单独及联合使用超声波与酶处理方法对大豆残渣（okara）纤维的改性研究：对其结构、物理化学性质及功能特性的影响

《Ultrasonics Sonochemistry》：Individual and combined ultrasonic–enzymatic treatments for modifying soybean residue (okara) fiber: impacts on structure, physicochemical, and functional properties

　　崔杰|刘丹丹|郭莉|陶海腾|高伟|崔波
山东工业大学食品科学与工程学院，健康食品资源开发与创造山东省重点实验室，生物基材料与绿色造纸国家重点实验室（山东省科学院），济南，山东250353，中国

**摘要**
本研究探讨了超声波处理、酶处理以及超声波-酶联合处理对大豆残渣（豆渣）膳食纤维（DF）的结构、理化性质和功能特性的影响。在最佳的超声波-酶联合处理条件下，改性豆渣DF的可溶性膳食纤维（SDF）产量和持水能力（WHC）分别提高到8.00 ± 1.04 g/100 g和14.88 ± 0.29 g/g，相比未改性的豆渣DF分别提高了193.04%和40.11%。结构分析显示，改性后的豆渣DF颗粒尺寸减小，粒径分布更加均匀，微观结构中的皱纹、空洞和破碎现象得到改善。理化性质也有所提升（p < 0.05），其中WHC、持油能力（OHC）和膨胀能力（SC）分别增加了40.11%、82.81%和40.19%。此外，联合处理的效果优于单一处理方法，胆固醇和胆盐的吸附能力分别提高了4.82倍和10.07倍，DPPH和羟基自由基的清除活性分别提高了1.35倍和7.78倍。这些改善归因于结构变化，包括颗粒尺寸减小、比表面积增加、功能基团暴露以及结晶度降低，这些因素共同提升了豆渣DF的功能性能。总体而言，本研究突显了超声波-酶联合处理的协同优势，并为豆渣DF的高值化利用提供了理论和技术支持。

**1. 引言**
中国是全球最大的大豆制品生产国之一。大豆残渣（通常称为豆渣）是提取大豆蛋白过程中产生的主要副产品。由于其高水分含量和易受微生物污染的特性，大量豆渣被丢弃或用作低价值饲料，导致资源利用不足和环境负担加重[1]。然而从营养角度来看，豆渣富含膳食纤维（DF）、高质量蛋白质、寡糖和生物活性成分，其中DF占干物质的60%以上[2]。因此，提高豆渣的附加值利用对于促进大豆深加工副产品的可持续和综合利用至关重要。

膳食纤维因其对健康的诸多益处而广受认可，包括促进肠道蠕动、调节血脂和血糖以及支持有益肠道菌群[3]。然而，天然豆渣DF由于含有高度交联的细胞壁多糖（如纤维素、半纤维素和木质素），通常具有较差的持水能力、有限的溶解性和紧凑的微观结构，导致功能性能不足[4]。这些内在结构限制了其在高价值食品系统中的应用。因此，开发有效的改性技术以调整豆渣DF的结构和功能具有重要的研究和工业价值。

已有多种改性技术被用于提升DF的功能性，尤其是使用纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶等碳水化合物酶[5]。这些酶能够选择性水解糖苷键，破坏坚硬的细胞壁结构，从而增加可溶性膳食纤维（SDF）的比例，并暴露更多亲水基团，进而改善其持水和吸油等性能[5]。例如，刘等人[6]使用蜗牛酶改性小麦麸皮DF，发现纤维素和半纤维素的酶解显著提高了其持油能力、葡萄糖吸附能力和抗氧化活性。然而，单独使用酶处理的效率可能受到传质阻力和底物可及性的限制。超声波处理作为一种有效的物理手段，已被广泛认可为能够改变DF结构组织的工具[7]。超声波会产生强烈的空化作用、剪切力和微湍流，从而破坏密集的细胞壁网络，减小颗粒尺寸，增加表面积，并促进水分吸收[8]。李等人[9]证明超声波处理改变了玉米麸皮DF的单糖组成，提高了其持水能力（WHC）、持油能力（OHC）和抗氧化活性。最近，超声波-酶联合改性作为一种绿色高效的方法逐渐受到关注。超声波和酶之间的协同效应增强了底物的可及性，提高了酶-底物相互作用效率，从而提高了改性的速率和程度。尽管超声波和酶处理都已应用于DF改性，但关于豆渣DF协同改性的系统研究仍较为有限，特别是对其结构变化及其相关功能改善的全面了解仍然不足。

因此，本研究的目的是全面探讨超声波和酶处理对豆渣DF的结构、理化性质和功能特性的单独及联合影响。通过SDF含量和WHC评估了不同处理的改性效果。利用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和热分析技术表征了每种处理引起的结构变化。此外，还评估了关键理化性质（如WHC、OHC和SC）以及功能性质（如抗氧化活性、葡萄糖吸附能力和胆固醇吸附能力）。系统分析了这些结构变化与关键理化性质和功能性质之间的关系，并进一步探讨了超声波和酶处理之间协同作用的机制。总体而言，本研究为豆渣DF的高值化利用提供了理论支持和技术指导。

**2. 材料与方法**
2.1. 材料
豆渣购自山东玉鑫生物科技有限公司（中国山东）。α-淀粉酶（20,000 U/mL）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、来自阿斯佩尔吉尔斯菌的淀粉葡萄糖苷酶（100,000 U/mL）和纤维素酶（50 U/mg）购自上海源业生物科技有限公司（中国上海）。

2.2. 豆渣DF的改性
改性过程基于刘等人[10]报道的方法进行优化。将10 g干燥豆渣DF悬浮在去离子水中，固液比为1:30（w/v），磁力搅拌30分钟。加入耐热α-淀粉酶（250 μL）在95°C下水解35分钟，随后依次加入碱性蛋白酶（1.5 mg）和葡糖淀粉酶（20 μL，pH调整至4.6），在60°C下分别水解30分钟。每次水解后，将酶在100°C下失活。将处理后的混合物在5000 × g下离心20分钟，沉淀物用去离子水洗涤五次后冷冻干燥得到不可溶性膳食纤维（IDF）。上清液与四倍体积的无水乙醇混合12小时进行沉淀，然后通过吸滤和干燥得到SDF。

