采用COSMO-RS技术对深共晶溶剂进行筛选，并结合超声辅助提取方法从尖叶蓼（Polygonum cuspidatum）中提取白藜芦醇

《Ultrasonics Sonochemistry》：COSMO-RS guided screening of deep eutectic solvents and ultrasound-assisted extraction for resveratrol from Polygonum cuspidatum

　　一通路|子梦松|彭军陈|遵来胜|志勇吴

中国黑龙江省哈尔滨市，东北农业大学兽医学院，邮编150030

摘要

白藜芦醇是一种酚类化合物，以其抗炎、抗氧化和抗凋亡特性而闻名。为了开发一种比传统有机溶剂更环保的替代品，本研究采用了一种有效的超声辅助提取（UAE）方法，利用深共晶溶剂（DES）从虎杖（Polygonum cuspidatum）中分离白藜芦醇。通过COSMO-RS模型合理筛选出最佳深共晶溶剂——氯化胆碱-甘油（ChCl-Gly），其摩尔比为1:2，含水量为20%。随后利用响应面方法（RSM）进一步优化了提取参数。在以下条件下，白藜芦醇的最大含量达到了4.45 ± 0.25 mg/g，这与传统乙醇回流提取（ERE）得到的结果相似：浴温64°C，超声功率200 W，提取时间20.5分钟，液固比33.3。值得注意的是，DES-UAE方法在显著更短的时间内（20.5分钟对比ERE的60分钟）实现了这一效率。扫描电子显微镜（SEM）结果显示，DES和超声的共同作用对植物细胞壁的破坏作用比ERE更严重，这为提取效率的提高提供了机制上的解释。这项工作表明，基于COSMO-RS的深共晶溶剂筛选能够快速确定最佳溶剂系统——ChCl-Gly，从而高效地从虎杖中提取白藜芦醇。计算预测与实验验证的结合不仅加快了溶剂的选择过程，还提供了一种快速、高效且环保的传统提取方法的替代方案。

1. 引言

白藜芦醇是一种天然的多酚化合物，最初从北美洲的藜属植物根部提取而得名[1]。作为一种应激诱导的防御性植物化学物质，它会在葡萄、花生、浆果、虎杖和桑树的各种器官中积累[2]。这种化合物表现出多种广泛的药理活性，如抗肿瘤、心脏保护、抗氧化、抗菌、抗病毒、肝保护、抗炎和免疫调节作用[3] [4] [5]。作为一种膳食补充剂，它因其预防疾病和促进健康的潜力而受到关注。此外，白藜芦醇还被认为具有抑制酪氨酸酶、单酚酶和二元酚酶的作用，适用于美白应用，并已被列入中国的化妆品成分目录。最近的研究还探讨了其在调节肠道微生物群和管理炎症性疾病（包括结直肠癌）中的作用，这增加了人们对开发高效提取方法的兴趣[6]。

在虎杖中，白藜芦醇主要以糖基化形式存在，其中多糖苷素（polydatin）的含量最为丰富。具体来说，多糖苷素的含量是游离白藜芦醇的7到12倍[7] [8] [9]。因此，虎杖被认为是生产白藜芦醇的首选原料；因此，将多糖苷素高效转化为生物活性苷元是核心任务。一些提取技术——乙醇回流、超声辅助和亚临界水提取——都能快速溶解这些化合物，但它们对糖苷键的降解作用有限。因此，需要额外的水解步骤：必须将多糖苷素裂解以释放白藜芦醇，否则其在人体内的吸收效果较差[10] [11]。使用纤维素酶进行酶预处理可以一石二鸟：它既能破坏细胞壁，又能在中等条件下催化多糖苷素向白藜芦醇的转化[12] [13]。然而，缺点是时间较长——酶辅助的深共晶溶剂提取通常需要几个小时[8]。为了克服这一限制，人们将超声与酶解结合使用：声空化作用加速了传质过程，缩短了反应时间，且无需额外的化学物质或热量。这种酶加超声的策略现在被认为是从虎杖中提取白藜芦醇最高效和环保的方法[14] [15]。

