建完全人工的类似EV的载体，用于选择性递送到癌细胞。对于治疗性纳米颗粒，颗粒本身可以用作模板，其表面可以进行功能化处理以重构EV膜。

然而，将治疗性载体涂覆在EV上并保持与原始EV相似的功能性是非常具有挑战性的。主要问题之一是在载体（例如纳米颗粒）上再现膜蛋白的原始分布及其均匀性。此外，开发连续的涂覆过程也非常重要，因为这些过程更容易扩大生产规模。在这些人工载体得到广泛应用之前，需要先开发出可靠的大规模生产方法。

微流控技术能够精确控制纳米和微尺度流体，因此已被用于实现纳米材料的高效、均匀和可重复合成。这些微流控辅助的纳米颗粒合成涵盖了无机和有机纳米结构，包括贵金属纳米颗粒（如等离子体空心金纳米颗粒和金纳米棒）、金属氧化物纳米颗粒（如介孔二氧化硅纳米纤维、氧化铁和氧化铋纳米颗粒）、量子点、脂质体（尤其在药物递送方面具有重要应用）以及聚合物纳米颗粒（如PLGA）。在可扩展性方面，微流控技术可以通过多种方法克服这一挑战：通过增加通道的直径和长度、并行化微流控装置、优化微混合器几何结构等方式。微流控技术还提供了高 reproducibility 的纳米颗粒制造新方法；这种均匀性是通过精确控制微尺度现象实现的，无论是通过被动内部循环（如滴液法和分段法）、被动混合机制（如流体动力聚焦、微涡流和混沌对流），还是主动混合方法（如声学、电学、热学和压力混合）。微流控系统提供的卓越控制能力不仅适用于单相流体，还能促进不相溶液体的高效分散。例如，在需要使水相和有机相接触以促进胶束形成时，微流控系统是理想的选择。此外，微流控平台也成为控制组装核心-壳和混合纳米颗粒的强大工具。Liu等人的研究表明，使用微流控超声技术可以将纳米颗粒封装在天然EV或癌细胞膜中。他们将PLGA纳米颗粒与外泌体或癌细胞膜共同送入微流控系统，并施加高强度超声波（80 kHz频率、100 W功率），通过压应力使膜包裹在纳米颗粒表面。在我们的实验室中，我们利用微流控技术在指型微混合器中生成基于表面活性剂的囊泡（称为niosomes），实现了连续和可扩展的生产过程。这种剪切驱动的组装方法对于实现膜的均匀性、狭窄的尺寸分布和高重现性至关重要，克服了传统批次水化方法的局限性。我们假设这种高效的微混合足以实现EV膜在纳米颗粒上的均匀涂覆，而无需高强度超声波。

在这项研究中，我们改进了方法，使用微流控技术高效混合，将分离出的EV膜重新组装在二氧化硅纳米颗粒上，从而连续制备出具有高精度和稳定性的仿生混合结构。以往的研究已经成功地使用微流控技术制造了NP-EV混合物。Cardellini等人使用μSonicator将聚合物纳米颗粒封装在脂质体和完整的人类胚胎肾细胞来源的EV中。Pareja-Tello等人最近开发了一种微流控系统，将mRNA封装在间充质干细胞EV-脂质混合纳米颗粒中。此外，金属-有机框架（MOFs）、核心-壳二氧化硅-SPION结构或聚合物纳米颗粒也通过微流控技术进行了膜包覆。然而，这些现有的微流控方法通常使用完整的癌症来源EV，这可能会带来携带致癌物质的风险。在这里，我们通过有机相提取选择性分离EV膜，有效地将脂质双层与亲水性内含物分离。通过微混合器优化脂质相与水相纳米颗粒之间的界面组装，我们合成了具有高批次间重现性的生物混合体，显著减少了非特异性摄取，并提高了对特定（亲本）细胞系的肿瘤靶向性。

**材料与方法**
**荧光二氧化硅纳米颗粒的合成与功能化**
作为涂覆EV膜的模板，制备了荧光二氧化硅纳米颗粒（FSNs）。荧光核心便于监测纳米颗粒的内吞过程，其高对比度、均匀的粒径和良好的分散性有助于膜的容易识别和表征。含有荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC）的FSNs按照之前发表的略有修改的 protocol 合成（基于逆微乳液法控制纳米颗粒的单分散性和尺寸）；合成步骤见图S1。具体来说，将5.7毫克FITC异硫氰酸酯（溶于1毫升乙醇中）与73微升3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）混合，通过异硫氰酸酯基团（–N═C═S）与FITC和APTES的胺基团之间的偶联反应生成FITC-APTES结合物。该溶液在惰性氩气氛下25℃下搅拌12小时，随后加入7.7毫升环己烷、1.6毫升1-己醇、1.7毫升Triton X-100和0.34毫升Milli-Q H2O，继续搅拌15分钟。之后逐渐加入100微升FITC-APTES结合物，连续搅拌10分钟后，分10分钟加入100微升正硅酸四乙酯（TEOS）、100微升NH4OH和15微升3-(三羟基硅基)丙基甲基膦酸酯（THPMP）。最终溶液在25℃下搅拌24小时，然后加入25毫升EtOH:PrOH:MeOH:H2O（86:5:5:4）混合物，通过离心三次（10,000g，10分钟）洗涤合成后的FSNs，并储存在EtOH中直至使用。