2.3. 超声波处理、酶处理及超声波-酶联合处理
2.3.1. 豆渣IDF的超声波处理
将筛分后的豆渣IDF分散在100 mL去离子水中，磁力搅拌30分钟制备DF悬浮液。按照赵等人[11]的方法进行超声波处理，并进行了一些修改。使用超声波处理器（SCIENTZ-IID，宁波Scientz生物科技有限公司，中国宁波）进行处理，探头直径为6 mm。处理过程中，探头浸入悬浮液中心约3 cm，在室温下操作。系统研究了超声波功率（100、200、300、400、500 W，对应功率密度为1、2、3、4、5 W/mL）、处理时间（10、15、20、25、30分钟）和占空比（工作-休息间隔为1 s:2 s、2 s:3 s、3 s:4 s、4 s:5 s、5 s:6 s）对豆渣DF的持水能力和SDF产量的影响。

2.3.2. 豆渣IDF的酶处理
在制备好的悬浮液中加入纤维素酶，浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%（w/w）。在系统变化的条件下进行酶水解，包括水解时间（0.5、1、1.5、2、2.5小时）、pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）和温度（45、50、55、60、65°C）。全面评估了纤维素酶浓度、水解时间、pH值和温度对豆渣DF的WHC和SDF产量的单独及联合影响。

2.3.3. 超声波-酶联合处理
对于超声波-酶联合处理，将经过优化的超声波预处理的豆渣IDF分散在去离子水中。加入纤维素酶（0.2%，w/w），在60°C下水浴中恒速搅拌下进行酶水解1小时。水解后离心去除上清液，收集沉淀物冷冻干燥48小时，用于后续分析。

2.4. 不可溶性膳食纤维（IDF）的基本成分分析
使用商业试剂盒（BC4280-50 T/48S；BC4440-50 T/48S，BC4200-50 T/48S，Solarbio，北京）测量IDF中的纤维素、半纤维素和木质素含量。

2.5. 结构特性分析
2.5.1. 颗粒尺寸
使用激光颗粒大小和形状分析仪（SYNC，Microtrac MRB，美国/德国）测定豆渣DF的颗粒尺寸。样品和蒸馏水的折射率分别设为1.520和1.330，聚焦和测量时间均为30秒。

2.5.2. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）
采用KBr压片法进行DF的FTIR分析，并根据尹等人[12]的程序进行了少量修改。具体步骤是将样品与KBr混合并压片。使用Frontier光谱仪（PerkinElmer Inc., 美国）记录FTIR光谱，以空气作为背景参考。光谱采集分辨率设置为4 cm?1，波长范围为4000–400 cm?1，每次测量累积32次扫描。

2.5.3. X射线衍射（XRD）
使用X射线衍射仪（SmartLab SE，JEOL Ltd., 日本）获取XRD谱图，方法参考吴等人[13]的程序。操作参数设置为40 kV和40 mA，2θ范围为5-60°，步长为0.02°，扫描速度为4°/min。

2.5.4. 扫描电子显微镜（SEM）
使用SEM（Regulus 8220，Hitachi，日本）拍摄改性前后豆渣DF的微观结构。将粉末样品安装在样品架上，并喷涂一层薄金膜。在高真空条件下，以5.0 kV的加速电压进行SEM观察，放大倍数为×8.00 K（比例尺：5.0 μm）。

2.6. 理化性质
2.6.1. 热稳定性
使用同步热分析仪（AmyA 6000，PerkinElmer，美国谢尔顿）评估热稳定性。称取约5 mg DF样品放入陶瓷坩埚中，在氮气气氛下进行热解。升温程序为从50°C开始，以10°C/min的恒定速率加热至500°C。

2.6.2. 持水能力（WHC）
按照田等人[14]的方法进行WHC测定，并进行了一些修改。将准确称量的样品（1 g，记为M1）与30 mL蒸馏水混合后放入离心管中，在37°C下连续振荡150 × g孵育4小时。随后在4000 × g下离心10分钟，小心去除上清液，称量剩余沉淀物（记为M2）。WHC的计算公式为：
(1) WHC(g/g) = (M2 - M1) / M
其中M1是离心前的样品质量（g）；M2是离心后的样品质量（g）；M是初始样品质量（g）。

2.6.3. 持油能力（OHC）
按照江等人[15]的方法进行OHC测定，并进行了一些修改。将准确称量的1 g样品与25 mL大豆油（记为W1）混合后，在37°C下连续振荡180 × g孵育4小时。随后在3000 × g下离心10分钟，记录剩余沉淀物（记为W2）。OHC的计算公式为：
(2) OHC(g/g) = (W2 - W1) / M
其中M是样品质量（g）；W1是离心前的质量（g）；W2是离心后的质量（g）。

2.6.4. 膨胀能力（SC）
根据余等人[16]的方法进行SC测定，并进行了一些修改。将0.3 g样品放入量筒（10 mL）中并调整至刻度线。加入5 mL去离子水充分混合后静置24小时，记录水合前后的体积。该过程重复三次。
(3) SC(mL/g) = (V1 - V0) / M
其中M是样品质量（g）；V1是水合后的体积（mL）；V0是水合前的体积（mL）。

2.6.5. 色度
使用色度计（NR20XE，3nh，深圳，中国）测量豆渣DF样品的L*（亮度）、a*（红度）和b*（黄度）值。总色差（ΔE）的计算公式为：
(4) ΔE = L*2 + a*2 + b*2

2.7. 功能性质
2.7.1. 葡萄糖吸附能力（GAC）
根据孟等人[17]建立的方案进行GAC测定，并进行了一些调整。简要来说，一个准确称量的1克样品与100毫升100毫摩尔/升的葡萄糖溶液混合均匀后，在37摄氏度下孵育6小时。随后，将混合物以4000倍重力离心20分钟，并使用商业葡萄糖测定试剂盒（Solarbio BC2500，北京，中国）对上清液中的葡萄糖浓度进行定量。GAC值的计算公式如下：(5) GAC（毫摩尔/克）= (C1 - C2) / (M × V)，其中C1是初始葡萄糖浓度（毫摩尔/升）；C2是吸附后的葡萄糖浓度（毫摩尔/升）；M是样品质量（克）；V是溶液体积（升）。

