用于RNA修饰分析的纳米孔直接RNA测序技术：工作流程评估及计算工具性能测试

《Advanced Biotechnology》：Nanopore direct RNA sequencing for RNA modification analysis: workflow assessment and computational tool benchmarking

　　**摘要**
近期测序技术的进步彻底改变了基因组和转录组复杂性的分析方法。在这篇综述中，我们全面介绍了Oxford Nanopore Technologies (ONT) 的技术，强调了其在实时、长读长和直接RNA测序方面的独特能力。首先，我们概述了ONT的核心分析流程——碱基检测、比对、信号修正和质量控制，并总结了每个阶段使用的主要计算工具。随后，我们详细阐述了多种RNA修饰检测技术，包括统计模型、机器学习和深度学习框架，以及结合大型语言模型的先进策略。为了评估这些方法的效果，我们在两个公开可用的数据集上对m6A和伪尿苷（Ψ）的修饰进行了额外的基准测试。测试结果显示，不同工具之间存在显著差异，这凸显了从ONT信号中可靠检测修饰的固有难度。我们进一步探讨了关键RNA修饰的生物学作用，并将基于ONT的方法与传统检测技术进行了对比。最后，我们讨论了测序错误率、数据和计算需求以及多修饰推断的复杂性等持续存在的问题，并提出了提高基于ONT的表观转录组研究中准确性、鲁棒性和生物学可解释性的未来发展方向。

**背景与测序技术代际演变**
过去几十年里，由于生物化学、分子生物学和计算分析领域的进步（Deamer等，2016；Shendure等，2017；McGinn和Gut，2013），测序技术经历了显著发展。通过三代不同技术的演变，人们不断努力提高测序通量、读长、准确性和成本效益，这些对于解决复杂的生物学问题至关重要（Estrada-Rivadeneyra，2017；Deamer等，2016；McGinn和Gut，2013）。

**第一代测序**
第一代测序技术由Sanger等人在20世纪70年代开创，主要依赖链终止反应和电泳分离来确定核苷酸序列（Estrada-Rivadeneyra，2017）（图1A）。尽管这种方法因其精确性和可重复性为现代基因组学奠定了基础，但其读长较短（通常<1000个碱基）且通量较低，因此不适用于全基因组测序等大规模项目（Estrada-Rivadeneyra，2017；Deamer等，2016；McGinn和Gut，2013）。

**第二代测序（NGS）**
第二代测序技术（NGS）引入了Illumina和Roche 454等平台，这些平台依靠循环可逆终止和大规模并行测序（McGinn和Gut，2013；Deamer等，2016；van Dijk等，2014），大幅提升了测序通量并降低了成本，推动了广泛的基因组学和转录组学研究（van Dijk等，2014；Kchouk等，2017；McCombie等，2018；Sagar，2019）（图1B）。然而，NGS技术的读长仍较短（约100–300个碱基），限制了对复杂基因组区域和重复序列的解析（McCombie等，2018；Xuan等，2013；Rodriguez和Krishnan，2023）。此外，依赖扩增方法可能会引入偏差，从而影响对表观遗传修饰的检测（Shendure等，2017；Kchouk等，2017；Amarasinghe等，2020）。

**第三代测序（TGS）**
第三代测序技术（TGS），尤其是Pacific Biosciences (PacBio)和Oxford Nanopore Technologies (ONT)，通过实现单分子、长读长测序（无需扩增）克服了这些限制（Cuber等，2023；McGinn和Gut，2013；Lin等，2021；Amarasinghe等，2020；PacBio，2020；Zhang等，2024a，b）。PacBio的单分子实时（SMRT）测序技术利用零模式波导和荧光碱基检测手段生成长而高保真的读长（Rhoads和Au，2015；Cuber等，2023）。ONT的纳米孔测序通过检测DNA或RNA分子通过纳米孔时的离子电流变化来实现实时、无标记测序，并能直接检测天然化学修饰，如5-甲基胞嘧啶（5mC）、N6-甲基腺苷（m6A）和伪尿苷（Ψ）（Seki等，2018；Cuber等，2023；Brown和Clarke，2016；Tamang，2025）。

**ONT纳米孔测序：分析流程与实用工具**
与第一代和第二代测序技术不同，TGS能够生成长达数十千碱基的读长（Zhang等，2024a，b；Tamang，2025）。其中，Oxford Nanopore Technologies (ONT)的纳米孔测序技术尤为突出，实现了长核酸分子的实时直接测序。过去十年中，ONT推出了多种性能提升、灵活性更高的设备（Lu等，2016；Brown和Clarke，2016）。代表性仪器包括便携式MinION（2015，图1C）、适用于小规模实验的Flongle适配器（2019，图1D）、高通量的PromethION（2018，图1E）以及能够同时运行五个MinION流动细胞的GridION（2017，图1F）。

同时，ONT的测序化学体系也经历了多次迭代。R9化学体系大约在2017年出现，R9.4.1版本自2019年起被广泛采用。2020年推出的R10系列在准确性和分辨率上有了进一步提升，后续版本（如R10.3和R10.4）进一步优化了性能（Zhang等，2024a，b；Wang等，2021）。最近，FLO-PRO004RA（RNA004）被开发用于高级测序应用（Zhang等，2024a，b）。图2总结了ONT化学体系和平台的发展历程。

**纳米孔测序的主要分析流程**
纳米孔测序的核心流程包括几个关键步骤：碱基检测、比对、信号修正和质量控制。这些环节通过整合计算框架和算法创新显著提高了数据准确性和处理效率。本节将详细介绍这些步骤的功能、常用工具、背后的方法学以及最新研究进展。