为了使FSNs具有正电荷，从而便于负电荷膜片段的组装，按照已有方法将FSNs用APTES功能化。具体操作是将1毫克FSNs悬浮在1.5毫升甲苯中，然后与30微升APTES混合，80℃下搅拌12小时，再用EtOH洗涤以获得纯化的带正电荷的FSNs-APTES。同时，还制备了不含荧光团的二氧化硅纳米颗粒（SNs），用于流式细胞实验，分析在SN表面组装的EV相关膜标记物的表达。这些材料的合成由Aragón纳米科学与材料研究所（INMA）-萨拉戈萨大学（ICTS “NANBIOSIS” 的纳米颗粒合成单元完成。

**细胞培养条件与生物相容性测试**
A549细胞、HeLa细胞和成纤维细胞在含有1%青霉素/链霉素、1%两性霉素和10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。使用前每月检测培养物中的支原体。分离EV时，通过超速离心（100,000g，2小时，4℃）确保培养基中不含EV。使用Blue细胞活力检测试剂盒（Abnova，美国）评估FSNs和FSNs-APTES对A549细胞活力的影响。在评估过程中，将A549细胞以5 × 103个细胞/孔的浓度接种到96孔培养板中，每孔加入100微升上述培养基。在24小时的孵育后，培养基被更换为100 μL新制备的、富集了FSNs和FSNs-APTES的培养基（浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03和0.016 mg/mL），细胞继续培养24小时、48小时和72小时。在这些不同的时间点，细胞先用PBS清洗，然后按照制造商的说明，在调节过的培养基中加入10%（v/v）的试剂包试剂进行处理。最后，使用Biotek公司的Synergy HT平板读数器，在530/590 nm的激发/发射波长下评估荧光强度。

**EVs分离**
从细胞培养上清液通过连续的超速离心循环捕获并纯化EVs，离心条件为80%的细胞密度。具体步骤如下：首先，将细胞接种并在不含EVs的培养基中孵育48小时。之后，收集上清液并离心（2000g，20分钟，4°C）以去除细胞碎片和杂质。接着再次离心（10,000g，30分钟，4°C）以去除微囊泡，最后使用Beckman Coulter Optima XE-90超速离心机在100,000g，2小时，4°C的条件下分离EVs。分离得到的EVs沉淀物用PBS清洗以去除污染物。最终的A549来源的EVs（以下简称EVsA549）沉淀物被悬浮在PBS中，并通过Pierce蛋白BCA试剂（Thermo-Fisher Scientific，美国）测定其总蛋白含量。

**表征技术**
FSNs、FSNs-APTES和SNs通过透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析（NTA）和ζ电位进行表征。对于电子显微镜分析，使用的是FEI TECNAI T20仪器（Tecnai，荷兰埃因霍温），加速电压为200 kV，配备SuperTwin物镜，可实现2.4 ?的点对点分辨率。为了评估FSNs和FSNs-APTES的流体动力学直径，使用了Nanosight NS300（Malvern Panalytical）纳米粒子跟踪分析系统。合成材料的表面电荷通过动态光散射（DLS）在pH 7条件下测定其ζ电位，使用的是Brookhaven 90 Plus设备以及ZetaPals软件。此外，还使用Bruker Vertex 70仪器在600–4000 cm–1光谱范围内记录了衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱。EVsA549的形态、形状、尺寸和表面电荷通过TEM、NTA和ζ电位进行了表征。TEM分析中使用了3%磷酸钨（PTA）水溶液作为对比剂。EVs相关的生物标志物通过MACSPlex Exosome Kit（Miltenyi Biotec）流式细胞术按照制造商的说明进行检测。