2.7.2. 胆固醇吸附能力（CAC）
可以根据Zhang等人的方法[18]确定Okara DF在改性前后的CAC。由于胆固醇在水中的溶解度很低，即使使用了乳化剂也是如此，因此选择蛋黄作为天然胆固醇来源。新鲜蛋黄被分离出来，并用去离子水稀释10倍。然后，将1克样品与25毫升稀释后的蛋黄溶液混合，并在37摄氏度下摇动孵育（120倍重力，2小时）。吸附后，加入4倍体积的乙醇以沉淀残留成分，再将混合物离心（4000倍重力，20分钟）。不含样品的稀释蛋黄溶液（25毫升）作为对照。上清液中的胆固醇浓度通过邻苯二甲醛法测定，并使用胆固醇标准曲线进行定量（y = 0.0023x - 0.0031，R2 = 0.999）。CAC的计算公式如下：(6) CAC（毫克/克）= (C2 - C3) - (C1 - C2W) / 25，其中C1、C2和C3分别是稀释蛋黄溶液、不含Okara DF的稀释蛋黄溶液以及含有Okara DF的稀释蛋黄溶液中的胆固醇浓度（毫克/毫升）；25是吸附系统的体积（毫升）；W是Okara DF的干重（克）。

2.7.3. 胆酸钠吸附能力（SCAC）
SCAC是根据Fang等人[19]建立的协议确定的。首先制备0.2%（重量/重量）的胆酸钠溶液，溶解在0.15摩尔/升的NaCl溶液中。然后将样品（0.2克）与胆酸钠溶液（20毫升）混合，并在120倍重力下摇动孵育2小时。离心后（4000倍重力，10分钟），收集上清液。使用糠醛法测定上清液中剩余的胆酸钠浓度，并测量吸光度（620纳米）。SCAC值的计算公式如下：(7) SCAC（毫克/克）= (N1 - N2) / (M × V)，其中N1和N2分别代表吸附前后的胆酸钠浓度（毫克/毫升）；V是吸附系统的体积（毫升）；M是样品的质量（克）。

2.7.4. 体外抗氧化活性
使用商业测定试剂盒（BC4750-50 T/24S；BC1320-50 T/24S，Solarbio，北京）测量DPPH自由基清除活性和羟基自由基清除能力。

2.7.5. 体外模拟胃肠消化
进行模拟胃肠消化以评估样品对酶降解的抵抗力。简要来说，将IDF（1.0克，干基）悬浮在含有胃蛋白酶的模拟胃液（SGF，pH = 2.0）中，并在37摄氏度下连续摇动孵育2小时。胃消化后，将pH调整至7.0，然后在含有胰酶和胆盐的模拟肠液（SIF）中进一步孵育2小时。消化后，将混合物以3000转/分钟的速度离心15分钟。收集不溶性残留物，用蒸馏水洗涤，并冻干至恒重。根据质量损失计算表观消化率，公式如下：(8) 表观消化率% = (W0 - W1) / W0 × 100%，其中W0是样品的初始干重；W1是消化后的残留物干重。根据2.6.2节描述的方法确定消化样品的WHC。根据2.6.3节描述的方法确定消化样品的OHC。分别计算WHC保留率和OHC保留率。

2.8. 食品基质兼容性
建立了三种食品模型系统，包括纯水作为对照、1% NaCl溶液和5% 蔗糖溶液，代表两种不同的食品基质。随后确定了IDF在这三种系统中的分散稳定性及WHC。简要来说，将不同的样品加入相应的食品模型系统中，在室温下磁力搅拌10分钟，然后静置24小时。然后测量沉淀高度（Hs）和总高度（Ht）。(9) 沉降指数% = (Hs / Ht) × 100%。将样品加入上述不同的模型系统中，并根据2.6.2节描述的方法进行测定。

2.9. 统计分析
所有测量结果重复三次。数据以平均值±标准差（SD）表示。使用IBM SPSS Statistics 23.0（IBM，阿蒙克，纽约，美国）进行单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和Duncan的多重范围检验，统计显著性标准为p < 0.05。使用Origin 2021（Stat-Ease Inc.，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）绘制图表。为了进一步探索数据集中的关系和模式，采用了主成分分析（PCA）。

3. 结果与讨论
3.1. 不同改性方法对Okara DF的影响
评估了超声波占空比、功率强度和暴露时间对Okara DF的SDF产量和WHC的影响。如图1(a1)所示，在脉冲模式（开启3秒，关闭4秒）下，SDF产量（1.97 ± 0.21克/100克）和WHC（11.63 ± 0.25克/克）达到最大值。这种间歇模式有效地平衡了空化引起的纤维溶解与长时间照射导致的结构过度降解，从而提高了SDF的释放量同时保持了水合位点[20]。图1(a2)表明，300瓦的超声波强度产生了最佳的SDF提取量（6.2 ± 0.53克/100克）和WHC（13.14 ± 0.46克/克）。较低的功率水平（例如100瓦）产生的空化不足以进行有效的改性，而较高的强度（例如500瓦）虽然显著增加了SDF产量，但导致了过度的结构破坏，影响了水分保持能力[8]。根据图1(a3)，20分钟的处理时间获得了最佳的SDF产量（2.23 ± 0.38克/100克）和WHC（9.82 ± 0.23克/克）。较短的暴露时间（例如10分钟）导致结构破坏不足，SDF释放有限；而较长的暴露时间（例如30分钟）由于机械剪切导致SDF链断裂，从而降低了水合性能。在另一项支持性研究中，Xie等人[21]报告称，超声波结合发酵使SDF产量增加了三倍，并显著改善了WHC，表明超声波在多种技术策略中增强SDF提取和水合性能的普遍适用性。同样，Tang等人[22]观察到超声波处理分解了Okara基质，产生了多孔结构，增强了水/油保持能力和胆固醇吸附能力。

