适用于快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗生素敏感性的比色即用型微流控芯片，可通过基于智能手机的分析技术实现

《ACS Omega》：Colorimetric Ready-to-Use Microfluidic Chips for Rapid Antibiotic Susceptibility Testing of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus by a Smartphone-Based Analysis

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已经开发了许多针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的表型抗性检测方法，但这些方法仍然存在一些缺点，如孵育时间较长、操作复杂以及缺乏便携性。在此，我们设计了即用型微流控芯片，采用更先进的新方法来专门快速检测MRSA的抗生素抗性。微流控芯片孔中的花青素分子会根据反应介质的pH值改变颜色，作为pH指示剂。孔中的颜色变化取决于在不同剂量头孢噻肟作用下的耐抗生素细菌和敏感细菌的抑制情况。在一个芯片上就能揭示MRSA对多种剂量的抗生素抗性谱。通过移动应用程序和彩色图像处理技术分析了获得的比色反应结果。使用标准参考菌株（S. aureus ATCC 43300和ATCC 25923）验证了该系统的可行性。因此，这项概念验证研究表明，可以在几小时内完成抗生素抗性检测，且设备要求较低，有必要进一步用临床分离株进行验证。

1. 引言
世界卫生组织（WHO）定义的抗菌耐药性（AMR）是一个威胁全球的严重问题。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，每年因AMR引起的感染超过280万例，导致35,000多人死亡。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）被归类为耐抗生素细菌，在WHO发布的2024年版《细菌优先病原体列表》（BPPL）中被列为“高优先级”病原体。MRSA感染可引起多种症状，包括心内膜炎、局部感染性肺炎和败血症。此外，感染MRSA的患者的死亡风险比感染耐甲氧西林细菌的患者高出64%。AMR会导致住院时间延长、医疗成本增加以及危及生命的情况。因此，及早治疗和检测MRSA在临床上非常重要。在临床实验室中，通常通过细菌培养和液体稀释测试来检测对甲氧西林/苯唑西林类抗生素的抗性谱。然而，这些方法耗时且操作复杂，需要大量仪器和设备。由于这些缺点，人们开发了多种快速检测MRSA的方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）。尽管这些方法能提供快速结果，但由于成本高昂和样本制备过程复杂，未能广泛使用。目前仍迫切需要开发快速、经济、用户友好的即时检测（POC）方法。

微流控平台作为一种强大的替代方案，将耗时的传统表型检测方法转变为快速的诊断步骤。这些系统显著减少了工作量，提供了快速准确的结果，并且所需样本量极少。在抗生素敏感性测试（AST）的背景下，已有各种比色微流控策略被报道用于简化读数。例如，最近的研究利用微孔阵列中的鲁米诺等代谢指示剂，通过基于智能手机的颜色分析来监测细菌生长。同样，综合综述强调了将pH响应指示剂和其他光学传感器集成到微流控设备中，以加快检测速度。尽管取得了这些进展，许多现有的比色平台在定量标准化方面仍存在局限性。它们通常依赖于主观的视觉检查或复杂的昂贵光学读数设备（如分光光度计），从而削弱了POC的优势。虽然使用CIELab或红绿蓝（RGB）算法进行彩色图像处理可以解决问题，但照明均匀性和设备依赖性带来的变异性仍是重要障碍。此外，基于智能手机的最新方法通常缺乏结合标准化成像硬件和用户友好决策算法的完全集成“闭环”系统。

在这项研究中，我们通过引入一种新型的全集成微流控平台来弥补这些不足，该平台结合了基于花青素的传感技术与3D打印的比率式智能手机接口。我们开发了一种基于微流控芯片的甲氧西林抗性检测方法，可在4小时内提供比色结果。测试溶液包含培养基、花青素分子和头孢噻肟（cef）。加载到中央输入孔中的测试培养基在孵育后能显示对多种抗生素剂量的抗性谱。此前仅以液态形式存在的测试培养基现已集成到微流控芯片中，相比多步骤过程，这种方法具有更快出结果的优势。在微流控芯片中，如果细菌具有抗性则继续存活，如果敏感则被抑制。当细菌存活时，酸性有机挥发化合物（aOVCs）与作为pH指示剂的花青素相互作用，导致颜色变化。在所开发的测试中，这种颜色变化通过智能手机应用程序进行半定量分析。与依赖外部泵和复杂阀门网络的复杂微流控系统不同，所提出的平台采用了简化的几何驱动架构，无需泵，降低了制造成本，非常适合POC应用。因此，我们开发了一种快速、用户友好、经济且创新的测试方法，有助于对抗AMR。