**FSNs涂层方法：离散法 vs 微流控法**
图1示意了两种组装EVsA549衍生膜围绕NP核心的策略。
(a) 使用APTES功能化的二氧化硅纳米颗粒和从A549细胞培养中分离出的膜。
(b) 在批次处理中，膜先被干燥并沉积在接收表面上，然后与含有FSNs-APTES的溶液接触。接着膜重新水化并接受超声波处理以促进其在带正电的NP周围的自我组装。
(c) 在微流控过程中，使用微混合器在两种不相容流中提供多个紧密接触表面，其中一种流含有带正电的粒子，另一种流含有膜片段。
(d) 批次处理和微流控NP涂层过程都利用了相反电荷之间的静电力以及磷脂疏水链之间的疏水相互作用。

**高分辨率图像**
对于这两种策略，均采用了改进的Folch提取方法提取EVsA549衍生的膜。具体步骤为：首先将EVsA549悬浮在氯仿、甲醇和PBS的混合物中（CHCl3:CH3OH:PBS = 8:4:3, v/v/v），然后在室温下剧烈涡旋10分钟，随后以6000g离心10分钟。形成了一层由界面分隔的两相混合物，用玻璃吸管提取含有疏水EVs组分的有机相。在离散批次方法中，4 mg的EVsA549膜在氩气气氛下干燥以防止氧化，并储存在-20°C直到使用。通过直接加入2 mg的FSNs-APTES（0.5 mg/mL的水溶液），使膜在NP表面自发组装。最后，在超声波浴中超声处理10分钟以获得涂有FSNs的EVsA549（FSNs-EVsA549batch）。

**基于我们之前的工作**
我们在之前的研究中（46），利用不同的流动接头作为微混合器，在不相容流体微流中实现了高效混合。在这里，我们强调了控制流场分布对于促进纳米结构可重复组装的重要性。对于这种微流控组装，2 mg的FSNs-APTES重新悬浮在4 mL的Milli-Q水中并装入10 mL的注射器中。同时，4 mg的EVsA549衍生膜在8 mL的氯仿中装入另一个10 mL的注射器中，保持1:2（w/w）的FSNs-APTES:EVsA549比例。两种溶液分别以12 mL/min和24 mL/min的流速同时注入微混合器中。为了确保样品均匀性，初始输出被丢弃若干驻留时间（约5秒），直到达到稳态条件。在出口处立即发生相分离后，回收上层水相，其中含有微流控辅助涂层的FSNs（FSNs-EvsA549micro）。

**微流控组装过程**
在本研究中，我们使用了改进的1/16英寸PEEK T型接头（UPCHURCH，美国），在出口区域集成了一个平均孔径约为10 μm的微加工不锈钢配件。该元件有助于将进入的流体均匀分散到多个微通道中，从而显著增强界面剪切力，促进目标纳米结构的稳健自我组装。两种不相容流之间产生的剪切应力提供了足够的能量来触发组装过程，无需外部机械或超声波输入。多孔元件起到了被动混合器的作用，显著增加了流体层片的数量，从而提高了表面积与体积比，大大缩短了扩散路径长度，实现了微观尺度上的快速均匀混合。此外，孔的复杂几何形状诱导了混沌对流，加速了质量传递，并确保了膜与纳米颗粒之间更有效的相互作用。与传统T型接头相比，这种设计通过创建一个高度定义和分布均匀的接触界面，增强了表面相互作用和来自不相容相的结构控制组装。

**微尺度混合的效果**
微尺度混合最大化了界面表面积，同时最小化了扩散距离，显著增强了有机相和水相之间的质量传递。这促进了一个两阶段组装过程，该过程由不同的物理化学相互作用驱动。最初，带负电的磷脂头部与带正电的FSNs-APTES之间的静电吸引力使磷脂朝向硅核排列，吸引了完整的膜块和单个磷脂。随后，暴露的疏水脂质尾部之间的疏水相互作用驱动了更多未结合磷脂的聚集，完成了围绕NP核心的双层结构。

**EPSs的全面表征**
FSNs-EvsA549batch和FSNs-EvsA549micro均通过流式细胞术、NTA和ζ电位进行了彻底表征，如之前对天然EVsA549所述的那样。TEM分析提供了关于组装在NP表面的有机EVsA549膜厚度的详细信息。如之前所述，记录了FSNs-EvsA549的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。此外，利用超分辨率共聚焦显微镜（ZEISS Elyra 7-Lattice SIM (2)）确定了FSNs与FSNs-EvsA549的共定位。为此，直接利用FSNs的天然FITC荧光（λex = 495 nm）进行了可视化，而EVsA549衍生的膜则用PKH67染料（λex = 551 nm）进行了荧光标记。