深共晶溶剂（DESs）通过定义好的接受体和给体的氢键配对容易制备，被认为是一种绿色且可调的介质[16]。当组分仅限于天然氨基酸、多元醇或有机酸时，所得到的子类别——称为“天然深共晶溶剂”（NADES）——结合了完全的可生物降解性、可回收性和与水的混溶性，为天然产物的提取提供了理想的平台[17] [18] [19] [20]。最近的研究表明，酸性DES或添加盐酸可以增强从虎杖中提取白藜芦醇的效果[21]。然而，这样的酸性系统存在环境和实际操作上的挑战，限制了它们的环保性能。因此，合理设计DES对于实现高提取效率和环境可持续性至关重要。在这种背景下，类导体筛选模型（COSMO-RS）已成为预测溶质-溶剂相互作用并指导实验验证前最佳DES组合选择的强大计算工具[22] [23]。最近的研究表明，通过COSMO-RS进行溶剂筛选可以显著缩短开发时间、减少溶剂消耗，并将筛选效率提高几倍[24] [25] [26]。

本研究组装了几种深共晶溶剂，并使用COSMO-RS模型进行了计算机模拟筛选。氯化胆碱作为氢键接受体，而不同的氢键给体根据其对白藜芦醇的预测亲和力进行排序。表现最佳的深共晶溶剂随后被合成，并在超声辅助下与纤维素酶预处理结合，用于从虎杖中提取白藜芦醇。在初步筛选提取条件后，利用响应面方法（RSM）微调了工艺参数。此外，通过分子间相互作用分析和分子动力学模拟从分子层面探讨了提取机制，为DES在提高白藜芦醇回收率中的作用提供了理论解释。

2. 材料与方法

2.1. 材料与仪器

2024年10月，从中国山西榆林采集了虎杖根，并由东北农业大学的薛颖副教授进行了验证。干燥后，将根磨碎通过40目筛网。粉末悬浮在pH 5.0的水中（体积比1:20），然后加入浓度为1.2%（重量/重量）的纤维素酶。将混合物置于45°C下进行200 W的超声处理90分钟。过滤后，残渣在60°C下过夜干燥，细磨并储存。白藜芦醇标准品（> 98%，批次C16195355）和所有分析级深共晶溶剂组分（氯化胆碱、甘油、丙二醇和L-脯氨酸）均来自上海Maclin公司。HPLC级乙腈、甲酸和甲醇由天津Fuyu精细化工公司提供，去离子水则使用Milli-Q系统（Millipore，美国波士顿）制备。

使用的是KQ-250DB超声清洗浴（中国江苏昆山），具有固定的基底和经过退火的换能器，工作频率为50 kHz。矩形浴槽内部尺寸为23.5 cm × 13.3 cm × 10.2 cm，输出功率可达250 W。HPLC系统由多个SHIMADZU手动样品处理单元组成（Shimadzu International Trading Co., Ltd.）。白藜芦醇在Diamonsil C18柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm；Dikma Technologies）上分离，柱子安装在Shimadzu HPLC系统（LC-20AR泵，SPD-20A UV检测器）中。

2.2. 虎杖中白藜芦醇含量的测定

2.2.1. 白藜芦醇标准曲线的制备

根据先前报道的方法[27]，使用HPLC测定白藜芦醇含量并构建标准曲线。流动相由0.1%甲酸的水（洗脱剂A）和乙腈（洗脱剂B）组成。梯度洗脱程序如下：从0到10分钟为30% B的等浓度；从10到11分钟逐渐增加到90% B；从11到15分钟保持90% B的等浓度；从15到17分钟逐渐降低到30% B；然后在30% B下再平衡20分钟。分析过程中，柱温保持在30°C，进样体积为20 μL，流速为1.0 mL/min，检测波长为306 nm。每次进样前，柱子需用初始流动相平衡20分钟。

准确称量白藜芦醇标准品（9 mg）并转移到5 mL棕色容量瓶中。加入甲醇溶解化合物并定容，得到1.8 mg/mL的储备溶液。随后用此储备液制备0.03、0.06、0.09、0.12和0.15 mg/mL的标准溶液。白藜芦醇的标准曲线呈线性（R2 = 0.9978），表达式为：

(1) Y = 2×10^8X + 273740

其中，Y和X分别表示峰面积和白藜芦醇浓度（mg/mL）。

2.2.2. 提取程序和含量测定

在此程序中，准确称量0.5 g经过酶预处理的虎杖粉末，并与选定的深共晶溶剂按预定的液固比混合。在受控条件下进行超声辅助提取，功率、温度和时间根据实验设计设定。提取后，将所得溶液适当稀释，然后用甲醇离心分离固体残渣，上清液过滤后进行HPLC分析。使用2.2.1节中开发的标准曲线定量白藜芦醇含量，计算公式为：