2. 实验部分
2.1. 材料和仪器
胰酪大豆琼脂（Merck，德国）、脱脂乳培养基（Difco，美国）、肉提取物（Acumedia，英国）、NaCl（Isolab，土耳其）、肽粉（Mast Diagnostic，英国）、头孢噻肟（Merck，德国）均从指定公司购买。
2.2. 微生物
MRSA标准菌株43300和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 25923（MSSA）来自埃尔贾耶斯大学药学院药学生物学研究实验室的ATCC菌种库。所有病原体均在-20°C的脱脂乳培养基中保存，并在实验前进行复苏。光密度通过分光光度计（Azure Ao，Azure Biosystems, Inc.）测定。
2.3. 红卷心菜（Brassica oleracea）提取
红卷心菜（B. oleracea L.）是微流控芯片中用作pH指示剂的花青素的来源。该植物富含氰苷-3-双葡萄糖苷-5-葡萄糖苷这种花青素衍生物。提取方法为：将紫色的叶子分离、清洗并干燥，然后将500克叶子切成小块，用500毫升蒸馏水煮沸30分钟。最终得到的紫色提取物用Whatmann No.1滤纸过滤以去除颗粒和杂质，并储存在琥珀色玻璃瓶中，保存在4°C。
2.4. 微流控芯片设计
本研究设计了两种不同类型的微流控芯片：12孔芯片和中通道芯片以及6孔芯片。中通道芯片的层结构自上而下为：2毫米聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、0.4毫米醋酸薄膜、3毫米PMMA和1毫米PMMA。这些层使用0.13毫米厚的双面胶带（3M，High-Performance Acrylic Adhesive Transfer Tape 468MP）粘合。PMMA和醋酸薄膜层中的孔和微结构通过CO2激光加工系统（AEON，NOVA 7）制造。每个孔的直径为6.6毫米，包括双面胶带在内的高度约为5.8毫米，每个孔的体积约为200微升。
2.5. 即用型比色微流控芯片的制备
用于比色微流控芯片的液体测试培养基经过少量修改后制备。我们制备了含有10克/升肽粉、1克/升肉提取物和75克/升盐的溶液，然后将其加载到微流控芯片中。制备后的溶液在121°C高压釜中灭菌15分钟。其次，用1 M NaOH溶液将红卷心菜提取物的pH调整至8.0，再通过无菌滤膜过滤。最后将高压灭菌后的溶液和无菌提取物按1:4的比例混合。微流控芯片中加入抗生素进行测试，分别设置1、2、4、8和16微克/毫升的剂量作为阳性对照和阴性对照。抗性解释基于欧盟抗菌敏感性测试委员会（EUCAST）2026年的指南。由于头孢噻肟对S. aureus的筛选临界值定义为MIC > 4微克/毫升，因此含有4微克/毫升头孢噻肟的微流控孔中的存活和颜色变化被认为是MRSA的指标。该设计能够可靠地区分敏感型（MSSA）和耐药型（MRSA）表型，适用于快速诊断决策，而不是定量MIC估计。每个孔加入5微升头孢噻肟溶液，芯片在37°C的孵育箱中干燥。将含有花青素的测试溶液与细菌样本以1:1的比例混合，然后通过孵育箱中央入口 hole 加入芯片。对于12孔芯片加入2400微升测试溶液，对于6孔芯片加入1200微升测试溶液（每个孔200微升）。接种后，微流控芯片在37°C下静置孵育4小时。为防止测试溶液进入通道或从通道回流到中央入口 hole、蒸发和潜在的交叉污染，通道中填充矿物油，并将芯片置于保湿的培养皿中。关于储存条件、长期稳定性和批次间重复性的详细信息见支持材料（实验部分）。
2.6. 数字图像处理
使用数字图像处理对测试结果进行半定量分析。孵育结束后，使用白色背景拍摄微流控芯片的照片。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）分析微流控孔中的颜色变化。ImageJ软件用于分析孔中的红绿蓝值。根据CIE 1976实验室公式计算红/蓝值和Delta E值，以表示孵育前后颜色的差异。公式如下：
Δ??=[(Δ??)2+(Δ??)2+(Δ??)2]1/ΔE=[(ΔL)2+(Δa)2+(Δb)2]1
公式中的ΔL、Δa和Δb定义了CIE Lab颜色空间的维度。红色和绿色之间的差异由Δa表示，黄色和蓝色之间的差异由Δb表示，黑色和白色之间的差异由ΔL表示。这些值在相似图像中较低，在不同图像中较高。这种分析方法比人眼更精确地分析了微流控芯片中的颜色差异。
2.7. 统计分析和决策规则
通过计算每个微孔的R/B强度比和ΔE或欧几里得距离（ED）值进行半定量分析。为确保数据可靠性和捕捉生物学变异性，实验设计遵循严格的重复结构。所有实验在三个不同日期（n = 3）使用新鲜的细菌培养物和单独的微流控芯片进行三次独立重复。考虑到POC设备的微型化特点，每种抗生素浓度在6孔微流控芯片的一个孔和12孔微流控芯片的两个孔中进行分析。统计评估侧重于芯片间的重复性。定量数据表示为这些独立重复的平均值 ± 标准差（SD）。相对标准差（RSD）用于评估批次间的一致性。为了建立区分MRSA（高信号）和MSSA（低信号）的标准化标准，在这项概念验证研究中定义了一个分析决策阈值（T）。我们采用二元分类方法，基于敏感参考菌株（MSSA ATCC 25923）的变化来计算临界值。不同于简单的平均比较，我们考虑了检测限（LOD）确定的原则。计算公式如下：
??=μsusceptible+3??susceptible
其中，μsusceptible表示敏感菌株重复样本的R/B平均比值和ΔE值，σsusceptible表示标准差。该决策是基于含有4 μg/mL和8 μg/mL头孢菌素的孔在4小时时间点的测量结果做出的。统计报告重点关注了分析区分能力。产生超过此阈值（μ + 3σ）的颜色信号的样本被认为在分析上与敏感基线不同，并被归类为“耐药”。为了展示方法的重现性和变异性，半定量数据以平均值±标准差（SD）的形式呈现，所有图表中的误差条代表重复实验的SD。