**细胞内化和选择性评估**
通过共聚焦显微镜和流式细胞术评估了FSNs-EvsA549batch和FSNs-EvsA549micro的细胞内化和靶向选择性。对于共聚焦显微镜表征，A549、HeLa和成纤维细胞以5 × 10^4（成纤维细胞为3 × 10^4）的密度接种在10 mm盖玻片上，培养1天。然后加入相同浓度的FSNs、FSNs-EvsA549batch和FSNs-EvsA549micro（0.03 mg/mL），孵育4小时或24小时。最后，细胞用PBS清洗三次以去除未内化的载体，并用4%的甲醛固定，再用phalloidin染色以标记细胞质中的肌动蛋白（λex = 561 nm）。通过NPs的FITC荧光（λex = 488 nm）观察到细胞内的FSNs载体聚集体，细胞核则用ProLong Glass Antifade Mountant和NuncBlue（λex = 405 nm）染色。使用Zeiss LSM 880光谱共聚焦显微镜观察细胞。从Z-stack图像中半定量细胞质内的像素强度，以比较目标细胞和非目标细胞中的内化情况。

细胞内化FSNs、FSNs-EvsA549batch和FSNs-EvsA549micro的能力也通过流式细胞术进行了评估。简要来说，将2 × 10^5个A549细胞、2 × 10^5个HeLa细胞或1.2 × 10^5个成纤维细胞接种在6孔板上，24小时后与不同的载体（0.03 mg/mL）孵育4小时。之后，细胞用PBS收集并用Gallios Flow Cytometer（Beckman Coulter）进行流式细胞术分析。中位荧光强度用于评估NPs的内化情况。检测时使用激发波长488 nm。每个样本至少分析了10,000个事件。