(2) Y = c×vM（mg/g）

其中M是样品质量（g），v是溶液体积（mL），c是白藜芦醇浓度（mg/mL）。

2.3. 深共晶溶剂的筛选

2.3.1. 使用COSMO-RS建模的模拟筛选

为了预先预测白藜芦醇在不同深共晶溶剂（DESs）中的溶解度，本研究利用了Klamt等人开发的类导体筛选模型（COSMO-RS）[28] [29] [30]。作为一种基于量子化学的热力学方法，COSMO-RS无需大量实验数据即可高效筛选溶剂候选者，从而显著加快了特定应用的最佳溶剂设计和选择[31] [32]。

基于关于使用深共晶溶剂从植物基质中提取多酚化合物的已发表研究，并遵循天然无毒性的原则，选择了一组适合提取白藜芦醇的深共晶溶剂组分系统（表1）。这些系统包括四种氢键接受体（HBAs）——甜菜碱（Bet）、氯化胆碱（ChCl）、乳酸（LA）和L-脯氨酸（Pro）——以及十一种氢键给体（HBDs）：甘油（Gl）、乳酸（LA）、丙二醇（PG）、苹果酸（MA）、柠檬酸（CA）、果糖（Fru）、葡萄糖（Glu）、山梨醇（Sor）和麦芽糖（Mal）和L-脯氨酸（Pro）。

表1. COSMO-RS筛选预测中使用的HBA和HBD

编号 名称 分子量（g/mol） σ-surface
1 氯化胆碱 67–48 -11 39.62 2
2 甘油 56–81 -5 9.08 3
3 乳酸 50–21 -5 9.08 4
4 丙二醇 57–55 -6 6.09 5
5 柠檬酸 77–92 -9 19 2.12 6
6 苹果酸 69 15–15 -7 13 4.09 7
7 葡萄糖 50–99 -7 18 0.16 8
8 果糖 57–48 -7 18 0.16 9
9 山梨醇 50–70 -4 18 2.17 10
10 麦芽糖 69–79 -4 3 2.3 11
11 L-脯氨酸 147–85 -3 11 5.13 12

所有化合物结构均来自PubChem数据库。每个分子结构随后通过Materials Studio 2023中的DMol3包进行量子化学计算。几何结构进行了完全优化，然后在COSMO溶剂化模型下使用DNP基组进行了单点能量计算，该模型将周围介质视为完美导体[26] [33] [34]。这一步的主要输出是σ-轮廓（p(σ)，表示分子表面的筛选电荷密度（σ）概率分布。σ-轮廓作为唯一指纹，编码了分子的极性和氢键能力。对于每种深共晶溶剂，σ-轮廓是通过个别HBA和HBD表面电荷分布的摩尔分数加权平均值得到的。NADES系统通过合并一摩尔HBA和一摩尔HBD表示为伪簇。所有后续的COSMO-RS评估均在COSMOThermX v18中使用相关参数集执行，得到的无限稀释活度系数（γ∞）由公式（3）定义，作为理想溶质-溶剂亲和力的衡量标准：

(3) lnγ∞ = μsolvent - μipure

γ∞是无限稀释活度系数；μsolvent和μipure分别表示在无限稀释时白藜芦醇在溶剂相和纯相中的化学势。根据热力学原理，ln(γ∞)的值越低，表示溶质-溶剂相互作用越强，从而预测固体溶质的溶解度越大。

2.3.2. 深共晶溶剂的制备和实验验证

根据COSMO-RS模型的筛选结果，合成了表现最佳的三种深共晶溶剂（DESs）。在本研究中，深共晶溶剂（DESs）使用氯化胆碱作为氢键接受体（HBA），并与三种氢键给体（HBDs）之一——丙二醇（PG）、甘油（Gly）或L-脯氨酸（Pro）——按1:2的固定摩尔比（HBA:HBD）混合。混合物在圆底烧瓶中连续磁力搅拌下加热至80°C，直至形成透明 homogeneous液体。在搅拌过程中加入一定量的水，使最终水含量达到20%（重量/重量），从而得到稳定的、透明的 homogeneous液体。通过使用第2.2.2节描述的程序，利用表现最佳的深共晶溶剂从虎杖中提取白藜芦醇，验证了COSMO-RS模型的理论预测。