2.8. 智能手机应用程序的开发
为了减少对设备的需求，我们使用Python开发了一个具有图像处理功能的智能手机应用程序。该应用程序可以在Android 4至10版本上运行，不需要以太网连接。主菜单包含用于捕获、分析和评估图像结果的各种界面。它计算每个微流控芯片孔的RGB值，并根据这些值计算欧几里得距离（公式2）。结果屏幕显示所有RGB值和欧几里得距离结果，以及是否耐药的指示。

(33,34)ED2=(??2???1)2+(??2???1)2+(??2???1)2
(2)
相机必须与芯片保持等距，并且不能聚焦于背景中的其他物体。这将提高测试结果的准确性。这是一个重要的挑战。因此，开发了一个智能手机平台来标准化相机与微流控芯片之间的距离，提供均匀的照明并最小化环境因素的影响。得益于这个平台，所有测试都在相同的条件下进行拍摄和分析。移动应用程序采用双参数阈值算法自动分类样本的抗生素敏感性状态。为了减少假阳性并提高诊断准确性，决策逻辑结合了比率R/B强度分析和ED值。分类阈值是根据使用3σ规则的敏感MSSA菌株重复实验的统计分布定义的：

1. R/B阈值（TR/B）：μR/B + 3σ
2. ED阈值（TED）：μED + 3σ
在分析过程中，应用程序处理捕获的图像并计算每个孔的这两个指标。如果信号超过相应的阈值，则样本被分类为“耐药”（MRSA）；否则，报告为“敏感”（MSSA）。这种多指标方法确保诊断通过特定的颜色变化（R/B）和整体可感知的颜色变化（ED）得到验证。