**2.1 碱基检测**
碱基检测是指当核酸聚合物通过纳米孔时，将原始离子电流信号转换为核苷酸序列的过程（OxfordNanoporeTechnologies，n.d.a，b，2021a，b；nanoporetech，2025a，b，c，d，e）。这一过程受到序列背景的影响，因为ONT平台通常会产生重叠的K-mer信号（nanoporetech，2025a，b，c，d，e；Wang等，2021）。当前的碱基检测工具可分为两类：一类使用ONT提供的软件（如Guppy、Nanonet、Bonito、Albacore、Scrappie），另一类为第三方工具（如Causalcall、SACall、MinCall）（图3A）。

早期碱基检测工具使用隐马尔可夫模型（HMM）来模拟信号变化，但在处理信号异质性方面表现有限（Wang等，2021）。2017年底，ONT推出的旗舰神经碱基检测工具Guppy引入了基于长短期记忆（LSTM）的循环神经网络（RNN），在处理离子电流变化时优于HMM（OxfordNanoporeTechnologies，2021a，b；Zhang等，2020；nanoporetech，2025a，b，c，d，e）。随后，ONT又推出了Nanonet、Albacore、Scrappie（nanoporetech，2020a，b）等工具，Guppy仍因GPU加速而保持较高的准确性和处理速度（Wick等，2019；nanoporetech，2025a，b，c，d，e）。开源工具Bonito采用卷积神经网络（CNN）实现快速碱基检测，准确率比之前的Guppy提高了超过1%（Wang等，2021；nanoporetech，2025a，b，c，d，e；OxfordNanoporeTechnologies，n.d.a，b；Loose等，2016；Wick等，2019；Xu等，2021）。其优化版本Fast-Bonito通过轻量级CNN架构和网络 pruning进一步提升了检测速度，在NVIDIA V100 GPU上相比Bonito快了53.8%（Wick等，2019；Pagès-Gallego和de Ridder，2023；Xu等，2021）。其他工具如PoreOver也通过改进减少了错误率（Xu等，2021；Silvestre-Ryan和Holmes，2021）。