2.4. 单因素实验

使用基于ChCl-Gly的深共晶溶剂（1:2 M比，含水量20%）优化了提取过程，以从虎杖中回收白藜芦醇。通过单因素实验优化了四个关键提取参数——时间（10–50分钟）、超声功率（100–250 W）、温度（40–70°C）和液固比（10–50 mL/g）。在保持其他参数不变的情况下，系统地改变每个因素以评估其单独的影响。这项单因素研究的主要目标是确定关键变量的近似最优水平（中心点），这些水平随后成为设计更高效的响应面方法分析的基础。2.5 响应面方法（RSM）优化在单因素实验结果的指导下，使用四因素三水平的Box-Behnken设计（BBD）进一步优化了从P. cuspidatum中提取白藜芦醇的条件。本研究指定的独立变量为提取时间（X1）、超声功率（X2）、提取温度（X3）和液固比（X4）。每个因素被赋予三个编码水平：-1（低）、0（中）和+1（高），其具体值列在表2中。实验设计共包括29次运行，其中包括五个中心点以估计纯误差。目标变量是白藜芦醇的产量。通过将二阶多项式方程拟合到实验数据上来建模变量与响应之间的关系：(4)Y=β0+∑i=14βiXi+∑i=14βiiXi2+∑i +0.0082 e ??2）。下载：下载高分辨率图像（616KB）下载：下载全尺寸图像图2. 白藜芦醇、Gly、PG和L-Pro的σ-表面（A）、σ-曲线（B）和σ-势（C）。如图2B1所示，白藜芦醇具有主要为疏水的表面，其σ-曲线中的非极性区域有一个明显的峰值。在HBA区域，尽管概率密度较低，但相应的σ-势（图2B2）显著下降，反映了10–40 kJ mol?1范围内的氢键相互作用，这比范德华相互作用（1–5 kJ mol?1）强得多。因此，尽管其表面疏水性很强，白藜芦醇的溶解行为主要受极性σ区域中的氢键相互作用支配。对σ-势曲线（图2B2）的分析显示，白藜芦醇在HBA区域显示出强烈的负势，而在HBD区域接近零。这表明白藜芦醇主要作为氢键受体而不是供体。因此，具有强HBD特性的溶剂预计会与白藜芦醇形成有利的方向性氢键。根据σ-互补性原则，最适合白藜芦醇的溶剂应同时提供足够的非极性相互作用和强的HBD能力。比较三种候选溶剂的σ-势（图2C1和C2）表明以下溶解度增强潜力：甘油 > 丙二醇 > L-脯氨酸。这一顺序与其氢键供体强度和非极性匹配一致，这是根据σ-曲线得出的。应该强调的是，目前的比较基于所有三种DESs都含有ChCl作为HBA成分这一关键前提。因此，图2C中观察到的σ-曲线差异以及推断出的溶解度增强潜力直接反映了不同的氢键供体（Gly、PG和L-Pro）与白藜芦醇相互作用的相对效率。这证实了溶剂的氢键供体能力对于溶解白藜芦醇至关重要。正如本研究中所应用的COSMO-RS模型，证明是在实验验证之前合理预选深度共晶溶剂（DES）的强大而有效的工具。与耗时且资源密集的试错方法不同，COSMO-RS能够基于分子结构快速评估溶质-溶剂相互作用[35]，[36]。σ-曲线和σ-势分析提供了白藜芦醇与各种氢键供体（HBDs）之间亲和力的机制洞察。具体来说，白藜芦醇在氢键受体（HBA）区域的强烈负势证实了其作为氢键受体的作用，而在非极性区域的正势表明其具有疏水性兼容性。这些发现与先前关于多酚化合物如木犀草素和穿心莲内酯的研究一致，其中氢键和非极性相互作用被认为是DES中溶解度的关键驱动因素[26]，[37]。3.2 实验验证深度共晶溶剂（DES）由不同的HBA和HBD组成，赋予它们不同的物理化学性质。如图3A所示，这些性质差异导致不同DES中白藜芦醇产量的显著变化。值得注意的是，ChCl-Gly的提取产量明显高于其他溶剂。这一结果与COSMO-RS模型和σ-势分析的预测非常吻合，从而验证了这种理论方法进行合理溶剂筛选的可靠性。正如COSMO-RS模型和σ-势分析的预测一样，排名最高的DES系统如ChCl-Gly和ChCl-PG也表现出最高的实验提取效率。这种强相关性突显了COSMO-RS在指导天然产物提取溶剂选择中的实用性，Norhidzam等人[22]和Du等人[23]分别对boswellic acid和精油也报告了类似的结果。重要的是，模拟中包含20%水（图1B）通过考虑粘度降低和氢键网络的调节来 refined 预测，这在实际提取系统中至关重要[38]。这种两步筛选策略——首先是无水状态，然后是加水状态——增强了COSMO-RS的实际相关性，并支持其在绿色溶剂设计中的更广泛应用。下载：下载高分辨率图像（231KB）下载：下载全尺寸图像图3. 用于从P. cuspidatum中超声辅助提取（UAE）白藜芦醇的深度共晶溶剂（DES）系统的筛选。(A) DES类型，(B) 摩尔比，(C) 含水量。数据为平均值±标准偏差，n = 3。具有不同小写字母的列具有显著差异（p < 0.05）；相同的字母表示无显著差异（p > 0.05）。在确定ChCl-Gly为最佳溶剂系统后，进一步研究了其组分摩尔比和水含量对提取产量的影响。图3B表明，在固定条件下，ChCl与Gly的摩尔比显著影响提取产量。在测试范围内（HBA:HBD从1:1到1:4），随着Gly比例的增加，白藜芦醇产量最初增加然后减少，在摩尔比为1:2时达到最大值。这一趋势表明存在最佳的氢键供体（HBD）浓度。适量的Gly提供了足够的氢键位点以实现有效的白藜芦醇溶解，而过量的甘油比例可能会破坏HBA和HBD之间形成的稳定DES结构或显著增加粘度，从而降低传质效率。此外，水作为一种常见的DES添加剂，对于调节溶剂的物理化学特性至关重要。如图3C所示，提取产量明显依赖于水含量。从10%到20%的水含量，产量最初增加，之后逐渐减少，峰值出现在约20%时。这种增强主要是由于适度的水含量降低了DES系统的粘度，从而提高了流动性和渗透性，促进了白藜芦醇从植物基质中的扩散和分解。然而，当水含量超过40%时，产量急剧下降。这种下降可能是由于水过度稀释并破坏了由密集氢键网络维持的DES的独特三维结构，从而削弱了与白藜芦醇分子的关键相互作用。对于ChCl-Gly系统而言，不仅其化学组成，还包括其组分的精确摩尔比和适当的水含量是决定提取性能的关键参数。摩尔比为1:2且含水量为20%被认为是最佳的，实现了该系统中最高的白藜芦醇提取效率。3.3 单因素实验结果3.3.1。提取时间对白藜芦醇产率的影响