2.9. 多功能3D打印智能手机平台设计
我们设计了一种能够显示微流控芯片颜色变化的智能手机平台。与之前的工作相比，这个平台的设计更加紧凑。该平台主要由两部分组成：一个是智能手机的支架，另一个是用于放置微流控芯片的抽屉。抽屉在拍摄过程中确保芯片的稳定性，并保持每次分析时相机与芯片之间的一致距离。支架有一个开口，可以对着手机摄像头拍摄芯片。支架内装有电池和白色LED灯以支持拍摄。灯光由支架外的开关控制。智能手机平台使用Ultimaker S3 3D打印机制造，使用填充比为20%的黑色刚性聚乳酸（PLA）丝材。在这项研究中，设计调整为适合Xiaomi Redmi 10S智能手机模型。这是通过调整抽屉中的微流控芯片和手机摄像头光圈来实现的。

3. 结果与讨论
微流控芯片的感应机制依赖于细菌增殖对培养基的代谢酸化作用。在快速生长阶段，细菌通过发酵途径代谢碳水化合物，产生aOVCs。有机酸的积累导致孔内局部pH值下降。因此，pH指示剂（花青素）发生结构上的质子化，从而从蓝色（碱性）变为粉红色（酸性）。在有效抗生素（头孢菌素）存在的情况下，细菌的新陈代谢被抑制，阻止了酸的产生，保持初始的蓝色。
测试的主要成分是天然来源的花青素作为pH指示剂和培养基。花青素分子易于获取，可以直接从各种植物中提取，尤其是红甘蓝（B. oleracea），具有生物相容性、经济性，并且对pH变化敏感。它在酸性、中性和碱性环境中都有广泛的颜色范围。与在酸性和碱性环境中呈现两种不同颜色的合成指示剂不同，花青素具有五种颜色：粉红色、紫色、蓝色、绿色和黄色。由于这种广泛的颜色范围，可以灵敏地检测细菌释放的aOVCs。图1简要说明了基于微流控芯片的甲氧西林耐药性测试及其基于移动应用程序的分析工作原理。

先前，我们的团队开发了基于花青素的比色测试来检测包括甲氧西林耐药性细菌在内的多种细菌。在当前研究中，甲氧西林耐药性测试被集成到微流控芯片中，使得一步过程能够检测多种抗生素剂量。图1展示了具有6个孔和12个孔的两种不同芯片设计。每个微流控芯片孔含有不同剂量的抗生素。从孔的中心入口发送的细菌样本与孔内的抗生素相互作用。由于这种相互作用，对相关剂量抗生素敏感的细菌被抑制，不再释放aOVCs。如果细菌对相关剂量的抗生素具有耐药性，它们会继续其生命活动，从而释放aOVCs，使反应环境变为酸性。由于pH变化，花青素分子发生质子化，最初的测试溶液颜色（蓝色或紫色）变为粉红色。因此，每个孔中的颜色变化同时发生，这取决于抗生素的剂量。图1A和B展示了6孔微流控芯片的层次结构和水平视图。图1D和E展示了12孔微流控芯片的层次结构和水平视图。此外，图1C和F展示了将甲氧西林耐药性测试集成到这两种芯片中时获得的比色响应。