**统计分析**
生物实验至少重复三次。所有数据以平均值±标准差表示。使用单因素或双因素方差分析（ANOVA）对平均值之间的显著差异进行统计分析，并通过Dunnett的多重比较检验（GraphPad Prism Software）进行多组比较。统计显著的差异表示为：*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001。两种光谱都显示了二氧化硅结构Si–O–Si（1050 cm–1）和Si–O（950 cm–1）的特征性指纹带，以及来自FITC-APTES染料共轭物的C–H（2950 cm–1）带。未经功能化的FSNs显示出更显著的Si–OH峰（800 cm–1），这归因于自由的硅醇（Si–OH）表面基团。对于FSNs-APTES，这些峰的强度减弱了，而检测到了锚定在纳米颗粒表面的APTES氨基团（1525 cm–1）和Si–C APTES键（700 cm–1）的带。FSNs-EVsA549batch和FSNs-EVsA549micro的组装：批处理与微流控技术在以往处理膜包覆纳米颗粒混合物的研究中，通常按照三个步骤进行组装：（1）从细胞（或在本研究中为从EVs）中分离膜；（2）干燥并分离膜；（3）使用直接接触方法、挤出过滤器或超声处理方法将膜组装到纳米颗粒上/周围。（48?51）在将EVsA549膜分离出来并组装到FITC-APTES表面之前，本研究通过物理化学和生物学技术对其进行了全面表征。通过一系列超速离心循环从培养上清液中分离出的EVsA549的TEM图像见图3a。许多图像中观察到了球形结构和特征性的磷脂膜（例如，参见图3a中的放大区域）。该双层膜的厚度测量为4.5 ± 1.0 nm（与之前报道的5 nm厚度一致。（52）根据NTA测量（图3b），平均粒径为178.7 ± 73.4 nm，与之前报道的这些癌EVs的数据相符。（45）测得的EVsA549表面电荷为?9.5 ± 1.5 mV（图3c），这归因于pH 7时EVs膜上存在的负电荷磷脂和蛋白质。（8）图3展示了EVsA549的表征：（a）从A549细胞培养上清液中分离出的EVs的代表性TEM图像。右侧的放大图显示了清晰的脂质膜厚度；（b）通过NTA获得的EVsA549的粒径分布（n = 5）；（c）这些EVs的ζ电位（pH 7）（n = 5）；（d）通过流式细胞术分析的EVs相关标记物（n = 3）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片流式细胞术用于评估EVs相关的表面标记物（图3d）。EVsA549富含四跨膜蛋白，如CD81、CD9和CD63（常被认为是常见的EV表面标记物）（53），这些标记物呈强阳性，而CD24、CD44和CD29也显示出强烈的信号。这些蛋白质也被报道为在EVs中检测到的主要标记物。（54）EV来源的膜主要由磷脂组成，它们的极性头部朝向水中的外部环境。这些极性头部含有带负电的磷酸基团。（55）此外，磷脂的功能基团（即EV膜的磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇）赋予整个膜整体负电荷。相比之下，FSNs-APTES在中性pH下被质子化，（56）从而获得正电荷。纳米颗粒与EV相关膜之间的ζ电位差异由于静电吸引作用引导膜围绕纳米颗粒核心的组装（如同天然EVs一样）。熵力也有利于这一过程，因为磷脂倾向于重新组织成稳定的双层结构，使其极性头部朝向纳米颗粒表面和水性外部介质，将疏水部分隐藏在双层内部。这种排列最小化了系统的自由能，产生了热力学上更有利的构象。（57,58）这种行为，加上表面电荷的吸引力，有助于它们在FSNs-APTES周围的自组装。在这项工作中，我们选择了来自A549细胞的EV膜，因为预计它们对这些癌细胞具有亲和力。（45）在FSNs合成和功能性化之后，根据Folch的方法（17）稍作修改，按照实验部分所述，分离出了EVsA549来源的膜。然后，这些膜通过两种不同的策略组装到FSNs-APTES表面，如图1所示。首先探索了批处理策略。在这种情况下，EV膜在玻璃小瓶表面干燥，然后通过薄膜水化制备FSNs-EVsA549batch。简而言之，将干燥后的EVsA549膜直接与含有FSNs-APTES纳米颗粒的水溶液接触，使其吸附在颗粒表面，最后混合物进行10分钟的超声处理（图1）。另一方面，也使用微混合器通过混合两种不相溶的流来将EV膜组装到FSNs-APTES上，如实验部分所述。这样就得到了FSNs-EVsA549micro。通过TEM评估了纳米颗粒表面的膜壳的存在。图4a,b分别显示了FSNs-EVsA549batch和FSNs-EVsA549micro的TEM图像。两种样品都一致观察到围绕纳米颗粒的有机壳，这对应于EV膜对FSNs-APTES纳米颗粒的包覆。此外，TEM图像还允许我们分析包覆效率（图4c）以及EV膜在纳米颗粒周围的厚度（图4d），观察了足够数量的纳米颗粒（N > 90）以获得可靠的统计数据。结果表明，微流控策略在纳米颗粒包覆方面明显更有效。因此，如果我们将任何表面有可见膜的纳米颗粒定义为已包覆的纳米颗粒，那么微流控方法获得的包覆纳米颗粒比例显著更高（分别为87.8%和对66.8%），其余为裸露的纳米颗粒。这可以归因于微混合器中更有效的混合，其中不相溶流体之间的界面剪切应力促进了膜与纳米颗粒的接触，减少了裸露纳米颗粒的概率。图4展示了FSNs-EVsA549batch和FSNs-EVsA549micro的表征：（a）FSNs-EVsA549batch的代表性TEM图像。（b）FSNs-EVsA549micro的代表性TEM图像。（a,b）的放大图清晰显示了由于负染色对比而可见的围绕纳米颗粒核心的有机膜；（c）两种技术（n = 3，每个重复实验50次）的FSNs包覆效率；（d）通过流式细胞术分析的EV相关标记物（n = 3）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片流式细胞术还用于评估EVs相关的表面标记物（图3d）。EVsA549富含四跨膜蛋白，如CD81、CD9和CD63（通常称为常见的EV表面标记物）（53），这些标记物呈强阳性，而CD24、CD44和CD29也显示出强烈的信号。这些蛋白质也被报道为在EVs中被检测到的主要标记物。（54）EV来源的膜主要由磷脂组成，其极性头部在水介质中朝向外部环境。这些极性头部含有带负电的磷酸基团。（55）此外，磷脂的功能基团（即EV膜的磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇）使整个膜具有总体负电荷。相比之下，FSNs-APTES在中性pH下被质子化，（56）从而获得正电荷。纳米颗粒与EV相关膜之间的ζ电位差异由于静电吸引作用而引导膜围绕纳米颗粒核心的组装（如同天然EVs）。熵力也促进了这一过程，因为磷脂倾向于重新组织成稳定的双层结构，使其极性头部朝向纳米颗粒表面和水性外部介质，将疏水部分隐藏在双层内部。这种排列最小化了系统的自由能，产生了热力学上有利的构象。（57,58）这种行为，加上表面电荷的吸引力，有利于它们在FSNs-APTES周围的自我组装。