第三方碱基检测工具也取得了进展，例如Mincall（Miculini?等，2019；He等，2016）和Causalcall（Zeng等，2020）分别采用了深度CNN和因果扩张CNN；SACall（Huang等，2020）和CATCaller采用了变换器编码器（Wu等，2020）；URNano（Zhang等，2020）结合了卷积U-net和RNN；Halcyon（Konishi等，2020）则运用了注意力机制构建了序列到序列的模型（Pagès-Gallego和de Ridder，2023）。综合比较表明，Bonito的架构优于其他六种工具。多拉多（Dorado）曾被证明可以达到约99.5%的原始读取准确性，即使在升级后的流式细胞仪和模型版本上也有更高的提升（Pagès-Gallego和de Ridder 2023；Wick等人2019；OxfordNanoporeTechnologies n.d.a, b, 2021a, b）。这些进步共同显著提高了ONT测序的准确性，使其成为一个在通量、精度和功能多样性方面可以与短读长测序技术相媲美的竞争平台。2.2 对齐对于长读长且易出错的纳米孔读长数据进行准确对齐对于许多下游应用至关重要，包括变异调用、结构变异发现、基因组组装和表观遗传分析（OxfordNanoporeTechnologies 2021a, b；Wang等人2021；Sahlin等人2023）。鉴于纳米孔读长的独特特性——即长度可变、错误率高（特别是在插入和缺失的情况下）以及存在修饰碱基——开发稳健的对齐算法一直是该领域的研究重点（Wang等人2021；OxfordNanoporeTechnologies n.d.a, b；Seki等人2018；Sahlin等人2023）。图3B标记了几个对齐工具的里程碑。GraphMap（isovic 2016）是最早的针对纳米孔的比对工具之一。它引入了一种有间隙的q-gram播种策略，可以加快搜索速度，从而提高对插入/删除和错配的敏感性，尤其是在噪声区域。基于MinION数据的评估显示，GraphMap工具的碱基映射敏感性分别提高了10-80%和超过95%（Sahlin等人2023）。后来的创新包括大约在2018年出现的Minimap，以及Minimap2的引入（Li 2022；Sahlin和M?kinen 2021；Li 2018），由于其出色的速度和多功能性，它已成为长读长测序中广泛使用的比对工具（Li 2018）。它通过使用分割读长比对超出了早期的比对工具，以相当的准确性水平提供了3-4倍的速度（Li 2018）。此外，Minimap2还支持DNA和长mRNA的对齐，使其适用于基因组组装和转录组分析。还有更多工具得到了改进，例如2021年推出的uLTRA，它作为一个包装器围绕Minimap2来比对注释区域外的读长（Sahlin和M?kinen 2021；Sahlin等人2023）。新开发的算法的进一步采用促进了对Graphmap2（lbcb 2020；OxfordNanoporeTechnologies 2019）的改进，在相同的模拟或真实数据集下，它实现了更高的可映射性以及识别更多的外显子及其末端（Sahlin等人2023；OxfordNanoporeTechnologies 2019）。2018年，Sedlazeck等人引入了一个名为NGMLR的长读长比对工具（philres 2018）和一种名为Sniffles的结构变异识别方法（Sedlazeck 2025）。这些方法通过自动过滤错误事件和低覆盖率数据操作，有助于降低长读长的成本，在临床或人类健康相关应用中非常有用。2022年发布的Winnowmap2利用了最小置信度可对齐的子序列，并对重复序列中的结构变异具有更高的容忍度和对旁系同源序列特异性变异的更高敏感性（marbl., 2021；Jain等人2022）。根据性能评估，Winnowmap2的假阴性和假阳性率最低（分别为1.89%、1.89%），相比之下Minimap2为39.62%、5.88%，NGMLR为56.60%、36.11%（Jain等人2022）。这些比对工具突显了速度、敏感性和信号识别之间的权衡。Minimap2仍然是一个强大且通用的比对工具，在各种应用中平衡了性能和资源使用（Li 2018）。GraphMap2作为一个敏感的比对工具，与之前的GraphMap和MiniMap2相比，在可映射性方面有了显著改进（Li 2018；OxfordNanoporeTechnologies 2019）。像NGMLR和Sniffles这样的工具处理结构变异（philres 2018；Sedlazeck 2022），而Winnowmap2在重复参考序列方面表现卓越（Jain等人2022）。2025年关于Uncalled4的最新发现也在信号对齐方面取得了重大突破，提供了一种快速准确的方法，从而相应地改善了DNA和RNA的修饰过程（Kovaka等人2025）。2.3 重新调整这一步骤涉及将原始信号与参考序列对齐，进一步细化和检测碱基级别的修饰。例如，Nanopolish工具使用HMM和甲基化与未甲基化模型之间的统计比较来检测5mC，并将这种方法扩展到人类DNA（nanoporetech 2020a, b；Simpson等人2017）。此外，像Tumbo（OxfordNanoporeTechnologies 2017a, b；nanoporetech 2020a, b）这样的工具将原始电流信号重新映射到基因组位置，通过统计偏差从预期电流水平来识别碱基修饰（nanoporetech 2020a, b）。类似的工作工具Remora也能进行分析，并能够以高效率预测甲基化碱基（OxfordNanoporeTechnologies 2021a, b；nanoporetech 2024a, b）。具体来说，Tumbo通过一个五阶段流程执行此重新调整操作，包括映射、标准化、事件检测、序列到信号分配和碱基跳跃解析（OxfordNanoporeTechnologies 2017a, 2017b）（图3C）。基因组映射的初始步骤是将之前的核苷酸序列与参考基因组对齐，以建立一个基础坐标系统，这可以通过Minimap2等工具实现。第二个信号标准化步骤将原始离子电流信号标准化，以减少实验变异性和系统偏差，Tumbo在事件检测的第三阶段进一步使用变化点检测算法来识别事件。然后，Tumbo采用动态规划技术进行优化的序列到信号分配，并在最终的解析跳跃碱基部分应用特殊程序来处理分段不足或噪声区域。虽然这代表了Tumbo的特定实现，但大多数重新调整工具采用了类似的概念性工作流程，尽管在算法细节或软件设计上存在一些差异。2.4 质量控制强大的质量控制（QC）对于确保生成的测序数据满足可靠下游分析所需的准确性和完整性标准至关重要。图3D中展示了预对齐和后对齐QC工具的示例。像NanoPlot（Coster 2025）这样的工具能够可视化读长分布和碱基调用质量得分，而pycoQC（Leger和Leonardi 2019）可以生成交互式摘要和准备QC指标。此外，Porechop ABI（bonsai., 2022）专门用于检测适配子和条形码序列，而Nanop的修剪和过滤工具（esteinig. GitHub - esteinig, nanoq 2023）也可用于ONT读长。还有更多工具如MinIONQC（roblanf., 2020）以其快速且轻量级的脚本而闻名，能够快速且可重复地比较来自多个流式细胞仪的数据，ToulligQC也可以适应DNA和RNA序列，并且兼容1D2运行（Genomique 2022；GenomiqueEns 2024）。总体而言，纳米孔测序分析流程已经发展成为一个复杂的框架，得到了持续的算法和软件创新的支持。这些社区驱动的发展稳步提高了准确性和可扩展性、稳定性以及在广泛应用中的可用性。3 使用各种建模框架的纳米孔测序进行RNA修饰检测先进框架的出现——特别是统计工具、机器学习（ML）、深度学习（DL）和基于Transformer的LLM——从根本上改变了基于纳米孔测序的修饰检测，实现了对修饰碱基的实时、准确检测和复杂分析（Wang等人2024, 2021；Petersen等人2019）。