在第一步中，向6孔微流控芯片的每个孔中加入5 μL头孢菌素溶液（剂量如图1-2-4-8 μg/mL所示），然后进行干燥。在图2中，600 μL花青素测试溶液（pH 8，花青素比例1:4）与600 μL 3 McFarland细菌溶液混合，总共1200 μL花青素测试溶液被加载到每个孔的中心入口。阴性对照含有32 μg/mL的头孢菌素，阳性对照含有0 μg/mL的头孢菌素。图2A中测试了MRSA，图2B中测试了MSSA。在图2A中，除了阴性对照外，所有孔在3.5小时时都从蓝色变为紫色。到了4.5小时，除了阴性对照外的孔都变成了粉红色，因为MRSA在含有1-2-4-8 μg/mL头孢菌素的孔中继续生长并进行其生命活动。结果，培养基变得酸性，蓝色的花青素变成了粉红色。比色响应是由细菌产生的aOVCs引起的，这导致花青素指示剂从醌类基础结构变为佛尔维亚阳离子结构。支持信息中的图S1详细说明了化学机制和质子化平衡。在图2B中，只有在含有1 μg/mL头孢菌素和阳性对照的孔中，在3.5小时时观察到浅紫色。到了4小时，含有1 μg/mL头孢菌素的孔和阳性对照完全变成了粉红色。含有2 μg/mL头孢菌素的孔呈现浅紫色，含有4 μg/mL头孢菌素的孔呈现深紫色，其他孔保持蓝色。经过6小时的培养后，含有2 μg/mL头孢菌素的孔变成了粉红色。含有4 μg/mL头孢菌素的孔保持深紫色，因为MSSA在含有1 μg/mL和2 μg/mL头孢菌素的孔中继续生长并进行其生命活动。含有4 μg/mL头孢菌素的孔呈现深紫蓝色，因为这是甲氧西林的耐药阈值。含有8 μg/mL头孢菌素的孔没有颜色变化。MSSA在敏感剂量（1 μg/mL和2 μg/mL）下继续其生命活动，释放酸性成分，导致花青素质子化并变为粉红色。在其他剂量下，由于细菌被抑制，生命活动停止，环境没有酸化，因此没有观察到明显的颜色差异。对照实验确认矿物油覆盖层和抗生素没有引起非特异性的pH变化，因为无菌空白孔没有颜色变化。

在图3中，向12孔微流控芯片的孔中加入5 μL浓度为1-2-4-8-16 μg/mL的头孢菌素溶液，然后进行干燥。所有抗生素剂量都制备了两个重复样本。1200 μL花青素测试溶液（pH 8，花青素比例1:4）与1200 μL 3 McFarland细菌溶液混合，总共2400 μL花青素测试溶液被加载到中心入口孔。记录了时间依赖的颜色变化。阴性对照含有32 μg/mL头孢菌素，阳性对照含有0 μg/mL头孢菌素。图3A中测试了MRSA，图3B中测试了MSSA。经过3.5小时的培养后，含有1-2-4 μg/mL头孢菌素的孔和阳性对照的颜色从蓝色变为紫色，而含有8-16 μg/mL头孢菌素的孔和阴性对照保持蓝色。经过4.5小时的培养后，含有1-2-4-8 μg/mL头孢菌素的孔和阳性对照变成了粉红色，而含有16 μg/mL头孢菌素的孔保持浅紫色。经过6小时的培养后，所有孔除了阴性对照外都变成了粉红色。MRSA通过在含有1-2-4-8-16 μg/mL头孢菌素的孔中释放aOVCs引发了颜色变化。

在图3B中，测试了MSSA。经过3.5小时的培养后，含有1-2 μg/mL头孢菌素的孔和阳性对照的颜色从蓝色变为紫色，而含有4-8-16 μg/mL头孢菌素的孔和阴性对照保持蓝色。经过4小时的培养后，含有1-2 μg/mL头孢菌素的孔和阳性对照变成了粉红色，而含有4 μg/mL头孢菌素的孔变成了紫色。此外，含有8-16 μg/mL头孢菌素的孔保持稳定的蓝-深紫色。经过6小时的培养后，情况与4小时培养时相同。MSSA通过在含有1-2 μg/mL头孢菌素的孔中释放aOVCs引发了颜色变化。直接pH测量（表S1）确认生长中的MRSA引起了显著的代谢酸化，而被抑制的MSSA保持了稳定的pH值，验证了在含有4-8 μg/mL头孢菌素的孔中颜色变化是由新陈代谢驱动的。此外，将微流控芯片结果与金标准肉汤稀释法（BMD）进行比较的验证实验显示，根据EUCAST指南，两者有100%的分类一致性（详见支持信息中的表S2）。