在这项工作中，我们选择了来自A549细胞的EV膜，因为预计它们对这些癌细胞具有亲和力。（45）在FSNs合成和功能化之后，根据Folch的方法（17）稍作修改，分离出了EVsA549来源的膜，如实验部分所述。然后，这些膜通过两种不同的策略组装到FSNs-APTES表面，如图1所示。首先探索了批处理策略。在这种情况下，EV膜在玻璃小瓶表面干燥，然后通过薄膜水化制备FSNs-EVsA549batch。简而言之，将干燥后的EVsA549膜直接与含有FSNs-APTES纳米颗粒的水溶液接触，使其吸附在颗粒表面。最后，混合物进行10分钟的超声处理（图1）。另一方面，也使用微混合器通过混合两种不相溶的流来将EV膜组装到FSNs-APTES上，如实验部分所述。这样就得到了FSNs-EVsA549micro。通过TEM评估了纳米颗粒表面膜壳的存在。图4a,b分别显示了FSNs-EVsA549batch和FSNs-EVsA549micro的TEM图像。两种样品都一致观察到围绕纳米颗粒的有机壳，这对应于EV膜对FSNs-APTES纳米颗粒的包覆。此外，TEM图像还允许我们分析包覆效率（图4c）以及纳米颗粒周围EV膜的厚度（图4d），通过观察足够数量的纳米颗粒（N > 90）以获得稳健的统计数据。结果表明，微流控策略在纳米颗粒包覆方面明显更有效。因此，如果我们定义一个包覆的纳米颗粒为表面有任何量可见膜的纳米颗粒，那么微流控方法获得的包覆纳米颗粒比例显著高于批处理方法（分别为87.8%和66.8%），其余为裸露的纳米颗粒。这可以归因于微混合器中更有效的混合，其中不相溶流体之间的界面剪切应力促进了膜与纳米颗粒的接触，减少了裸露纳米颗粒的概率。图4还通过称量两种包覆程序后剩余的未包覆膜来评估包覆效率。图4f显示了微流控辅助包覆转移了大部分脂质膜（仅剩3.7%），与批处理方法相比，EVs的包覆效果更好（批处理方法有20.5%的未包覆膜）。TEM观察进一步通过允许在单颗粒水平上评估多个表面点的膜厚度（图4d）来验证这些发现，而不是依赖于总体平均值。对于FSNs-EVsA549micro，膜厚度符合高斯分布，平均值（6.3 ± 1.9 nm）接近天然EV双层的约5 nm厚度。相比之下，FSNs-EVsA549batch膜显示出非高斯分布；它们的平均厚度（8.9 ± 2.8 nm）更接近双层膜。此外，批处理样本中14 nm处的一个显著峰表明在相当一部分纳米颗粒群体中形成了不受控制的多层结构。这些结果进一步说明了批处理过程无法实现精细控制，导致FSNs-EVsA549batch群体更加异质，其包覆厚度偏离天然EV膜的结构更远。虽然两种方法都涉及膜处理，但批处理方法依赖于完全干燥的脂质膜，往往导致磷脂的可见聚集。这些宏观聚集体即使经过超声处理也难以均匀分散。我们的微流控协议通过保持EV膜在液相中避免了这种脱水引起的聚集。这允许更可控的物质转移和相对于批处理方法更均匀的包覆。图4e中的NTA测量显示了FSNs表面的修改，从而通过添加新的表面层增加了纳米颗粒的有效直径。NTA分析显示的粒径分布与刚刚讨论的TEM图像很好地相关（FSNs、FSNs-APTES、FSNs-EVsA549batch和FSNs-EVsA549micro的粒径分别为113.7 ± 36.4、127.8 ± 49.4、147.5 ± 56.1和133.0 ± 47.3 nm）。从FSNs到FSNs-APTES再到FSNs-EVsA549，平均粒径逐渐增大，反映了在纳米颗粒表面进行功能化和膜组装步骤的成功结果，正如上文讨论所预期的那样，FSNs-EVsA549batch的粒径稍大。图4g包括ζ电位的演变。表面电荷的变化表明带正电荷的FSNs-APTES（15.3 ± 3.6 mV）与EVsA549来源的膜部分或完全包覆，包覆后的值分别为?2.4 ± 6.32 mV和?8.7 ± 3.4 mV。FSNs-EVsA549batch的较低ζ电位表明这些纳米颗粒的包覆更为不均匀，部分FSNs-APTES核心表面仍未包覆，从而使得纳米颗粒带有更高的正电荷。此外，FSNs-EVsA549batch的ζ电位测量在不同合成中的变化性较大，如图4g中的较大误差条所示，这证明了这种新微流控方法的优势。图4h中FSNs-EVsA549micro的额外图像确认了微流控方法的均匀性。FTIR分析证实了EVsA549、FSNs、FSNs-EVsA549batch和FSNs-EVsA549micro的磷脂包覆与二氧化硅核心的结合（图S2），以及之前在图2g中描述的二氧化硅特征带；识别出了特征性的磷脂指纹区域。（59?61）脂肪酸链含有许多甲基基团，这些基团在分离的膜和FSNs-EV混合物上呈现出独特的特征。在2960、2920、2870和2850 cm–1处可以找到一组峰，分别属于甲基和亚甲基不对称伸缩（νasCH3和νasCH2）以及甲基和亚甲基对称伸缩（νasCH3和νasCH2）。另一组两个较小的峰出现在1450和1380 cm–1，分别归因于甲基不对称和对称弯曲（γasCH3和γsCH3）。同样，羰基在1735 cm–1处也呈现出伸缩峰（νC═O）。最后，在1000至1300 cm–1之间观察到磷酸基团的峰，这些峰突出显示了磷酯键的对称和不对称伸缩（νsPO2和νasPO2）；（62）在1080和1250 cm–1处，这些峰被FSNs的二氧化硅峰掩盖了。通过流式细胞术评估了在纳米颗粒表面组装的EV相关膜的特征标记物的表达。为了最小化FSNs荧光信号的干扰，使用了不含FITC的二氧化硅纳米颗粒（SNs）。图S3比较了采用批处理和微流控策略包覆的SNs的EV相关标记物表达模式，分别为SNs-EVsA549batch和SNs-EVsA549micro。可以看出，在两种情况下，三种特征标记物都存在，相对强度遵循原始EV膜的模式（CD9 < CD63 < CD81）（图3d），尽管微流控包覆的纳米颗粒整体强度更高。最后，为了进一步评估EVsA549膜在FSNs周围的自我组装效果，进行了荧光共定位分析。通过FITC荧光可视化FSNs。EVsA549来源的膜用PKH26（一种亲脂性染料）标记，显示出红色发射。尽管Abbey定律规定的分辨率限制不允许观察到核-壳结构，但从两个通道收集的斑点观察表明EV相关膜和纳米颗粒的共定位。在图S4的面板中观察到黄色斑点（来自纳米颗粒的绿色发射叠加在膜的红色发射上）。这意味着在两个通道中观察到的可见物体正如预期的那样发生了共定位，这得益于颗粒周围膜的涂层作用。在评估FSNs-EVsA549batch和FSNs-EVsA549micro在不同细胞系中的内化和选择性之前，先研究了FSNs和FSNs-APTES在A549细胞中的生物相容性（见图S5），以确定可用于孵育的剂量。蓝色细胞活力测定显示，在所研究的剂量范围内（从1到0.01 mg/mL），无论是裸纳米粒子还是经过APTES修饰的纳米粒子，在24小时、48小时和72小时的检测时间点上均未显著降低细胞活力。这是意料之中的，因为硅纳米粒子是无毒的且具有很高的生物相容性（63-65）。最终选择了0.03 mg/mL的FSNs剂量用于后续实验，以评估EVs膜涂层是否赋予纳米粒子针对其亲本细胞的靶向能力。

