《Cytometry Part A》：Superior Intracellular Detection of Cytokines, Transcription Factors, and Phosphoproteins by CyTOF Compared With Fluorescent Cytometry
编辑推荐：
本研究通过头对头比较，系统论证了流式质谱技术(CyTOF)在检测胞内信号分子（包括细胞因子、转录因子和磷酸化蛋白）时，相比全光谱流式细胞术(FSFC)具有更卓越的信号分辨能力。该技术能够清晰检测到FSFC难以分辨的IL-10+和IL-13+等稀有功能细胞亚群，为精准刻画免疫细胞功能多样性、发现新型诊断标志物和推动个体化诊疗提供了强有力的工具。
引言：高维单细胞分析的需求与挑战
要解析免疫系统在稳态、疾病病理及治疗干预中的复杂性，高维单细胞分析是必不可少的工具。然而，仅凭表面受体表型分析不足以确定细胞功能，需要对细胞因子等胞内功能性标志物进行剖析。流式细胞术，特别是全光谱流式细胞术(FSFC)，虽是高灵敏度多参数技术，但在检测胞内标志物时，仍面临光谱重叠、细胞自发荧光等挑战，这降低了对稀有细胞群或低丰度表达标志物的分辨能力。相比之下，流式质谱技术(CyTOF)使用重金属同位素标记的抗体，其金属标签信号几乎无重叠，且无本底干扰，被认为是克服上述局限的潜在方案。
研究方法：头对头的公平比较
为了直接比较两种平台在胞内标志物检测上的性能，研究设计了三个小型（10-12重）抗体检测组合。这些组合分别靶向不同类别的胞内读数：磷酸化表位、转录因子和细胞因子。所有组合均使用了克隆匹配的抗体，并为FSFC选择了光谱重叠最小的荧光染料。将来自健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)平均分配，分别用荧光或金属标记的抗体（先表面后胞内）进行染色，然后在Cytek Aurora光谱分析仪或CyTOF XT流式质谱系统上分别进行采集。
结果一：在检测T细胞磷酸化激活状态上，CyTOF展现出更优的分辨率
研究人员检测了包括pSTAT1、pSTAT3、pSTAT5、p38和pERK1/2在内的多种磷酸化蛋白。结果显示，相较于FSFC，CyTOF技术对所有被测标志物均显示出更高的磷酸化信号与基础/未刺激水平的比值。例如，对于pSTAT3，CyTOF图中的背景明显低于FSFC，而在FSFC的CD4+T细胞数据中，由于数据扩散超过了阳性信号的偏移，甚至无法对阳性信号进行设门分析。在B细胞和NK细胞群体中也观察到了类似趋势，CyTOF显示出更高的刺激与未刺激信号比。
结果二：在转录因子检测上，CyTOF同样展现出更高的信噪比
通过对比检测FoxP3、T-bet和TOX等转录因子，研究发现两者对FoxP3的检测结果相似。然而，对于T-bet和TOX，CyTOF样本在CD4+和CD8+T细胞中均表现出更优的信号分辨率。T-bet与TOX的双变量图显示，CyTOF数据能清晰区分血液T细胞中的双阳性群体，而FSFC数据则不能。
结果三：CyTOF可清晰检测FSFC难以分辨的IL-10和IL-13刺激特异性信号
在细胞因子检测方面，对于IFNγ、IL-5和IL-4，两种平台在阳性事件的出现和总阳性百分比方面结果总体相似。然而，IL-10和IL-13的信号检测在CyTOF和FSFC之间存在显著差异。CyTOF数据集能够清晰呈现低频但明确的刺激特异性IL-10+T细胞事件，而FSFC数据集在刺激与未刺激条件下的事件分布相似，使得IL-10+T细胞无法在检测背景水平之上被识别。同样，刺激后，CyTOF检测到的IL-13+CD4+T细胞频率远高于FSFC。
结果四：正交实验验证了CyTOF检测结果的准确性
为了验证CyTOF检测到的IL-10和IL-13阳性细胞频率的准确性，研究使用酶联免疫斑点(ELISpot)技术对相同供体的PBMC进行了正交验证。ELISpot结果明确检测到了刺激特异性的IL-10和IL-13分泌细胞，其频率与CyTOF数据集结果一致，从而证实了CyTOF检测信号的准确性，并表明FSFC显著低估了刺激特异性IL-10+和IL-13+细胞的数量。
结果五：高分辨率数据揭示稀有功能T细胞亚群
利用降维算法opt-SNE对CyTOF细胞因子数据集进行可视化分析，揭示了细胞因子共表达模式。由于CyTOF能高分辨率地检测IL-10等低频细胞因子，其数据成功揭示了具有广泛功能多样性的细胞群体。例如，研究明确观察到了同时产生IFNγ和IL-10的双阳性细胞群（即1型调节性T细胞， Tr1），以及同时产生IL-4、IL-5和IL-13的CD8+T细胞群（即2型细胞毒性T细胞， Tc2）。
讨论：技术优势与应用前景
本研究的头对头比较表明，在针对胞内读数（包括细胞因子、转录因子和磷酸化事件）的检测中，CyTOF工作流程产生的数据集展现出优于FSFC的信号分辨率。这种差异可能与两者检测原理的根本不同有关：FSFC测量的是嵌入在具有光学活性多层化学结构中的标记物，而CyTOF工作流程中的细胞被原子化，最终检测的是仅来自目标分析物的自由原子云，无信号丢失或本底来源。CyTOF技术在多重胞内检测方面提供了优越的替代方案，因为它始终表现出更佳的信号背景比。未来工作可聚焦于开发包含20个以上疾病相关胞内功能标志物的大型CyTOF检测组合。这种更深入、更广泛的功能分析，结合转录组学和代谢组学等其他组学数据，为实现个性化分子洞察和精准医学的目标提供了途径。