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图1. (a) 超声波占空比（1）、超声波功率（2）和超声波处理时间（3）对Okara膳食纤维（DF）的持水能力（WHC）和可溶性膳食纤维（SDF）产量的影响。(b) 酶浓度（1）、酶处理pH值（2）、酶处理温度（3）和酶处理时间（4）对Okara DF的WHC和SDF产量的影响。不同字母的条形图表示具有显著差异（p＜0.05）。
系统评估了纤维素酶浓度、水解时间、温度和pH值对Okara DF的SDF产量和WHC的影响。如图1(b1)所示，0.2%（重量/重量）的酶浓度产生了最佳的SDF产量（3.57 ± 0.81克/100克）和WHC（14.31 ± 0.50克/克）。这表明适度的酶浓度足以切割糖苷键以促进SDF的释放，而过高的浓度（例如0.5%）可能会通过酶竞争或过度水解导致DF的结构降解，从而降低WHC。根据图1(b2)，在pH 5.0下进行水解产生了最佳的SDF提取量（2.76 ± 0.34克/100克）和WHC（11.33 ± 0.24克/克）。偏离这个最佳值的pH值（例如pH 5.5或6.0）会降低酶的效力，限制SDF的释放，而极端的pH条件可能会损害纤维基质中的亲水基团，进一步影响水分保持能力。图1(b3)显示，在60摄氏度下孵育获得了最佳的SDF产量（2.00 ± 0.20克/克）和WHC（10.85 ± 0.12克/克）。较低的温度（例如45摄氏度）限制了酶的活性，而较高的温度（例如65摄氏度）促进了酶的变性，这两种情况都会导致性能不佳。如图1(b4)所示，1.5小时的水解时间保持了较高的SDF产量（2.83 ± 0.43克/100克）和WHC（11.23 ± 0.09克/克）。较短的时间（例如0.5小时）导致纤维水解不足，而较长的处理时间（例如2.5小时）可能导致SDF分子过度断裂，从而降低其水合能力。因此，基于上述结果，最佳的超声波处理条件（标记为U）是脉冲模式（开启3秒，关闭4秒），超声波功率（300瓦），超声波处理时间（20分钟）；最佳的酶水解条件（标记为M）是酶浓度0.2%，pH 5.0，水解温度60摄氏度，水解时间1.5小时。在这些条件下，Okara DF的联合处理（标记为UM）产生了8.00 ± 1.04克/100克的SDF产量和40.11%的WHC增加。在相关研究中，Yan等人[23]报告称，经过纤维素酶处理的Forsythia DF表现出更多的孔隙结构，结晶度降低，功能性能得到改善，包括油结合能力和胆固醇吸附能力。同样，Hu等人[24]证明，剪切均质化辅助的纤维素酶提取显著提高了菠萝渣中的SDF产量，证实了酶处理在增强可溶性纤维提取方面的有效性。

3.2. Okara DF的成分分析
如表1所示，经过超声波处理、酶处理及其联合处理后，IDF含量显著降低（p ＜ 0.05）。这种减少主要归因于超声波产生的空化和热效应，这些效应通过将纤维素和半纤维素成分降解为水溶性糖类，促进了IDF向SDF的转化[25]。此外，成分分析显示，超声波-酶联合处理显著降低了纤维素（26.16%）、半纤维素（19.00%）和木质素（48.23%）的含量。因此可以推断，经过超声波-酶联合处理后，IDF被降解，生成了部分可溶的纤维素寡糖。这些成分的变化可能会影响样品的微观结构和物理化学性质，可能影响水/油保持能力和吸附能力等参数[26]。
表1. 不同改性方法对Okara膳食纤维（DF）多种成分含量的影响。
空单元
SDF（%）
IDF（%）
纤维素（毫克/克）
半纤维素（毫克/克）
木质素（毫克/克）
CK
3.10 ± 0.30c
94.21 ± 0.33a
26
8.75 ± 0.33a
44
5.88 ± 0.69a
22
2.53 ± 0.55a
U
3.73 ± 1.10c
93.33 ± 0.87a
24
1.48 ± 0.78b
39
8.15 ± 0.74c
20
0.34 ± 0.62b
M
6.20 ± 0.53b
88.35 ± 0.33b
23
2.74 ± 0.43c
41
7.49 ± 0.23b
18
9.33 ± 0.36c
UM
8.11 ± 1.04a
82.78 ± 1.32c
19
8.43 ± 0.26d
36
1.14 ± 0.37d
11
5.21 ± 0.48d
注：SDF：可溶性膳食纤维产量；IDF：不可溶性膳食纤维产量；CK：对照组，代表未经改性的Okara DF；U：超声波改性组，代表在最佳超声波处理条件下获得的改性DF；M：酶改性组，代表在最佳酶处理条件下获得的改性DF；UM：超声波-酶联合改性组，代表在优化的超声波条件和酶条件下联合处理的改性DF。结果以平均值±标准差（n = 3）给出。同一列中不同字母的数据表示具有显著差异（p < 0.05）。

3.3. 结构特性的变化
3.3.1. 颗粒大小分析
图2(a)和表2显示了经过不同改性策略处理的Okara DF的颗粒大小分布和平均颗粒直径。对照样品显示出相对较宽的颗粒大小分布，没有明显的主导峰。相比之下，超声波、酶处理和联合处理产生了更尖锐、更集中的峰，表明颗粒大小分布更窄，颗粒均匀性更好。颗粒大小分布的缩小增强了表面积和孔隙可及性，从而促进了水分渗透和吸附作用。超声波处理减小了颗粒大小，可能是由于空化引起的DF细胞结构的变形和破坏[27]。酶处理也减小了颗粒大小并缩小了分布范围，这可能是由于酶的作用将DF分解成更小的分子聚集体[28]。超声波-酶联合处理产生了最显著的效果，产生了最高且最尖锐的峰，D50值最小。这表明联合处理显著减小了Okara DF的颗粒大小，可能会增加其比表面积，从而改善其功能性能，如WHC、OHC和吸附能力。同样，Sang等人[29]证实，物理力和酶水解的联合作用可以有效破坏微观分子结构并降解纤维素，最终减小颗粒大小。
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图2. (a) 不同改性方法下Okara膳食纤维（DF）的颗粒大小分布；(b) 不同改性方法下Okara DF的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）；(c) 不同改性方法下Okara DF的X射线衍射（XRD）。不同字母的条形图表示具有显著差异（p＜0.05）。
表2. 不同Okara膳食纤维（DF）的颗粒大小。
空单元
D10（微米）
D30（微米）
D50（微米）
D70（微米）
CK
33.30 ± 1.45a
73.56 ± 1.90a
121.73 ± 1.58a
192.93 ± 0.93a
U
31.22 ± 0.81a
69.86 ± 1.40ab
116.7 ± 2.35a
187.07 ± 4.03a
M
31.78 ± 0.47a
70.16 ± 1.64ab
115.63 ± 3.35a
182.10 ± 6.17a
UM
30.85 ± 1.58a
66.02 ± 3.74b
106.76 ± 6.43b
165.53 ± 10.65b
注：CK：对照组，代表未经改性的Okara DF；U：超声波改性组，代表在最佳超声波处理条件下获得的改性DF；M：酶改性组，代表在最佳酶处理条件下获得的改性DF；UM：超声波-酶联合改性组，代表在优化的超声波条件和酶条件下联合处理的改性DF。结果以平均值±标准差（n = 3）给出。同一列中不同字母的数据表示具有显著差异（p < 0.05）。
3.3.2.**FTIR分析**
FTIR光谱技术是一种灵敏的分析方法，可用于研究豆腐渣（DF）的结构特性，揭示其分子团和化学键在改性过程中的变化。如图2(b)所示，大约在3420 cm?1处观察到一个宽吸收带，这主要归因于豆腐渣中纤维素和半纤维素的O–H伸缩振动[13]。经过超声波、酶处理或联合处理后，样品的吸收峰向低波数方向移动，并且峰强度逐渐增强，表明羟基团的暴露程度增加，多糖链之间的分子间和分子内相互作用得到加强。超声波、酶处理或联合处理后该峰的变窄表明纤维基质的结合结构发生了变化[30]。2920 cm?1处的吸收峰来源于甲基或亚甲基的C–H伸缩振动，这是多糖纤维素的典型结构特征[31]。峰强度的增强表明疏水基团的暴露程度增加。3420 cm?1与2920 cm?1处峰面积的比值被用作氢键强度的指标。与未经处理的样品相比，经过超声波-酶处理的豆腐渣显示出较低的氢键指数，表明超声波-酶处理降低了分子间的氢键密度，使得纤维素网络更加松散，从而增加了吸附位点的暴露。