代表性工具的汇总可以在表1和补充表2中找到。表1总结了常用的纳米孔（ONT）RNA修饰检测方法及其使用的模型类型（Wang等人2021）。许多工具，如Tombo（nanoporetech 2020a, b；OxfordNanoporeTechnologies 2017a, b）、Nanocompore（Leger 2019）、xPore（GoekeLab 2021；Pratanwanich等人2021）和DiffErr（bartongroup., 2020），采用了聚类技术或统计测试规则进行RNA修饰检测。Bayesian生成模型是Nanocompore、xPore和Yanocomp的主要建模设计，其中高斯混合模型（GMM）发挥了重要作用（Zhao等人2022）。此外，Differr（bartongroup., 2020）和Drummer（Abebe等人2022）采用了基于差异测试方案的G-tests，而ELIGOS（Jenjaroenpun等人2020）进行了Fisher精确测试，比较了直接RNA测序（DRS）修饰组和对照组的数据集（Furlan等人2021；Zhao等人2022）。除了统计方法外，一些模型还学习了ML或DL结构来识别RNA修饰，如Nanom6A（Gaoyubang., 2025）、EpiNano（Liu等人2021；enovoa., 2025）、MINES（YeoLab 2019）和m6Anet（GoekeLab 2023）。具体来说，Nanom6A使用极端梯度提升（XGBoost）模型在单碱基分辨率下检测m6A修饰（Gaoyubang., 2025；Gao等人2021），而m6Anet是一个基于神经网络（NN）的结构，用于分析全转录组的m6A定量和识别，准确性更高（GoekeLab 2023；Simpson等人2017）。此外，MINES方法利用随机森林（RF）在四种序列（AGACT、GGACA、GGACC和GGACT）的背景下检测m6A位点（Lorenz等人2019；YeoLab 2019），而EpiNano工具引入了支持向量机（SVM）来区分修饰碱基如m6A（Liu等人2021；enovoa., 2025；Gao等人2021；Simpson等人2017；Liu等人2019a, b）。此外，NanoDoc应用了CNN和深度单类分类（DOC）（Ueda 2020），而改进的NanoDoc2通过结合NN和聚类算法来检测多种RNA修饰（uedaLabR 2021）。此外，mAFiA（dieterich 2024a, b）和Ψ-co-mAFiA（dieterich 2024a, b）专注于m6A和Ψ，使用基于RODAN的神经网络（Chan等人2024），而SingleMod（Xieyy 2025；Xie等人2025）应用了多实例回归（MIR），RedNano（Derryxu., 2025；Ni等人2024）利用深度残差网络进行m6A检测。许多工作特别关注m6A，包括基于NN设计的m6ATM（Yu等人2024）（Furlan等人2021），DENA和CHEUI（comprna., 2021）强调纳米孔DRS（Zhao等人2022），pum6a（Liu等人2025）采用了基于注意力的框架。此外，在检测其他修饰方面也取得了重大突破。DeepEdit（Chen等人2023）以其Inosine检测而闻名，而TandemMod（Yulab., 2024）尝试了多种修饰的检测，如m6A、m5C、m7G、Ψ和Inosine，基于可传输的DL框架。Penguin（Janga 2021）应用了多种ML模型，包括SVM、NN和RF，在Hek293基准数据集中以93.38%的准确性检测Ψ位点（Janga 2021；Hassan等人2022）。同样，Nm-Nano（Janga 2023）中的两个监督ML模型XGBoost和RF表现出高准确性（XGBoost约88%，RF约92%）用于2′-O-甲基化（Nm）检测（Janga 2023；Hassan等人2024）。此外，NanoNM（kaifuchenlab., 2024；Li等人2024）检测Nm位点，m1a-prediction（Chen等人2024；BernieeeX., 2023）专注于m1A修饰，ModQuant（wanunulab 2022；Amr等人2024）使用ML架构识别Ψ位点。同时，像nanoRMS（novoalab 2022）这样的工具专注于Nm和Ψ RNA修饰，特别是使用无监督（即K-means聚类）和监督分类（即KNN：K最近邻）（novoalab 2022；Hassan等人2024；Begik等人2021）进行检测。此外，NanoMUD（Zhang等人2024a, b）使用双向长短时记忆（BiLSTM）进行Ψ和N1-甲基伪尿苷（m1Ψ）检测，而NanoPsu（Huang等人2021；sihaohuanguc 2021）和Psinanopore（Tavakoli等人2023；RouhanifardLab., 2025）也特别关注Ψ检测。最近，随着强大的深度学习框架的发展，如ModiDeC（mem3nto 2025；Alagna等人2025），多修饰检测受到了越来越多的关注，这些框架能够识别多种修饰，如m6A、Ψ、Gm、m1A和Inosine。与此同时，先进的RNANO（abhhba 2025；Wang等人2025）模型利用注意力增强的多实例学习来检测更广泛的修饰，包括m6A、m1A、m5C、m7G、ac4C、Nm和Ψ。一个值得注意的发展是基于碱基调用的高级修饰检测工具的出现，这些工具能够将修饰预测整合到碱基调用过程中。例如，m6ABasecaller（novoalab 2023；Cruciani等人2025）作为一种修饰感知的碱基调用模型，在碱基调用过程中能够生成m6A预测，从而实现对m6A沉积机制的高分辨率研究。同样，IL-AD（Wangziyuan 2023；Wang等人2024）框架通过增量学习（IL）和异常检测（AD）策略调整了碱基调用模型以进行修饰检测。此外，官方的ONT工具Dorado（OxfordNanoporeTechnologies 2024a, b；nanoporetech 2022）已经支持对m6A和Ψ的修饰碱基进行调用，并且正在持续努力扩展对其他修饰（如m5C、Nm和肌苷）的兼容性。由于存在大量的不同方法，可以考虑多种条件和标准来寻找最适合特定检测任务的方法。例如，一些框架是基于体内数据集进行训练的（例如，MINES、m6Anet、NanoMUD），而其他框架如Nanom6A、Psinanopore和TandomMod则使用体外数据。这种谨慎的选择可能取决于分析的重点，要么是更能在体内环境中反映的天然生物学背景，要么是在受控体外试验中设计的序列。此外，实际应用性通常取决于是否存在阴性对照，这意味着像Nanocompore、DiffErr、DRUMMER、Psinanopore这样的方法在没有匹配对照的情况下本质上不具备比较性。同样，输出格式也应根据研究目标进行定制，如m6Anet、NanoMUD、NanoMUD可以提供定量的修饰率估计，而其他方法只能提供二进制测量结果。此外，特征设计可能因框架而异，许多框架使用信号级别的摘要（即平均值、标准差和停留时间），而像PsiNanopore这样的框架则依赖于U-to-C不匹配，这属于碱基调用错误（BSE）特征。最后，必须考虑计算需求，其中深度学习（DL）尤其是通过大型语言模型（LLM）增强的流程通常需要大量的GPU资源，而在资源有限的设置中，一些较轻的统计方法似乎更加可行。这些工具的实际效用体现在多个生物学应用中。例如，Price等人使用DRUMMER和Nanocompore工具来识别m6A位点，并进一步证明m6A甲基化可以提高腺病毒晚期转录单元中的剪接效率（Price等人，2020年）。此外，m6Anet框架还用于检测特定等位基因的m6A修饰（Park和Cenik，2024年）。此外，NanoMUD被应用于预测RNA Ψ和m1 Ψ修饰，并有助于设计和质量控制化学修饰的mRNA疫苗（Zhang等人，2024a，b）。总的来说，这些例子强调了如何有效地利用多样化的计算方法来探索不同的生物学问题并研究RNA修饰领域的机制见解。