纳米粒子的摄取受到物理特性（形态、大小和形状）和表面化学性质的影响（66,67）。然而，人们在仿生纳米工程方法中正在研究细胞膜包覆的纳米粒子（68），因为它们预计可以提供诸如提高靶向选择性和逃避免疫系统等重要优势。作为替代方案，也可以使用EVs的膜而不是整个细胞膜来包覆纳米粒子（16,69,70）。尽管需要克服一些困难（例如工艺的复杂性和收集EVs膜的精确技术要求），但这些用EVs膜包覆的纳米粒子原则上能更好地模拟天然EVs的特性，这也是本研究中选择这种方法的原因。

为了评估EVsA549衍生膜在FSNs肿瘤靶向效率中的作用，人们使用了共聚焦显微镜和流式细胞术技术。在三种细胞系中测试了FSNs-EVsA549batch和FSNs-EVsA549micro的优先趋向性：亲本EVs产生细胞系A549、作为肿瘤细胞示例的HeLa细胞以及作为健康细胞对照的成纤维细胞。每种细胞培养基中都加入了0.03 mg/mL的这些纳米粒子之一：FSNs、FSNs-EVsA549batch和FSNs-EVsA549micro，同时保持四种配方中纳米粒子的数量相同，以便比较摄取动力学。然后，在4小时和24小时后评估了纳米粒子的内化情况。图5a展示了共聚焦显微镜图像，显示了不同FSNs杂交体的摄取情况，其中绿色表示FSNs，红色和蓝色分别表示肌动蛋白丝和细胞核。为了评估摄取效率，量化了细胞内的FITC荧光并将其标准化为总细胞面积。图5b和c展示了每种FSN-EV杂交体与裸FSNs之间的平均荧光强度比率。

这些结果清楚地表明，当FSNs用EVsA549膜修饰后，其摄取量相对于裸纳米粒子有所增加。值得注意的是，使用微流控技术制备的涂层（FSNs-EVsA549micro）在短时间（4小时）和长时间（24小时）孵育下均更有效地促进了内化，并保持了EVs的靶向特性。例如，在4小时孵育时（见图5b），用A549 EVs膜包覆的纳米粒子使摄取量增加了50%（与裸FSNs相比增加了1.5倍），而对于FSNs-EVsA549micro，摄取量增加了19.3倍。这种趋势在更长时间的孵育（24小时）时仍然存在，批次制备的混合体分别增加了4.0倍和12.7倍。