**1745 cm?1和1631 cm?1处的峰**分别对应于木质素酯化羧基的C=O伸缩和芳香环的C=C伸缩。此外，1055 cm?1区域的吸收被认为是碳水化合物的特征吸收带。FT-IR分析证实，豆腐渣具有典型的多糖吸收峰和功能相似的基团。各种处理后峰强度的增强和峰面积的增加可能归因于两个主要因素：首先，所应用的改性技术促进了纤维素的结构重组，包括结晶度的降低以及豆腐渣从不溶状态转变为可溶状态；其次，超声波产生的机械振动、局部高温以及强烈的剪切摩擦为纤维分子提供了能量，从而改变了光谱中特征峰的强度。这些变化进一步改变了豆腐渣的分子量和亲水性[32]。尽管处理后没有出现新的功能基团，但吸收强度的显著变化和化学键断裂的证据表明豆腐渣基质内部发生了显著的结构重组。

**X射线分析（XRD）**
XRD表征揭示了豆腐渣的结晶结构。所有样品在大约21.5°和16°处显示出明显的反射峰，在35°附近也有一个较小的信号（图2c），这是纤维素天然I型双螺旋构象的特征——在这种构象中，结晶层与非晶区域相互交错[33]。结果表明，经过联合超声波-酶处理后，衍射峰强度降低，结晶度下降（表3）。这表明改性过程促进了纤维素大分子的暴露，增加了非晶区域中的非晶纤维素成分，并导致原始纤维素结构的破坏以及结晶度的变化。因此，形成了更加多孔和无序的微观结构（图3），从而增强了其功能特性（图4，图5）。这些发现与该领域的先前研究结果一致。结晶度的降低有助于提高胆固醇的吸附能力（图5f）。无论是超声波处理还是酶处理，或者两者的联合处理，都没有改变峰的位置或宽度，表明这些处理没有改变纤维素的晶型，并保持了晶体的长程有序性[34]。Wu等人[13]也报告了类似的观察结果，他们发现尽管豆腐渣经过蒸汽喷射微细化处理后颗粒尺寸显著减小，但衍射角没有变化。

**3.3.3 X射线分析（XRD）**
XRD分析揭示了豆腐渣的结晶结构。所有样品在大约21.5°和16°处显示出明显的反射峰，在35°附近也有一个较小的信号（图2c），这是纤维素天然I型双螺旋构象的特征——在这种构象中，结晶层与非晶区域相互交错[33]。结果表明，经过联合超声波-酶处理后，衍射峰强度降低，结晶度下降（表3）。这表明改性过程促进了纤维素大分子的暴露，增加了非晶区域中的非晶纤维素成分，并导致原始纤维素结构的破坏以及结晶度的变化。因此，形成了更加多孔和无序的微观结构（图3），从而增强了其功能特性（图4，图5）。这些发现与该领域的先前研究结果一致。结晶度的降低有助于提高胆固醇的吸附能力（图5f）。无论是超声波处理、酶处理，还是两者的联合处理，都没有改变峰的位置或宽度，表明这些处理没有改变纤维素的晶型，并保持了晶体的长程有序性[34]。Wu等人[13]也报告了类似的观察结果，他们发现尽管豆腐渣经过蒸汽喷射微细化处理后颗粒尺寸显著减小，但衍射角没有变化。

**3.3.3 X射线分析（XRD）**
XRD表征揭示了豆腐渣的结晶结构。所有样品在大约21.5°和16°处显示出明显的反射峰，在35°附近也有一个较小的信号（图2c），这是纤维素天然I型双螺旋构象的特征——在这种构象中，结晶层与非晶区域相互交错[33]。结果表明，经过联合超声波-酶处理后，衍射峰强度降低，结晶度下降（表3）。这表明改性过程促进了纤维素大分子的暴露，增加了非晶区域中的非晶纤维素成分，并导致原始纤维素结构的破坏以及结晶度的变化。因此，形成了更加多孔和无序的微观结构（图3），从而增强了其功能特性（图4，图5）。这些发现与该领域的先前研究结果一致。结晶度的降低有助于提高胆固醇的吸附能力（图5f）。无论是超声波处理还是酶处理，或者两者的联合处理，都没有改变峰的位置或宽度，表明这些处理没有改变纤维素的晶型，并保持了晶体的长程有序性[34]。