总体而言，这些框架或设计，从最初的基于统计或隐马尔可夫模型（HMM）的试验到进一步的机器学习（ML）或深度学习（DL）添加的模型，以及最近的预训练LLM应用，在复杂的生物学场景下逐步经历了技术或生物医学革命（Ji等人，2021年；Wang等人，2021年）。这些创新显著提高了碱基修饰分析的敏感性、可扩展性和可解释性，这可能为更全面、准确和成熟的纳米孔测序世界打开大门（Wang等人，2021年）。

为了系统评估目前计算工具在纳米孔测序数据中检测RNA修饰的性能，我们专门针对m6A进行了一次基准分析。五种代表性的检测工具——m6Anet、MINES、nanom6A、DRUMMER和DiffErr——被独立应用于两个公开的人类转录组数据集：HEK293_WT和HMEC_WT（WT：野生型）。这些RNA样本来自GEO，访问号为GSE132971。只包括了常见的染色体，即Chr1-22、ChrX、ChrY和ChrM，并使用0.5的概率作为分界值。为了标准化比较，我们采用了基于NGS的基准数据库作为参考标准（Zhang等人，2022a，b）（补充表3），该数据库汇总了来自9种不同NGS平台的转录组范围内的m6A位点，分辨率为单碱基。根据不同技术记录的次数，m6A位点被分为四个置信水平：高置信（1,243个位点；支持≥4次）、中等置信（6,792个位点；支持3次）、低置信（26,297个位点；支持2次）和非常低置信（99,357个位点；支持1次）。

在HEK293_WT中，我们评估了五种代表性检测工具识别的m6A位点的数量和分布。如图4A（“预测位点”列）所示，m6Anet识别出的m6A位点数量最多（n=36,688个），其次是MINES（n=35,870个）和nanom6A（n=30,337个）。相比之下，DRUMMER和DiffErr报告的位点数量较少，表明其检测更为保守。

为了进一步研究这些工具在HEK293_WT中的一致性和重叠情况，我们对五种模型进行了交叉分析（图4B）。其中，有5,088个位点被三种主要工具共同检测到（m6Anet、MINES和nanom6A），表明有一组可靠的预测结果。此外，m6Anet和nanom6A共同检测到了5,938个位点，m6Anet和MINES之间有3,862个位点重叠，而nanom6A和MINES之间有1,480个位点共存。为了在参考置信度的背景下评估检测性能，我们将HEK293_WT中的预测位点映射到基于NGS的基准数据库，并根据置信度将其分为四组。对于三种主要工具——m6Anet、nanom6A和MINES——相当比例的预测结果属于低置信度和非常低置信度组（图4A）。例如，m6Anet在低置信度组中检测到5,686个位点（15.5%），在非常低置信度组中检测到8,294个位点（22.6%）。类似地，nanom6A在低置信度组中识别出3,950个位点（13.0%）和6,613个位点（21.8%），在高置信度组中还有1,730个位点（5.7%）和479个位点（1.6%）。MINES分别产生了6,790个非常低置信度的匹配结果（18.9%），5,154个低置信度的匹配结果（14.4%），2,238个中等置信度的匹配结果（6.2%）和610个高置信度的匹配结果（1.7%）。相比之下，DRUMMER仅检测到36个位点，其中较高比例的匹配结果属于更高置信度的组别，特别是13个（36.1%）属于中等置信度组，12个（33.3%）属于高置信度组。DiffErr总共只报告了3个位点，其中2个（66.7%）属于高置信度组。此外，也有一些检测到的位点由于参考数据集中缺少注释而无法归类到任何置信度组。详细的模型混淆指标以及精确度、召回率和F1分数指标收集在补充表4中。

在HMEC_WT数据集上也进行了类似的分析，以评估工具在不同人类转录组背景下的性能。如图4C所示，m6Anet、MINES和nanom6A在预测m6A位点的总数方面再次表现优于其他工具，分别报告了26,143个、13,006个和23,639个位点。这些趋势与HEK293_WT中的观察结果大体一致，证实了这三种模型的广泛适用性和敏感性。DRUMMER和DiffErr仍然非常保守，在HMEC_WT数据集中只识别出23个和19个位点。HMEC_WT中的交叉分析（图4D）显示，m6Anet、MINES和nanom6A共同预测了2,806个m6A位点，略少于HEK293_WT中的5,088个位点。然而，在HMEC_WT中，有14个位点在四种主要工具中都被共同检测到，除了DiffErr，而且DiffErr在HMEC_WT中检测到的m6A位点数量（n=19）比之前的HEK293_WT数据集（n=3）更多。此外，m6Anet和nanom6A之间有5,422个位点重叠，m6Anet和MINES之间有1,215个位点重叠，nanom6A和MINES之间有716个位点重叠，进一步支持了这些工具之间的内部一致性。当HMEC_WT中的预测结果映射到基于NGS的参考数据库时，大多数工具的置信度组分布仍然偏向于较低置信度组。例如，m6Anet、MINES和nanom6A在非常低置信度组中分别识别出5,702个（21.8%）、2,377个（18.3%）和5,101个（21.6%）m6A位点，以及3,857个（14.8%）、2,265个（17.4%）和2,949个（12.5%）位点属于低置信度组。DiffErr尽管总预测数量有限，但在较低置信度组的比例仍然较高（非常低置信度组5个位点，26.3%；低置信度组2个位点，10.5%）。此外，DRUMMER在低置信度组和中等置信度组中也保持了较高的匹配比例（低置信度组8个位点，34.8%；中等置信度组5个位点，21.7%）（图4C）。同样，在应用这种置信度分类时也不可避免地会出现一些NA值。额外的混淆变量和其他评估要素显示在补充表5中。此外，补充图1A展示了重叠和非重叠预测m6A位点的比例。低置信度组和非常低置信度组的重叠百分比较高，m6Anet在三种主要模型（m6Anet、MINES和nanom6A）中实现了相对最多的真正阳性结果。一致地，非常低置信度组占总位点的74.3%，在NGS参考中占主导地位（补充图1B），详细的精确度和召回率曲线也显示在补充图1C中。