比较这些相同载体在不同细胞系中的内化情况，可以明确看到它们对亲本A549细胞的优先摄取。与HeLa细胞和成纤维细胞相比，A549细胞在4小时孵育后荧光强度增加了19.3倍（见图5b）。同样，在24小时孵育时（见图5c），A549细胞的荧光强度分别增加了12.7倍、2.9倍和4.4倍，这与EVs的优先靶向特性一致（8）。尽管FSNs-EVsA549batch也在A549细胞中优先内化，但其增幅较低（分别为1.5倍、0.9倍、4.0倍、1.2倍和0.9倍）。图5e更清楚地显示了不同杂交体在目标细胞（A549）和非目标细胞（HeLa和成纤维细胞）之间的选择性比率。微流控工程制造的杂交体对A549细胞的选择性显著更高，靶向比率范围为2.9到8.0。相比之下，批次制备的杂交体表现明显较差，选择性比率仅为1.1到4.0。这些结果表明，微流控方法制备的涂层不仅更加均匀，而且更好地保持了膜中蛋白质和其他特征分子的排列，从而促进了它们在自身产生细胞上的摄取。

通过流式细胞术量化了三种细胞系中不同纳米粒子的内化情况，分析了单细胞水平上的摄取情况（>10,000个事件）。为了分离EV膜对细胞趋向性的影响，校正了细胞特异性自荧光，并表示为杂交体与裸FSNs之间的选择性比率。这种标准化考虑了每种细胞系的基线内吞活性，确保任何观察到的荧光增加都直接归因于EV膜介导的识别。因此，A549细胞系中的较高MFI比率是工程化杂交体靶向能力的定量指标。如图5c所示，4小时后的内化数据与共聚焦显微镜图像反映了FSNs-EVsA549micro对A549目标细胞的优先靶向。实际上，与裸FSNs相比，A549细胞在孵育后荧光强度增加了3.5倍。这种效应在HeLa细胞和成纤维细胞中不那么明显，分别只增加了2.1倍和1.2倍（远低于A549细胞的3.5倍）。与FSNs相比，MFI的增加表明所有细胞类型都能内化更多的FSNs-EVsA549micro，即使是非亲本细胞，这也是由于非特异性膜相互作用。然而，FSNs-EVsA549micro涂层上的独特分子特征使其在其亲本A549细胞中的摄取量更大。

对于FSNs-EVsA549batch，也观察到了类似的趋势。在这些纳米粒子中，相对于A549细胞、HeLa细胞和成纤维细胞，相对MFI分别为0.5、0.3和0.4。因此，尽管FSNs用A549膜包覆后对自身产生细胞有轻微的优先性（但无统计学意义），但其内化效率显著低于微流控制造的杂交体。这归因于批次制备过程中膜组装的高异质性，导致FSNs-EVsA549batch的ζ电位较低且聚集增加（见图4b）。我们推测，FSNs-EVsA549batch形成了较大的纳米粒子聚集体，阻碍了它们在不同细胞类型的摄取。另一方面，FSNs-EVsA549micro的涂层更加均匀，确保了每个纳米粒子的更好分布，并促进了纳米粒子-EV杂交体与目标细胞之间的膜介导相互作用。这些发现来自9次生物学重复实验，使用了4种独立的FSN合成方法和EVA549涂层。图S6显示各重复实验之间没有显著差异，突显了微流控辅助涂层方法在批次间再现性方面的优势。尽管统计上不显著，但在第二组重复实验中，FSNs-EVsA549batch的摄取率略高，表明其制备过程控制性较差。

旨在复制天然EVs特性的合成载体使用了由荧光硅核组成的纳米粒子，并用基于EVs的膜进行包覆。该制备过程利用了APTES修饰的硅的正电荷，通过带负电荷的EVs膜片段实现包覆。然而，核心纳米粒子与涂层膜之间的接触方式对最终杂交体的性质有很大影响。特别是基于剪切应力驱动的微流控混合策略，在被动微混合器中实现了对膜组装过程的精细控制，并更好地保持了复杂的膜结构（EVs标记物、磷脂、厚度和大小）。这种方法减少了异质性，确保了一致的涂层厚度，克服了批次制备中常见的局限性。因此，这些FSNs-EVsA549micro表现出更高的内化效率（增加了3.5倍）和对A549细胞的靶向能力。总之，这些结果证明了这种创新的微流控方法在用EVs衍生膜包覆纳米粒子方面是一种有用的技术，可以创造出更接近天然EVs的杂交体，更好地保留了它们的靶向分子和功能。