**3.3.4 扫描电子显微镜（SEM）分析**
SEM有效揭示了豆腐渣在超声波和酶处理后的微观结构变化。如图3所示，未经处理的豆腐渣显示出较大、紧凑的聚集体，表面纹理相对光滑且规则。相比之下，所有改性样品的表面完整性都受到了破坏。具体来说，经过超声波处理的纤维（图3b）表面粗糙度增加且出现皱纹。酶处理（图3c）通过断裂糖苷键和破坏分子间力使纤维降解，导致形态破碎和聚合度降低[35]。超声波-酶联合处理（图3d）结合了两种处理的特性，促进了IDF向低分子量SDF的部分转化。豆腐渣成分的降解和溶解，尤其是在纤维素和半纤维素中，导致相关键的断裂。因此，改性样品表现出结构破坏和比表面积增加，从而增强了其与其它物质的相互作用。这些结构变化进一步影响了其功能特性和在食品系统中的潜在应用。这种协同效应降低了颗粒尺寸并增加了比表面积，可能是因为超声波破坏了分子结构并暴露了更多的酶可接触位点，从而提高了酶的效率[36]。

**3.4 物理和化学性质的变化**
**3.4.1 热重分析（TGA）**
TGA是一种广泛用于评估材料热稳定性和行为的技术。该技术被用来评估豆腐渣的热性质和处理对其的影响[37]。图4(a1)和(a2)展示了样品的热稳定性曲线，表明经过各种改性处理后热稳定性普遍下降。如图4(a1)所示，观察到两个主要的重量损失阶段：第一个阶段在125°C左右，对应于水分蒸发；第二个阶段在200至400°C之间，代表纤维素和半纤维素的快速降解。未经处理的样品（CK）显示出最高的初始分解温度和最大的残余质量，表明其具有优异的热稳定性。这可能源于其紧密堆积的纤维结构（纤维素、半纤维素、木质素）和强分子间相互作用，需要更高的能量才能分解。相比之下，经过超声波和酶处理的纤维显示出更陡峭的重量损失曲线和更低的残余质量，表明结构受到破坏——如糖苷键断裂和结晶域降解——导致热稳定性降低。超声波-酶联合处理导致起始温度最低和残余质量最小，反映了最弱的热稳定性。这可以归因于有序结构的协同破坏和分子间相互作用的显著减弱，从而促进了更早和更完全的分解。这些结果与FTIR的研究结果一致，表明所有处理都破坏了纤维素和半纤维素之间的氢键以及结晶区域内的氢键，从而降低了结晶度。同样，Xie等人[35]也报告称，酶处理稻米糠DF的结晶区域降低了结晶度和热稳定性。

**3.4.2 水分保持能力（WHC）分析**
较高的WHC有助于改善食品系统中的水分保持能力，从而减少脱水引起的收缩。此外，豆腐渣通过吸收大量水分并增加体积，有助于提高饱腹感并预防肥胖。如图4(a3)所示，超声波、酶处理和联合处理显著提高了IDF的WHC。其中，超声波-酶联合处理产生的WHC最高（14.88 ± 0.29 g/g），分别比仅超声波处理组和仅酶处理组提高了40.11%、23.29%和14.73%。WHC的提高可能归因于处理过程中引起的结构变化。WHC的提高可能还归因于可溶性成分的增加。超声波产生的空化效应破坏了豆腐渣原有的紧凑结构，使之前隐藏在分子内部的羟基团暴露出来。这一观察结果与FTIR分析的结果一致。这些新暴露的羟基团可以与额外的水分子形成氢键，从而提高WHC，这与先前的研究结果一致[39]。纤维素酶处理分解了复杂的大分子结构，使得纤维基质更加多孔和松散，从而提高了水分的吸收和保持能力[40]。联合处理获得的优异WHC可能源于一种协同机制：超声波预处理促进了基质的破坏并增加了酶的可接触性，从而最大化了水解效率并暴露了更多的亲水区域，最终导致WHC的最大提升。

**3.4.3 油分保持能力（OHC）分析**
OHC是高脂肪食品应用中的重要功能属性，因为较高的OHC可以提高产品的稳定性并改善感官质量，同时有助于抑制胆固醇形成、减少脂质吸收和促进脂质代谢[41]。如图4(a4)所示，联合改性处理的豆腐渣OHC达到14.57 ± 0.56 g/g，分别比对照组（CK）、仅超声波处理组（U）和仅酶处理组（M）提高了82.81%、50.67%和54.18%。这种显著提高可能归因于处理过程中引起的结构变化。OH的提高可能还归因于可溶性成分的增加。超声波产生的空化效应破坏了豆腐渣原有的紧凑结构，使之前隐藏在分子内部的羟基团暴露出来。这一观察结果与FTIR分析的结果一致。这些新暴露的羟基团可以与额外的水分子形成氢键，从而提高WHC，这与先前的研究结果一致[39]。纤维素酶处理分解了复杂的大分子结构，使得纤维基质更加多孔和松散，从而提高了水分的吸收和保持能力[40]。联合处理获得的优异WHC可能源于一种协同机制：超声波预处理促进了基质的破坏并增加了酶的可接触性，从而最大化了水解效率并暴露了更多的亲水区域，最终导致WHC的最大提升。

**3.4.4 膨胀能力（SC）分析**
膨胀能力（SC）是豆腐渣的重要特性。较高的SC使纤维在胃中占据更多空间，从而提高饱腹感。由此产生的体积增加可以进一步刺激肠道蠕动，促进排便并帮助预防便秘。如图4(a5)所示，超声波-酶联合处理产生的SC值最高（8.72 ± 0.48 mL/g），比未经处理的豆腐渣提高了40.19%。这种改善可能归因于联合处理引起的结构和表面变化，这些变化增强了纤维的水合和膨胀能力。这些观察结果与Tang等人的研究[44]一致，他们报告称，处理诱导的微观结构变化对豆腐纤维（DF）的膨胀行为有积极影响。因此，超声波-酶联合作用有效地改善了DF的膨胀性能，从而对其更广泛的物理化学和功能特性产生了积极影响。

3.4.5. 色度分析
在食品工业中，消费者对产品的接受度很大程度上受到产品颜色的影响[45]。色度分析的结果如表4所示。L*值代表亮度，而a*和b*值对应于色度指数。与对照组（CK）相比，单独经过超声波处理（U）、单独经过酶处理（M）以及超声波-酶联合处理（UM）的样品显示出L*（亮度）和a*（红色）降低，同时b*（黄色）增加。这种改性豆腐纤维的变暗趋势与Yue等人的研究结果[46]一致。因此，超声波、酶处理以及联合处理有效地改变了豆腐纤维的颜色，使其更适合用于深色食品中。UM样品的总色差（ΔE）相对于CK显著增加，表现为L*显著降低和b*升高（p < 0.05）。这种明显的颜色变化表明，超声波-酶联合处理对纤维的亮度产生了负面影响，这可能是由于天然色素的降解以及改性过程中发生的与颜色相关的反应[47]。