总体而言，m6A基准分析的结果揭示了不同工具之间的显著检测差异。这样的差异在其他修饰或场景中也普遍存在，这强调了进一步的方法学改进的必要性，如检测精度、模型稳健性和工具间的一致性。

为了系统评估纳米孔测序数据中伪尿苷（Ψ）检测的性能，我们还重点关注了三种代表性算法——Penguin、Nanomud和Nanopsu。这些工具被独立应用于HEK_WT数据集进行基准分析，分析中只考虑了常见的染色体（Chr1–22、ChrX、ChrY和ChrM）。与m6A类似，Ψ也有一个基于NGS的参考数据集（https://rna.sysu.edu.cn/rmbase3），可以从其中提取相应的位点信息。根据图5A，不同工具预测的Ψ位点总数差异很大，其中Nanomud识别出的数量最多（n=82,581），其次是Nanopsu（n=10,979）和Penguin（n=13,661）。为了进一步评估与基于NGS的参考数据的预测可靠性，所有工具与NGS的位点重叠比例都非常有限，Nanomud为57个位点（0.1%），Nanopsu为31个位点（0.3%）。此外，图5B显示了交叉分析结果，其中模型之间的重叠非常少，只有396个位点被Nanomud和Nanopsu共同识别。

在HMEC_WT数据集方面，Penguin识别出的Ψ位点数量最多（n=644,248），其次是Nanomud（n=32,139）和Nanopsu（n=4,579）。当这些预测结果映射到基于NGS的参考数据库时，所有工具的重叠位点比例仍然非常有限：Penguin为74个位点，Nanomud为33个位点（0.1%），Nanopsu为16个位点（0.3%）（图5C）。在Ψ的交叉分析中，Penguin和Nanomud有1,281个位点共同识别，而Nanopsu与Nanomud有82个位点共同识别，并且只与Penguin有一个位点重叠（图5D）。Ψ基准的详细指标显示在补充表6中。这些发现揭示了NGS和纳米孔检测工具之间的显著差异，Ψ识别的不一致性甚至比m6A修饰更为明显。因此，这种显著的缺乏共识突显了NGS和纳米孔检测算法在Ψ识别方面的差异，进一步强调了提高工具间一致性和方法学精细化的必要性。

6.1 不同类型修饰的生物学意义
核酸的化学修饰，无论是对于RNA还是DNA，都在调节基因表达和维持细胞稳态中起着关键作用。其中，m6A被认为是真核生物信使RNA（mRNA）中最常见的内部修饰。它调节诸如剪接、核输出、翻译和mRNA稳定性等关键过程，从而影响干细胞分化、昼夜节律和肿瘤发生（Jiang等人，2021年）。m6A及其相关蛋白质的失调已被发现与多种疾病有关，包括非酒精性脂肪肝病、无精症（Chen等人，2020年）、心力衰竭（Berulava等人，2019年）和多种癌症（例如，急性髓系白血病（AML）、脑肿瘤、生殖系统恶性肿瘤（Liu等人，2020年），这突显了其作为治疗靶点的潜力（Jiang等人，2021年）。除了人类系统外，对拟南芥、水稻、棉花和番茄等物种的研究也表明m6A在调节基因表达中充当“写入者”和“擦除者”的角色（Cai等人，2024年），强调了m6A在植物适应非生物胁迫中的重要作用。重要的是，这些见解可以为作物改良开辟新的途径，因为针对m6A的基因组和转录组工程可以通过精确的修饰检测和操作来开发耐逆境的植物品种（Cai等人，2024年）。除了m6A之外，其他RNA修饰也可能发挥重要作用。例如，m5C已被证明能够作为核输出调节剂和蛋白质翻译调控因子，其在mRNA中的分布会对mRNA的功能产生不同的影响（Trixl和Lusser，2018年；Schümann等人，2020年）。此外，m7G与内部的m6Am一起，已被发现与人类疾病中的全局RNA可变剪接调控有关（Qiu等人，2023年；McGinty等人，2008年）。另外，Ψ修饰还被证明可以增强RNA稳定性，调节转录动态，并改善碱基堆叠。同样，m1A也被报道能够通过破坏沃森-克里克碱基配对来影响mRNA的结构稳定性，并通过改变mRNA 5’UTR区域的二级结构来增加翻译机制的 accessibility（Qiu等人，2023年）。