众所周知，由于个体差异，比色结果的视觉观察可能会有所不同。为了解决这个问题，使用了彩色图像处理技术对比色结果进行了半定量分析。为此，计算了每个孔在一段时间内的红蓝（Red/Blue）值。该值的增加是一个数值指标，表明孔正从蓝色向粉色转变。在6孔和12孔微流控芯片上进行的MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）和MSSA（耐苯唑西林金黄色葡萄球菌）耐药性分析所得的R/B值显示在图4中。图4A和B展示了12孔微流控芯片上的MRSA和MSSA分析结果，而图4C和D展示了6孔微流控芯片上的分析结果。

图4所示为微流控芯片中存在MRSA和MSSA时的红蓝比例（R/B）随时间的变化情况。(A) 12孔微流控芯片上的MRSA分析 (B) 12孔微流控芯片上的MSSA分析 (C) 6孔微流控芯片上的MRSA分析 (D) 6孔微流控芯片上的MSSA分析。误差条代表了三次独立实验（n = 3）的标准差（SD）。

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在整个研究中，基于严格的重复实验进行了比色反应的半定量分析，以确保其生物学有效性。除非另有说明，所有数据点均代表在不同天进行的三次独立生物学重复实验（n = 3）的平均值。由于POC（现场检测）设备的微型化设计，每种抗生素浓度仅在6孔微流控芯片的一个孔中测试，在12孔微流控芯片中则测试两个孔。因此，所有图表中报告的变异性（平均值±标准差）和误差条反映了这些独立生物学重复实验之间的芯片间再现性。此外，还计算了RSD（相对标准差），以量化不同芯片批次之间的平台一致性（表S3–S6）。统计区分使用实验部分详细介绍的3σ决策规则来确定。

在含有MRSA的12孔微流控芯片中，孵育3.5小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔的R/B值为0.745 ± 0.017，而在6孔微流控芯片中为0.760 ± 0.042。在12孔微流控芯片孵育4小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔的R/B值为0.966 ± 0.019，而在6孔微流控芯片中为1.000 ± 0.016。在12孔微流控芯片孵育3.5小时后，含有8 μg/mL头孢菌素的孔的R/B值为0.56 ± 0.032，而在6孔微流控芯片中为0.690 ± 0.029。在12孔微流控芯片孵育4小时后，含有8 μg/mL头孢菌素的孔的R/B值为0.88 ± 0.04，而在6孔微流控芯片中为0.96 ± 0.02。在含有MSSA的12孔微流控芯片孵育3.5小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔的R/B值为0.59 ± 0.021，而在6孔微流控芯片中为0.69 ± 0.049。在12孔微流控芯片孵育4小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔的R/B值为0.59 ± 0.024，而在6孔微流控芯片中为0.85 ± 0.016。在含有MSSA的12孔微流控芯片孵育3.5小时后，含有8 μg/mL头孢菌素的孔的R/B值为0.54 ± 0.035，而在6孔微流控芯片中为0.68 ± 0.047。在含有MSSA的12孔微流控芯片孵育4小时后，含有8 μg/mL头孢菌素的孔的R/B值为0.54 ± 0.015，而在6孔微流控芯片中为0.69 ± 0.02。

在评估哪种芯片设计能产生有效结果时，孵育3.5小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔中MRSA和MSSA之间的R/B差异在12孔微流控芯片中为0.155，而在6孔微流控芯片中为0.100。孵育4小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔中MRSA和MSSA之间的R/B差异在12孔微流控芯片中为0.376，而在6孔微流控芯片中为0.15。因此，孵育4小时后MRSA和MSSA之间的R/B值差异在12孔微流控芯片中更高。MRSA菌株的R/B比率显著高于敏感菌株（平均值±标准差，n = 3）。这些颜色变化虽然肉眼难以区分，但可以通过移动应用程序中的R/B差异清晰计算出来。

在6孔和12孔微流控芯片上进行的MRSA和MSSA耐药性分析所得的Delta E值显示在图5中。图5A和B展示了12孔微流控芯片上的分析结果，而图5C和D展示了6孔微流控芯片上的分析结果。在含有MRSA的12孔微流控芯片孵育3.5小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔的Delta E值为36.2 ± 1.1，而在6孔微流控芯片中为36.2 ± 1.3。在12孔微流控芯片孵育4小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔的Delta E值为49.2 ± 1.2，而在6孔微流控芯片中为49.2 ± 2.1。在含有MSSA的12孔微流控芯片孵育3.5小时后，含有8 μg/mL头孢菌素的孔的Delta E值为32.96 ± 1.3，而在6孔微流控芯片中为23.2 ± 1.6。在含有MSSA的12孔微流控芯片孵育4小时后，含有8 μg/mL头孢菌素的孔的Delta E值为40.9 ± 1.8，而在6孔微流控芯片中为35.09 ± 1.5。