图4A显示了提取时间对白藜芦醇产率的影响。随着提取时间从10分钟延长到20分钟，产率显著增加。这一趋势表明，更长的提取时间有助于溶剂更彻底地渗透，并增强目标化合物的传质效果。然而，当提取时间超过20分钟达到50分钟时，产率开始逐渐下降。观察到的下降可能是由于长时间暴露在较高温度下，导致白藜芦醇发生氧化降解。因此，最佳提取时间被确定为二十分钟。

图4. 不同参数对白藜芦醇产率的影响。(A) 超声波处理时间，(B) 超声波功率，(C) 提取温度，(D) 液固比。

3.3.2. 超声波功率对白藜芦醇产率的影响

在上述最佳条件下，研究了超声波功率对白藜芦醇产率的影响。图4B显示，随着超声波功率的增加，白藜芦醇的产率先上升后下降。在200瓦的功率下获得了最高的产率。这可能是因为超声波的空化效应随着功率的增加而增强，使得P. cuspidatum细胞完全破裂，促进了溶剂与底物之间的接触，从而提高了白藜芦醇的产率[39]。然而，过高的超声波功率会导致某些分子结构受损，并使更多的杂质与溶剂结合[40][41]。因此，选择200瓦作为进一步研究的重点。

3.3.3. 提取温度对白藜芦醇产率的影响

如图4C所示，提取温度对白藜芦醇产率有显著影响。产率随着温度的升高（30–60°C）而稳步增加，在60°C时达到最大值约4.35毫克/克。这种正相关关系可以归因于在较高温度下目标化合物的分子运动性增强和溶解度提高，有利于其从植物基质中扩散到溶剂中。因此，选择60°C作为后续实验的最佳提取温度。