表4. 豆腐纤维（DF）的色度分析

| 组别 | L* | a* | b* |
|-----------|---------|---------|---------|
| CK | 99.44 ± 0.08 | 99.15 ± 0.08 | 6.22 ± 0.04 |
| U | 97.52 ± 0.26 | 97.16 ± 0.25 | 3.12 ± 0.28 |
| M | 96.13 ± 0.61 | 95.67 ± 0.63 | 2.36 ± 0.39 |
| UM | 86.36 ± 1.52 | 85.78 ± 1.50 | 2.37 ± 0.07 |
| 注：CK：对照组，未经改性的豆腐纤维；U：超声波处理组；M：酶处理组；UM：超声波-酶联合处理组 |

注：数据以平均值±标准差（n = 3）表示。同一列中不同字母表示具有显著差异（p < 0.05）。

3.5. 功能特性
3.5.1. 葡萄糖吸附能力（GAC）分析
豆腐纤维可以通过吸附葡萄糖并减少其消化和吸收来调节餐后血糖水平，其葡萄糖吸附能力（GAC）与降糖效果密切相关[48]。如图5(a)所示，经过超声波-酶联合处理的样品显示出最高的GAC值9.20 ± 0.01 mmol/g，表明联合处理有效延缓了葡萄糖的扩散，这与先前的研究结果一致[44]。豆腐纤维的GAC主要取决于其粘度及其纤维网络捕获葡萄糖分子的能力，这与它的表面结构和组成成分密切相关。联合处理导致纤维结构断裂和表面起皱，增加了比表面积，使更多的葡萄糖分子能够被捕获在其多孔基质中，从而增强了GAC。

3.5.2. 胆固醇吸附能力（CAC）分析
胆固醇是人体必需的结构成分；然而，过高的胆固醇水平与动脉硬化、胆结石和心血管疾病有关。豆腐纤维可以通过其表面功能基团吸附胆固醇，从而降低肝脏中的胆固醇含量和血浆中的胆固醇水平[49]。在模拟肠道（pH = 7.0）和胃（pH = 2.0）条件下评估了改性前后豆腐纤维的CAC，如图5(b)所示。结果表明，经过超声波、酶处理或联合处理的豆腐纤维在体外表现出更强的胆固醇吸附能力。在pH 7.0下的CAC显著高于pH 2.0下的CAC（p < 0.05），这表明改性后的豆腐纤维在肠道环境中更有效地吸附胆固醇[50]。高浓度的H+离子是这一现象的主要原因。这些离子带有正电荷，使纤维素和胆固醇分子相互分离，导致分子间的键合减弱。这些发现与Tang等人的报告[22]一致。在pH 2.0下，UM样品（超声波-酶联合处理）的CAC达到14.62 ± 0.94 mg/g，是CK（2.51 ± 0.21 mg/g）的5.82倍。在pH 7.0下，UM的CAC（10.35 ± 0.23 mg/g）是CK（1.25 ± 0.72 mg/g）的8.28倍。这些结果表明，超声波-酶联合处理显著增强了豆腐纤维的CAC（p < 0.05）。
胆固醇吸附能力的增强可以归因于纤维素和半纤维素的降解，这使结构基质变得松散，暴露出更多的亲水基团。这一观察结果与之前关于结构孔隙度增加（SEM）和OHC升高的描述相符。豆腐纤维增强的吸附特性可以归因于联合超声波-酶处理后表面结构的松散和疏水基团的增加暴露。这些结果与Si等人的报告[51]一致，证实了改性豆腐纤维在pH 7.0下具有更强的CAC。总体而言，改性豆腐纤维改进的胆固醇结合能力表明其作为降低胆固醇水平的食品加工功能性成分的潜力。

3.5.3. 胆酸钠吸附能力（SCAC）分析
不同改性处理对豆腐纤维SCAC的影响如图5(c)所示。结果表明，超声波和酶处理都显著增加了吸附量。豆腐纤维对胆酸钠的吸附与其物理和化学性质密切相关，通常纤维颗粒尺寸较小会导致更高的吸附能力[52]。在所有处理方法中，超声波-酶联合处理的效果最为显著（p < 0.05），UM样品的SCAC达到18.27 ± 0.23 mg/g，显著高于CK、U和M。这种增强效果可以归因于两种处理的协同作用。超声波处理破坏了纤维的致密表面结构，从而提高了后续酶处理的效率。酶的作用降解了细胞壁中的大分子，使纤维结构变得松散，使较小的分子更容易渗透。这一过程暴露了之前被包裹的功能基团，从而增加了可用的胆酸钠结合位点[42]。这些解释与SEM观察结果一致。结果表明，经过超声波-酶处理的豆腐纤维能有效吸附胆酸钠，这可能有助于减少肝脏和肠道中的胆汁酸积累，并有助于降低血液中的脂质水平。

3.5.4. 抗氧化活性
3.5.4.1. DPPH自由基清除活性分析
图5(d)展示了超声波、酶处理和联合处理对豆腐纤维DPPH自由基清除能力的影响。所有三种改性方法都显著增强了抗氧化活性（p < 0.05）。其中，超声波-酶联合处理达到了最高的抑制值（37.89 ± 0.03%），比CK提高了2.35倍。这种抗氧化活性的增强可能归因于超声波产生的空化效应和局部加热，这些效应破坏了紧密的纤维结构，暴露了之前无法接触的功能基团[53]。这种结构改变增加了豆腐纤维对后续酶水解的敏感性。因此，酶处理促进了木糖和其他含有羟基的短链多糖片段的释放，这些片段能够捐赠电子或氢原子来淬灭DPPH自由基[54]。

3.5.4.2. 羟基自由基清除活性分析
图5(e)展示了各种改性对豆腐纤维羟基自由基清除能力的影响。结果表明，超声波、酶处理和超声波-酶联合处理显著增强了清除能力（p < 0.05）。其中，联合处理的清除率最高，达到14.14 ± 0.12%，分别比CK、U和M组高出8.78倍、6.20倍和6.96倍。这种显著的改善可能归因于改性纤维中尿酸含量的增加。尿酸含有羧基，已知它们参与电子或氢的捐赠反应，从而增强了羟基自由基的中和效率[50]。