图5所示为微流控芯片中存在MRSA和MSSA时的Delta E值随时间的变化情况。(A) 12孔微流控芯片上的MRSA分析 (B) 12孔微流控芯片上的MSSA分析 (C) 6孔微流控芯片上的MRSA分析 (D) 6孔微流控芯片上的MSSA分析。误差条代表了三次独立实验（n = 3）的标准差（SD）。

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在含有MSSA的12孔微流控芯片孵育3.5小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔的Delta E值为15.36 ± 0.6，而在6孔微流控芯片中为15.36 ± 1.2。在含有MSSA的12孔微流控芯片孵育4小时后，含有4 μg/mL头孢菌素的孔的Delta E值为20.1 ± 0.8，而在6孔微流控芯片中为22.3 ± 1.7。在含有MSSA的12孔微流控芯片孵育3.5小时后，含有8 μg/mL头孢菌素的孔的Delta E值为14.5 ± 0.5，而在6孔微流控芯片中为15.5 ± 1.1。在含有MSSA的12孔微流控芯片孵育4小时后，含有8 μg/mL头孢菌素的孔的Delta E值为15.1 ± 0.6，而在6孔微流控芯片中为15.8 ± 1.4。

在评估哪种芯片设计能产生有效结果时，含有8 μg/mL头孢菌素的孔中，12孔微流控芯片孵育4小时后MRSA和MSSA之间的Delta E值远高于6孔微流控芯片。因此，可以明确判断样本是MRSA。在含有MSSA的12孔微流控芯片中，含有4 μg/mL头孢菌素的孔的Delta E值低于6孔微流控芯片。低颜色差异表明颜色接近初始颜色，并且由于灵敏度的原因受到了抑制。综合两个结果来看，12孔微流控芯片在耐药性分析中提供了更有效的结果。两种微流控芯片几何形状的性能比较突出了技术重复的好处。尽管化学机制相同，但12孔设计为每种抗生素浓度提供了两个重复孔，而6孔设计仅使用一个孔。通过平均这些重复孔的信号，12孔平台有效减轻了随机实验变异（如轻微的光学不均匀性），使得读数比6孔格式的单一点测量更加一致和可靠。

为了评估微流控芯片的稳健功能，测量了包括检测范围、灵敏度和可靠性在内的基本性能参数。该芯片设计用于覆盖头孢菌素的临床相关浓度范围。测试的抗生素浓度范围从1 μg/mL到16 μg/mL，能够精确确定与EUCAST临界值一致的表现型耐药性谱。表1和表2分别总结了6孔和12孔微流控芯片在最佳读出时间（第4小时）的代表性统计分析结果。如所示，RSD值在此关键决策点始终保持在5%以下。此外，涵盖所有监测时间间隔的全面数据集（见支持信息中的表S3–S6）确认该方法具有高精度，所有实验条件下的RSD值均低于10%。如统计分析部分所详述，系统的灵敏度依赖于区分阈值（T = μsusceptible + 3σsusceptible）。即使在最低可测颜色变化的情况下，系统也能成功区分MRSA生长和MSSA抑制，从而确保在测试条件下没有假阴性结果。

表1. 6孔微流控芯片在检测时间（第4小时）的统计分析结果
菌株 头孢菌素浓度（μg/mL） 平均R/B 标准差（%）
MRSA（PC） 1.14 0.025 2.20 11.09 0.028 2.57 21.07 0.024 2.24 41.00 0.016 1.60 80.96 0.022 0.80 32（NC） 0.65 0.024 3.70