3.3.4. 液固比对白藜芦醇产率的影响

如图4D所示，白藜芦醇的产率随液固比的增加而增加，在30毫升/克时达到最大值。然而，当液固比继续增加时，产率反而下降。这可能是由于提取溶剂的体积增大，虽然有助于传质和提取，但过大的体积可能导致后续处理过程中的困难、能耗增加以及白藜芦醇的损失[42]。因此，选择30毫升/克作为进一步研究的重点。

3.4. 采用响应面法（RSM）优化从P. Cuspidatum中提取白藜芦醇的过程

3.4.1. 模型拟合和统计分析

采用了一个四因素、三水平的实验设计（包含29次实验），研究了提取时间（X1）、超声波功率（X2）、温度（X3）和液固比（X4）对白藜芦醇产率（Y）的影响（表3）。实验数据通过多项式回归模型进行拟合，将响应表示为独立变量的函数：

表3. 实验数据

提取时间（分钟）
超声波功率（W）
提取温度（°C）
液固比（mL/g）
实际值
RSM预测值

20
150
60
30
2.93
2.88
230
150
60
30
2.98
2.89
310
250
60
30
2.49
2.57
430
250
60
30
2.92.95
520
200
50
20
2.35
2.33
620
200
70
20
3.22
3.11
720
200
50
40
2.41
2.48
2020
070
40
3.98
3.89
910
200
60
20
2.74
2.81
1030
200
60
20
2.54
2.62
1110
200
60
40
2.92.83
1230
200
60
40
3.25
3.32
1320
150
50
30
2.06
2.26
1420
250
50
30
2.24
2.16
1520
150
70
30
3.21
3.42
1620
250
70
30
3.34
3.27
1710
200
50
30
21.89
1830
200
50
30
1.93
1910
200
70
30
3.03
3.11
2030
200
70
30
3.02
3.12
2120
150
60
20
2.98
2.79
2220
250
60
20
3.03
32320
150
60
40
3.75
3.66
2420
250
60
40
3.11
3.18
2520
200
60
30
4.35
4.27
2620
200
60
30
4.35
4.27
2720
200
60
30
4.19
4.27
2820
200
60
30
4.14
4.27
2920
200
60
30
4.32
4.27

注：X1、X2、X3和X4分别表示提取时间（分钟）、超声波功率（W）、提取温度（°C）和液固比（mL/g）。

Y = -46.34208 + 0.2765X1 + 0.10405X2 + 1.06925X3 + 0.228917X4 + 0.00018X1X2 + 0.00015X1X3 + 0.001375X1X4 ? 0.000025X2X3 ? 0.000345X2X4 + 0.001750X3X4 ? 0.008958X12 ? 0.000243X22 ? 0.008858X32 - 0.004521X42。

建立的二次方程模型具有很高的显著性，ANOVA分析表明（表4），p值<0.0001，F值为52.17。这表明该模型在统计上是可靠的，并且能够准确预测实验范围内的白藜芦醇产率。非显著的拟合缺乏（p > 0.05）进一步验证了模型准确表示实际因素-响应关系的能力。模型中因素X3（温度）和X4（液固比）的线性系数均为显著因素（p < 0.05），强调了它们在提取过程中的关键作用。相比之下，提取时间（X1）和超声波功率（X2）的线性系数在5%的水平上没有显示出统计显著性。交互项X2X4（超声波功率和液固比）和X3X4（提取温度和液固比）以及所有二次项都极其显著（p < 0.0001）。ANOVA验证了二次方程模型作为导航设计空间的可靠工具。交互效应和二次效应的重要性说明了使用RSM而不是简单线性模型来确定从P. cuspidatum中提取白藜芦醇的最佳条件是合理的。