6.2 修饰检测策略的比较评估
核苷酸修饰的检测方法已经从基于测序的方法和非基于测序的方法中发展而来。非基于测序的技术——包括二维薄层色谱（2D-TLC）、点印迹和液相色谱-质谱（LC–MS）——能够准确量化修饰，但缺乏序列特异性信息（Zhang等人，2022a, b）。具体来说，2D-TLC根据核苷酸在溶剂中的不同移动度进行区分，只需要少量RNA（通常为50-200 ng），因为它具有高灵敏度（Zhang等人，2022a, b；Pob?ocka-Olech等人，2025年）。点印迹检测依赖于特定于修饰的抗体，已广泛应用于多种RNA类型，如非编码RNA和mRNA（Zhang等人，2022a, b），尽管这种方法缺乏绝对定量和位点信息（Zhang等人，2022a, b）。相比之下，LC–MS已成为RNA修饰检测和量化的标准技术，尽管需要高性能液相色谱（HPLC）与质谱结合的复杂仪器（Zhang等人，2022a, b；Manasses等人，2018年）。
下一代测序（NGS）方法，包括著名的Illumina平台，依赖于多种策略来推断RNA修饰位点。这些方法包括基于抗体的方法（例如，MeRIP、miCLIP-seq、hMeRIP、acRIP-seq、m6Am-seq）、化学辅助方法（例如，BoRed-seq、ICE-seq、m6A-SEAL-Seq、RBS-seq）、酶/蛋白质辅助技术（例如，AZA-IP、DART-seq、MAZTER-seq）以及直接测序方法（例如，MeTH-seq、m1A-quant-seq），以间接实现全转录组的分析（Zhang等人，2022a, b；Xuan等人，2013年）。最近，基于NGS的先进方法在RNA修饰映射的准确性和定量能力方面取得了显著进步，两个代表性例子是GLORI（甘油醛和亚硝酸盐介导的非甲基化腺苷脱氨基）和eTAM-seq（改进的TadA辅助的N6-甲基腺苷测序）。在GLORI（Sun等人，2025年）中，未修饰的腺苷被选择性地脱氨基为肌苷（在逆转录过程中读作鸟嘌呤），而m6A保持不变，继续以腺苷的形式被读取，从而进一步实现了单碱基分辨率下的无偏倚和绝对定量（Sun等人，2025年；Liu等人，2023年）。尽管GLORI的成本相对较高（与MeRIP等富集方法相比，Liu等人，2023年），但它显示出显著更高的分析准确性和重复性。同样，eTAM-seq（shunliubio 2022）通过TadA辅助机制进行全局腺嘌呤脱氨基，允许检测到作为持久腺苷存在的m6A，同时未甲基化的腺苷相应地转化为肌苷（Xiao等人，2023年）。这种酶辅助策略提供了对m6A的高度特异性检测和定量评估，即使是从非常有限的RNA输入样本中也是如此（Xiao等人，2023年）。
尽管不同类型的基于NGS的检测技术被广泛用于全转录组分析，但它们的短读长限制（通常为50-300 bp）和间接检测机制可能会限制RNA修饰景观的全面表征（Zhang等人，2022a, b）。相比之下，第三代SMRT测序（PacBio）可以通过监测聚合酶动力学来识别修饰，而无需进一步的样本处理（Rhoads和Au，2015年）。这种方法可以直接检测5mC和6mA等修饰，并且即使在高度重复的基因组区域也能解析甲基化模式（Flusberg等人，2010年）。同样，ONT平台通过测量分子通过生物纳米孔时的离子电流波动来进行直接长读长测序，这比其他修饰检测方法具有几个独特优势。具体来说，与通常特定于修饰且间接的非基于测序工具不同，纳米孔测序能够以单核苷酸分辨率直接实时检测修饰（Zhang等人，2022a, b；Garalde等人，2016年；Burgess 2017年）。与需要额外逆转录和PCR扩增的NGS技术（如Illumina）相比，纳米孔测序可以以直接的方式进序，并减少由此产生的偏差（Zhang等人，2022a, b）。此外，包括NGS在内的短读长测序需要RNA片段化，导致多映射问题和异构体模糊性，而纳米孔长读长测序可以捕获全长转录本并实现精确的异构体识别和定量（OxfordNanoporeTechnologies 2024a, b）。此外，与PacBio SMRT测序相比，ONT方法支持更广泛的修饰类型，并能够进行单分子原始RNA分析，使其特别适合于全面的表观遗传和表观转录组研究（Flusberg等人，2010年；Stephenson等人，2022年；Garalde等人，2016年）。

6.3 基于碱基 calling 的修饰检测方法评估
也进行了一些基于碱基 calling 的修饰检测策略，如Dorado、m6ABasecaller、IL-AD等，这些方法也显示出不同的优势。例如，这些模型可以完全独立地对每个读取进行预测，无需额外的统计测试或计算（Cruciani等人，2025年；Wang等人，2024年；Begik等人，2021年）。此外，RNA修饰在碱基 calling 步骤中直接被检测到，可能绕过了计算密集型过程，如重新配对、特征提取和事后统计分析（Cruciani等人，2025年；Wang等人，2024年；Begik等人，2021年；Acera Mateos等人，2022年）。重要的是，在大多数情况下，这些策略无需对照样本，并且不受特定k-mer或先前知识模式的限制（Cruciani等人，2025年；Wang等人，2024年），使得它们可以在多样化的数据集上更广泛地应用。
尽管这些基于修饰的碱基 calling 策略具有巨大的潜力，但其发展可能会面临一些重大挑战，主要是由于缺乏足够的高质量训练数据集，这些数据集中需要明确标记修饰状态（Cruciani等人，2025年）。具体来说，这些有效的模型需要包含精确的地面真实注释的训练数据，以指示特定核苷酸位置上的修饰是否存在（Cruciani等人，2025年）。除了位置信息外，还需要有与修饰相对应的读长信息，以确保每个读取的准确标记（Cruciani等人，2025年）。这些相对严格的要求可能会构成重大障碍，使得这类模型的开发和构建特别困难。