表2. 12孔微流控芯片在检测时间（第4小时）的统计分析结果
菌株 头孢菌素浓度（μg/mL） 平均R/B 标准差（%）
MRSA（PC） 0.97 0.019 1.96 10.97 0.019 1.96 20.96 0.009 0.94 40.97 0.019 1.97 80.88 0.039 44.3 160.64 0.023 32（NC） 0.64 0.019 2.97
MSSA（PC） 1.00 0.013 11.00 0.020 2.00 21.02 0.025 2.45 40.59 0.024 4.07 80.54 0.015 2.78 160.35 0.015 4.28 32（NC） 0.54 0.020 3.70

开发了一个3D打印的智能手机平台，并设计了一个与微流控芯片兼容的移动应用程序。如图6所示，该应用程序使用R/B和ED计算来分析数字图像。智能手机平台兼容6孔和12孔微流控芯片（图6A）。移动应用程序还设计为单独分析每个孔的颜色（图6B）。

图6所示为智能手机平台和移动应用程序界面（A）从不同视角看到的智能手机平台图像（B）用户友好的智能手机应用程序界面。

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为了验证该应用程序的分析准确性，将计算出的R/B比率与标准图像分析软件（ImageJ）获得的测量结果进行了比较。如图S3（支持信息）所示，验证了强线性相关性（R2 > 0.98），确认基于智能手机的量化方法是可靠的，并且与台式基准相当。虽然基本的传感化学原理利用了我们之前报告的优化花青素参数（20,22,23），但当前研究在系统集成和工程方面取得了显著进步。与之前的宏观规模或单一分析物研究不同，这项工作引入了一种能够进行多重分析的集成微流控架构。如表S7（支持信息）所详细说明，关键创新包括开发无需泵的中央分配网络、预加载抗生素以实现“即用型”工作流程，以及在微型化格式下验证芯片间再现性。因此，该平台将已验证的化学原理转化为一个独立的可现场部署的POC产品。

表S8（支持信息）提供了所开发的微流控芯片与最近报道的最先进的AST平台之间的全面比较。虽然提供的诊断准确性相当，但所提出的平台能够在4小时内提供结果（快速出结果时间），无需大型仪器，这突显了其作为资源有限环境中的经济高效和操作简单解决方案的优势。

4. 研究的局限性

本研究的主要局限性在于它仅关注一组定义的标准参考菌株（S. aureus ATCC 43300和ATCC 25923），而不是多样化的临床分离株。虽然这些菌株为展示设备功能提供了可控的方法，但它们并不能完全反映临床环境中的生物异质性。因此，现阶段无法建立诸如临床灵敏度和特异性等统计诊断性能指标。这项研究作为概念验证，证明了基于智能手机的比色测定的分析可行性。未来的研究将专注于使用更大的患者来源分离株库验证该设备，将其结果与参考BMD进行比较，并确定全面的诊断准确性。关于潜在的非目标微生物干扰，需要注意的是，该平台是作为标准细菌分离后的下游AST工具设计的。与金标准的BMD或商用自动化系统类似，该检测方法需要使用分离的菌落悬浮液，以确保代谢信号仅来自目标病原体。因此，通过标准的临床工作流程可以减少混合培养物带来的干扰，该流程要求在敏感性测试之前先分离出纯培养物。5. 结论：我们利用微流控芯片技术开发了基于比色法的抗菌药物敏感性测试方法，用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。我们还设计了一个移动应用程序和智能手机平台来分析这些测试结果。在本研究中，耐甲氧西林性金黄色葡萄球菌的检测速度比其他基于比色法的测试更快，并且能够同时揭示其对多种不同剂量的耐药性特征。这降低了工作量，同时减少了昂贵设备的使用需求。在含有头孢氧丁肟的培养基中，MRSA仍能继续生长并释放脂质氧化_embeddings（aOVCs）到培养环境中，而敏感的甲氧西林-sensitive金黄色葡萄球菌（MSSA）则被抑制。这些脂质氧化_embeddings通过使孔液酸化产生比色变化。我们证明了这种颜色变化既可以用肉眼观察到，也可以通过彩色图像处理技术进行分析。作为利用标准参考菌株的概念验证研究，这些发现证明了所提出平台的可行性。因此，这一创新解决方案为对抗抗生素耐药性提供了一个有前景的工具，但还需进一步采用临床分离株进行验证。