表4. 二次方程模型的ANOVA分析

源
平方和
df
均方
F值
p值

模型
14.32
141.025
2.17
< 0.0001
显著

X1-提取时间
0.0234
10.0234
1.19
0.293

X2-超声波功率
0.0533
10.0533
2.72
0.1213

X3-提取温度
3.86
13.86
197.14
< 0.0001

X4-液固比
0.5376
10.5376
27.42
0.0001

X1X2
0.0324
10.0324
1.65
0.2194

X1X3
0.0009
10.0009
0.0459
0.8334

X1X4
0.0756
10.0756
3.86
0.0697

X2X3
0.0006
10.0006
0.0319
0.8608

X2X4
0.1191
10.1196
0.0273

X3X4
0.1225
10.1225
6.25
0.0255

X125.21
15.21
265.53
< 0.0001

X22
2.39
12.39
121.94
< 0.0001

X325.09
15.09
259.64
< 0.0001

X42
1.33
11.33
67.62
< 0.0001

残差
0.2745
140.0196
缺乏拟合
0.2359
100.0236
2.44
0.2017

不显著

纯误差
0.0386
40.0096

总合
14.59
283.4

2. 响应面分析

通过生成的响应面图直观地解释了关键过程参数对白藜芦醇产率的交互效应。图5A和图5B显示了超声波功率（X2）和液固比（X4）之间的交互作用。ANOVA确认这种交互作用（X2X4）非常显著。等高线的明显椭圆形状证实了这两个参数之间的强相互作用。响应面显示出一个明显的峰值，表明存在一个最佳的液固比和超声波功率组合，可以最大化产率。该峰值的坐标与预测的最佳值（约195瓦和33.3毫升/克）相符。

图5. 3D响应面图和等高线图反映了提取参数对P. cuspidatum中白藜芦醇产率的交互效应：超声波功率和液固比（A, B）；提取温度和液固比（C, D）。同样，提取温度（X3）和液固比（X4）的交互效应在图5C和图5D中也得到了体现。X3X4交互项的显著性体现在图的鞍形或峰值表面上。产率随着温度的升高而显著增加，达到一个最佳点后开始下降。等高线图有助于识别最大产率区域，该区域的温度约为64°C，液固比为33.3毫升/克。这些响应面的分析共同确定了最佳的操作窗口，表明在20.5分钟、195瓦、64°C和33.3毫升/克的参数下可以获得最大产率（4.41毫克/克）。

3.4.3. 模型的验证

通过在确定的最佳条件下进行的实验验证了所建立模型的预测能力。为了适应设备限制，超声波功率调整为200瓦。结果如表5所示，实验产率为4.45 ± 0.24毫克/克，与模型预测的4.41毫克/克非常接近。实验值与预测值之间的强一致性验证了RSM模型的稳健性，并确认了其在优化P. cuspidatum中提取白藜芦醇的实际价值。

表5. 最佳条件下的预测值和实验值

最佳条件
提取时间（分钟）
超声波功率（W）
提取温度（°C）
液固比（mL/g）
预测值
实验值

20
200
64
33.3
4.41
4.45 ± 0.24

3.5.1. 与传统回流提取方法的比较

优化后的UAE过程的提取效率与传统乙醇回流提取（ERE）方法进行了定量评估。如图6G所示，通过优化后的UAE过程获得的白藜芦醇产率为4.45 ± 0.24毫克/克，与ERE方法获得的产率（4.37 ± 0.35毫克/克）没有统计学上的显著差异。值得注意的是，UAE过程在较短的提取时间（20.5分钟）内就达到了相当的产率，而ERE方法需要60分钟。这一结果证实了所提出的UAE技术能够达到与现有基准相当的提取效率。

图6. UAE和乙醇回流提取对白藜芦醇产率的影响（G）以及P. cuspidatum粉末的扫描电子显微镜（SEM）显微形貌的比较（A: × 300；C: × 500；E: × 1500），以及80%乙醇回流提取的残渣样品（B: ×300；D: ×500；F: ×1500）。

本研究使用ChCl-Gly基UAE方法获得的提取效率（4.45毫克/克）与最近报道的几种P. cuspidatum白藜芦醇提取方法相比具有优势。例如，一项使用甜菜碱-DL-苹果酸NADES结合超声波辅助提取的方法仅获得了2.95毫克/克的产率（通过HPLC分析），远低于本研究的产率[43]。值得注意的是，一些研究报道了更高的白藜芦醇产率（例如，使用酸性DES的产率为12.26毫克/克[21]），但这些方法通常涉及腐蚀性酸或较长的处理时间，可能影响其环境可持续性。相比之下，所提出的DES-UAE方法在产率上可与传统乙醇回流提取相媲美（本研究为4.37毫克/克），同时减少了三分之二的提取时间，降低了能耗，并消除了挥发性有机化合物。这与制药和营养保健品行业向绿色提取技术发展的趋势一致[13][44]。