7 基于纳米孔的修饰检测的挑战和未来方向
尽管纳米孔测序具有革命性的潜力，但一些技术和分析挑战可能会限制其更广泛的应用，然而这些挑战也为未来的创新指明了方向。主要的一个限制在于准确识别复杂的、重叠的和多重修饰（Warburton和Sebra 2023年；Petersen等人，2019年），这些修饰往往会在离子信号中产生微妙的、依赖于上下文的扰动，使用传统模型难以解决（Petersen等人，2019年；Amarasinghe等人，2020年）。尽管像TandemMod（Yulab., 2024）这样的先进框架已经结合了迁移学习和从头训练来支持多重修饰的检测，但不同碱基类型和复杂序列背景下的信号變异性仍然是一个重大障碍（Yulab., 2024；Wu等人，2024年）。另一个持续的挑战是纳米孔技术的相对较高的测序错误率。尽管有各种提高准确性的尝试，包括自适应碱基 calling 或改进的孔化学，但Illumina短读长测序的基准错误率（0.1–1%）似乎难以通过我们的ONT方法实现（Zhang等人，2022a, b；Wang等人，2021年）。由于一些计算流程是从碱基 calling 的差异或信号偏差中推断修饰的，因此这种内在的错误水平可能会相应地妨碍可靠的修饰识别（Zhang等人，2022a, b）。此外，基于ONT的DRS的实际限制在于相对较大的RNA输入需求，这对于获得稳健的通量和信号质量是必要的（Zhang等人，2022a, b）。根据官方ONT文档，SQK-RNA002（OxfordNanoporeTechnologies 2018）工作流程建议使用50 ng的poly(A)尾RNA或9 μL中的500 ng总RNA，而更新的SQK-RNA004（OxfordNanoporeTechnologies 2023a, b）协议则指定使用300 ng的poly(A) RNA或8 μL中的1 μg总RNA进行材料准备。这些输入要求可能对低输入样本（如临床活检、单细胞样本（Picelli 2016年；Huang等人，2018年）或某些早期发育标本（Olds等人，1973年）构成重大障碍，因为它们的RNA产量有时仅在纳克甚至亚纳克范围内。除了输入限制之外，成本效益和计算需求也是一个主要问题。例如，纳米孔RNA测序的通量相对较低（每个流动单元1-3 Gb），而直接RNA测序的高成本以及确保准确修饰检测所需的高覆盖率（≥30X）（Leger等人，2021年；Pratanwanich等人，2021年）将进一步增加负担（Zhang等人，2022a, b）。同时，采用先进的计算模型——通常需要高端GPU（Loose等人，2016年）、大量内存和较长的训练时间——进一步增加了基础设施需求，这对某些实时和临床应用构成了挑战（Wang等人，2021年；Liu等人，2019a, b；Pagès-Gallego和de Ridder 2023年）。尽管如此，这些持续的挑战促进了方法学的快速发展，未来的发展预计将集中在减少输入需求、改进孔化学和增强信号处理方面，以实现更高的准确性和灵敏度，特别是对于稀少或临床来源的RNA样本。多路复用的采用可能通过合并多个RNA制备部分缓解输入限制，尽管这种方法可能会降低每个样本的测序产量。最近的方法学进展表明DRS多路复用的技术可行性，这可能在一定程度上平衡通量和输入（van der Toorn等人，2025年；Smith等人，2020年）。与此同时，实现低输入和无扩增的协议，结合改进的接头设计或优化的马达蛋白，也可能大大扩展基于纳米孔的表观转录组研究的可访问性（OxfordNanoporeTechnologies 2023a, b）。
同样有前景的是朝着实时分析的改进，其中包含修改意识的框架旨在重塑纳米孔测序领域。诸如SquiggleNet这样的工具已经实现了实时分子分类和选择性测序，允许用户移除不需要的分子（Bao等人，2021年）。同样，Sigmap通过将参考基因组转换为信号并实现实时映射取得了突破（haowenz., 2020年）。这些进步通常伴随着GPU加速的计算和改进的检测技术，已经在开发中，该领域的持续进步将有望促进测序和时间高效框架的更广泛应用（Wang等人，2021年；Bao等人，2021年）。同时，正在进行的算法进展也在扩展纳米孔平台可检测的修饰谱。早期的努力主要针对普遍存在的m6A和5mC，而最近的方法，包括Remora、Penguin和TandemMod，已经开始探索更广泛的碱基，如Ψ、肌苷和m7G（OxfordNanoporeTechnologies 2022；Hassan等人，2022年；Yulab., 2024年）。这种能够在单次测序运行中同时检测多种修饰的能力将为全面的表观遗传和表观转录组分析带来有希望的方向（Wang等人，2021年）。这种进步可能会通过模型的发展得到促进，特别是通过集成大语言模型（LLM）和基于机器学习/深度学习（ML/DL）的架构来捕获复杂的信号模式和序列上下文（Wang等人，2021年；Zhang等人，2022a, b）。例如，通过有机结合多个框架的集成学习、针对罕见或新出现样本的迁移学习，以及关于异常检测的无监督/半监督学习（Wang等人，2021年；Shendure等人，2017年；Wu等人，2024年），可能会成为未来创新的前沿和焦点。

8 总结
本综述追溯了测序技术的发展，从第一代Sanger方法和NGS短读长平台到TGS长读长系统，特别强调了ONT策略，该策略实现了直接、实时和单分子测序。随后，纳米孔测序的核心分析流程被详细解析，重点介绍了工作流程每个阶段中常用的工具和方法。此外，我们调研了一系列用于通过纳米孔测序检测RNA修饰的计算框架，这些框架涵盖了统计方法、机器学习（ML）和深度学习（DL）模型，以及结合了变换器和注意力机制的新型架构。进一步进行了基准测试分析，其中包括5种检测m6A修饰的工具和3种检测Ψ修饰的工具，分别针对HEK293_WT和HMEC_WT细胞系进行实验，发现不同检测工具之间存在显著差异。接着，我们阐明了特定核苷酸修饰的功能意义，并对比评估了现有的检测策略，同时明确强调了ONT（纳米孔测序技术）所具有的优势。除了指出当前的技术挑战外，我们还探讨了未来的研究方向，这些方向有望实现更全面、更准确的修饰谱型分析，并进一步提升纳米孔测序的技术性能和应用范围。