3.5.5. 体外消化性分析
豆腐纤维的低表观消化性与它的不溶性质和对胃肠道酶的结构性抵抗一致（图4b）。经过模拟消化后，豆腐纤维分别保留了88.84%和81.81%的原始水分保持能力和OHC。消化后没有观察到功能性能的显著损失。消化后高水分保持能力和油结合能力的保持表明，豆腐纤维的功能性质在胃肠道条件下是稳定的。这种稳定性支持其作为功能性食品成分的潜力，因为纤维在加工过程中可以保持其技术功能，在消化过程中保持其生理功能。

3.6. 食品基质兼容性分析
豆腐纤维在不同食品模型系统中的分散稳定性和水分保持能力（WHC）表现出高度一致的趋势（图4c）。超声波-酶处理在所有介质中产生了最低的沉降指数和最高的WHC，表明结构与功能之间存在强烈的关系。增强的WHC表明形成了更多孔隙和亲水的纤维网络，增加了结合水含量，并有效抑制了颗粒聚集和沉降。相比之下，NaCl和蔗糖溶液中水可用性的降低以及溶剂结构的改变在一定程度上削弱了水分保持能力和分散性；然而，经过超声波-酶处理的纤维保持了更好的性能，显示出与复杂食品基质的更好兼容性。

3.7. 主成分分析（PCA）
PCA显示，PC1（86.94%）代表了一个主导的结构-功能调节轴，在该轴上，结晶度、氢键指数和颗粒大小与水分保持能力和吸附相关性质呈负相关（图5f）。从机制上讲，超声波处理主要通过空化引起的剪切力破坏了分子间的氢键，降低了结构刚性并提高了表面可及性。随后，纤维素酶水解了暴露的无定形区域，进一步降低了结晶度并释放了亲水基团。这种协同效应源于超声波增强的酶可及性和改善的底物扩散，导致了结构重组的协调。PCA加载与机制转变之间的一致性证实，功能增强不是由孤立参数的变化决定的，而是由单一主导调节轴上的综合结构调制所控制的。

3.8. 结构-功能关系和机制分析
如图5g和h所示，超声波-纤维素酶处理引起的结构重组在决定豆腐纤维的功能性质中起着决定性作用。具有高结晶度和大颗粒大小的天然纤维具有密集有序的纤维素排列，这限制了酶的可及性并限制了功能结合位点的暴露。相比之下，超声波空化产生了机械剪切力，削弱了结晶域内的氢键，促进了纤维素酶的渗透和选择性水解。改性豆腐纤维中观察到的吸附和水合性能的增强可以归因于氢键、结晶结构和颗粒大小分布的协调变化。FTIR分析显示，在–OH伸缩区域出现了明显的红移和强度变化，表明分子间氢键的破坏和重组。这种氢键的减弱降低了纤维素网络的紧密度，并促进了参与吸附作用的功能基团的暴露。XRD结果进一步表明，超声波-酶处理后结晶度指数显著降低。相关性分析显示，结晶度与胆固醇吸附能力之间存在显著的负相关（R2 = 0.99，p < 0.05；图5f），表明有序结晶域的破坏在增强功能性能中起着决定性作用。结晶区域的减少增加了无定形区域的比例，这些区域更容易被水分子和疏水底物接触。颗粒大小分布分析显示，经过复合处理后，颗粒大小减小，分布变得更窄，从而增加了比表面积并缩短了扩散路径。这些结构变化共同解释了水分保持能力和胆固醇吸附能力的提高。值得注意的是，超声波-酶联合处理比单独处理产生了更明显的结构破坏和功能增强，表明了协同效应。超声波预处理可能通过松散纤维聚集体和降低结晶度来促进酶的可及性，从而增强了酶的水解效率。这种协同作用强调了整合物理和生化改性策略以定制膳食纤维功能的重要性。
从应用角度来看，通过超声波-纤维素酶处理实现的结构改性赋予了豆腐纤维增强的脂质相关功能，突显了其作为功能性食品成分的潜力。结晶度和颗粒大小的同步降低导致了更高的OHC和CAC，这些是调节胃肠道中脂质消化和吸收的理想性质。增加的无定形区域和多孔微观结构可能有助于隔离膳食胆固醇和脂质微胶粒，从而在消化过程中减少胆固醇的生物可利用性。总体而言，超声波-纤维素酶方法是一种可扩展的、无化学添加剂的途径，用于调节豆腐纤维的结构。所得到的低结晶度、小颗粒豆腐纤维可以用于富含脂肪或针对胆固醇的食品中，以改善技术性能并降低胆固醇的吸收。这些数据为设计具有降低胆固醇潜力的豆腐纤维成分提供了结构基础，并拓宽了其在功能性食品和营养补充剂中的应用范围。**结论**
在本研究中，通过对豆腐渣（okara DF）进行超声处理、酶解以及两者的联合应用，系统地评估了其结构、物理化学和功能特性的变化。结果表明，在最佳条件下（脉冲模式为3秒开启/4秒关闭，超声强度为300瓦，超声时间为20分钟，酶浓度为0.2%（重量/重量），pH值为5.0，水解时间为1.5小时），改性豆腐渣的膳食纤维（SDF）产量和水分保持能力（WHC）分别提高到了8.00 ± 1.04克/100克和14.88 ± 0.29克/克。超声-酶联方法有效降解了豆腐渣中的纤维素、半纤维素和木质素，其含量分别减少了49.41%、38.41%和12.06%。结构上的变化，包括孔隙率的增加、粒径的减小、比表面积的增大、功能基团的暴露以及结晶度的降低，使得豆腐渣的功能特性得到了显著改善。具体而言，其水分保持能力（WHC）、氧化还原能力（OHC）和比表面积（SC）分别提高了40.11%、82.81%和40.19%。这些变化进一步增强了豆腐渣的功能性能，显著提升了其抗氧化、降血糖和降血脂的作用。总体而言，超声-酶联方法为豆腐渣的改性提供了一种高效策略，并为豆腐渣在功能性食品中的应用提供了巨大潜力。

**作者贡献声明**
崔杰：撰写初稿、数据分析、概念构思。
刘丹丹：撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验实施。
郭莉：撰写、审稿与编辑。
陶海腾：撰写、审稿与编辑。
高伟：撰写、审稿与编辑。
崔波：监督工作、资源协调、概念构思。