3.5.2. 提取后粉末的显微比较

使用扫描电子显微镜（SEM）在300×、500×和1500×的放大倍率下研究了深共熔溶剂辅助提取（DES-UAE）和传统乙醇回流提取（ERE）得到的残渣粉末的形态特征（图6，A、C、E为DES-UAE；B、D、F为ERE）。在宏观颗粒级别（300×，图6A和B），可以明显看到颗粒大小和完整性的显著差异。DES-UAE粉末（图6A）由更细小且不规则的碎片组成，形成了松散的团聚体。这与ERE样品（图6B）形成鲜明对比，ERE样品中的植物组织保持了更大、更连贯的颗粒结构。这一观察立即表明，深共熔溶剂和超声波空化的联合作用对植物基质的破坏作用远大于乙醇的热处理。

在更高放大倍率（500×和1500×）下，可以进一步阐明这种宏观差异的细胞级起源。DES-UAE残渣（图6C和E）显示出完全分解的微观结构。细胞壁严重破裂，结构不连续，形成了无细胞组织的碎片景观。这种极端的破坏可以归因于协同效应：深共熔溶剂有效地破坏了氢键并溶解了结构成分，如木质素和半纤维素，从而削弱了细胞壁的完整性。随后，超声波产生的强大空化力有效地撕裂了预先弱化的基质，导致完全的机械破坏。

相比之下，ERE残渣（图6D和F）在相同的放大倍率下显示出保存完好的细胞结构。即使在1500×（图1F）下，也清晰可见连续的蜂窝状细胞壁结构。孔隙完整且均匀，表明萃取过程没有导致细胞壁骨架的灾难性破坏。SEM的形态学证据也支持了DES-UAE的机械优势。 Zhao等人[14]和Qi等人[19]的研究发现，超声波空化和DES诱导的基质膨胀的协同作用增强了提取效果。

3.6. 提取周期的比较

基于优化后的参数，本研究进一步研究了提取周期数对白藜芦醇产率的影响。如图7所示，周期数的增加对产率有显著影响。将周期数从1增加到2会使产率显著增加（p < 0.05），表明单次提取无法完全释放目标化合物。然而，超过两个周期后，产率趋于平稳，没有观察到统计学上的显著差异（p > 0.05）。提取时间对白藜芦醇产率的影响。这种行为符合提取动力学原理：初始浓度梯度较陡，能够推动高效的质量传递并导致产率迅速上升；随着循环次数的增加，基质中的残留溶质减少，梯度变平，后续的提取效率也随之下降。此外，过多的循环次数可能会导致溶剂浪费、能耗增加以及潜在的热降解。因此，尽管理论上通过增加循环次数可以略微提高产率，但从整体效率、能源使用和经济效益来看，两次提取循环是一个最佳选择。这一发现为工业过程的优化提供了重要的参考依据。

4. 结论

本研究建立了一种绿色且高效的超声波辅助提取（UAE）方法，用于从Bidens cuspidatum中提取白藜芦醇，所选深共晶溶剂（DES）是通过COSMO-RS筛选合理确定的。基于预测的溶质-溶剂相互作用，确定了最优溶剂体系——ChCl-Gly（1:2，含20%的水），并通过实验进行了验证。在通过响应面方法优化的条件下（20.5分钟，200瓦特，64摄氏度，33.3毫升/克），该方法实现了4.45毫克/克的白藜芦醇产率，与传统乙醇回流提取（ERE）相当。关键在于，该方法将提取时间从60分钟（ERE）缩短到了仅20.5分钟，效率提高了三倍。扫描电子显微镜（SEM）分析进一步表明，DES与超声波的协同作用导致细胞壁破坏更为严重，阐明了目标化合物快速高效释放的机制。COSMO-RS在高效筛选候选溶剂方面发挥了重要作用，避免了反复试验的必要性，并凸显了计算工具在绿色溶剂设计中的价值。总体而言，基于COSMO-RS指导的DES-UAE策略为从植物基质中提取白藜芦醇提供了一种快速、可持续且针对特定化合物的替代方法。

作者贡献声明：

卢一桐：撰写——原始草案，实验研究；
宋子萌：数据分析；
陈鹏军：数据管理；
盛尊来：撰写——审阅与编辑，资金筹集，概念构思；
吴志勇：概念构思。