基于重组N-P融合蛋白的间接ELISA方法的开发与验证：用于检测鹦鹉科鸟类中针对鹦鹉出生病毒的抗体

《The Veterinary Journal》：Development and validation of an indirect ELISA based on recombinant N-P fusion protein for detecting antibodies against parrot bornavirus in psittacine birds

　　**标题：** Parut Suksai | Siriluk Jala | Phawaran Meetipit | Piyaporn Kongmakee | Preeda Lertwatcharasarakul
**摘要：** 鹦鹉出生病毒（PaBV）是鹦形目鸟类的重要病原体，也是导管扩张症（PDD）的致病因素。虽然无症状感染较为常见，但临床表现多样，给诊断和疾病控制带来了很大挑战。本研究开发并验证了一种基于重组核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）及由PaBV-4衍生的N-P融合蛋白的间接酶联免疫吸附试验（iELISA），用于检测鹦形目鸟类中特异性抗体。通过计算机模拟表位预测和抗原性评分，确定了免疫优势区域。重组蛋白被表达、纯化，并通过Western blot验证其对PaBV阳性血清具有特异性反应。其中N-P融合蛋白（48 kDa）显示出最高的信号强度和敏感性。优化后的iELISA在样本阳性比（S/P）为0.2064时，灵敏度为92.9%，特异性为96.7%，且未检出与其他禽类病原体的交叉反应。接收者操作特征（ROC）曲线分析显示AUC为0.985，表明该检测方法具有出色的诊断准确性。对泰国Bang Khen校区Kasetsart大学兽医学院动物健康与生物医学科学研究项目的208份鹦形目鸟类血清样本进行检测，发现PaBV血清阳性率为68.27%，提示亚临床感染普遍存在。这种开发的iELISA是一种可靠且实用的工具，有助于PaBV的血清学监测，并可补充分子诊断方法，以改进疾病监测和控制。

**引言：** 鹦鹉出生病毒（PaBV）是一种无分段的、有包膜的、负链单链RNA病毒，属于Bornaviridae科，主要感染鹦形目鸟类（Rubbenstroth, 2022）。目前已鉴定出8种基因型（PaBV-1至PaBV-8），其中PaBV-2和PaBV-4在全球分布最广（Rubbenstroth, 2022）。PaBV是导管扩张症（PDD）的致病因子，这是一种严重的鹦形目鸟类疾病，表现为慢性神经和胃肠道障碍（Rubbenstroth, 2022）。该病毒首次被发现于2008年，会损害肠道神经系统，导致胃肠道功能受损和临床症状，如消化不良、体重下降、嗉囊积液、肠道肿大、反流，在严重情况下甚至会导致饥饿和死亡（Honkavuori等人，2008；Kistler等人，2008；Rubbenstroth, 2022）。临床上传染还可能侵入中枢神经系统，引起震颤、共济失调、瘫痪、抽搐、自残，在极端情况下还会导致心律不齐、失明或认知缺陷（Rubbenstroth, 2022）。此外，PaBV还常引发心肌炎和神经节神经炎，尤其是在心脏组织中，这种心脏趋向性可能是导致感染鸟类死亡的原因之一（Fujiwara等人，2024；Villanueva等人，2024）。临床症状差异显著，从突然死亡和慢性疾病到完全康复或持续无症状感染都有（Rubbenstroth, 2022）。这种广泛的临床变异性以及无症状携带者的普遍存在，凸显了标准化和高度敏感诊断方法的必要性。全球70多种笼养鹦形目鸟类中都报道了PDD病例（Gancz等人，2010）。在健康和患病鸟类中均检测到了针对PaBV的抗体，多项研究的阳性率超过20%（Chen等人，2024；de Kloet等人，2011；de Kloet和Dorrestein，2009；Sa-ardta等人，2019；Vondrá?ková等人，2014）。在亚洲，PaBV的流行率较高但存在差异，泰国为48.7%（Sa-ardta等人，2019），台湾为25.68%（Chen等人，2024）。分子监测显示，中国检出率为2.12%，日本为4.3%，马来西亚为4.5%，台湾为45.97%，韩国为5.54%，泰国为13.85–29.73%（Hong等人，2024；Lutpi等人，2022；Sa-ardta等人，2019；Sassa等人，2013；Suksai等人，2025；Villanueva等人，2024；Zhang等人，2023）。在泰国检测到了PaBV-2、PaBV-4和PaBV-5，其中PaBV-4是最常见的基因型（Sa-ardta等人，2019；Suksai等人，2025）。尽管全球对PaBV感染的认知日益增加，但目前尚无商业疫苗，疾病控制仍依赖于管理措施和对症治疗（Rubbenstroth, 2022）。特别是对于无症状携带者而言，早期和准确的诊断仍然具有挑战性。PaBV编码六种结构蛋白和非结构蛋白：核蛋白（N）、辅助蛋白p10（X）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）以及依赖RNA的大RNA聚合酶（L）（Rubbenstroth, 2022）。N和P蛋白是感染细胞中最丰富的病毒蛋白（Zimmermann等人，2014）。疫苗实验表明这些蛋白能引发强烈的免疫反应，并可能提供针对禽类出生病毒感染的防护作用（Hameed等人，2018；Olbert等人，2016；Runge等人，2017），重组N和P蛋白也被用于检测针对特定禽类出生病毒抗原的抗体（de Kloet等人，2011；Kerski等人，2012）。

**当前诊断方法：** 当前的诊断方法主要依赖分子技术，如逆转录PCR（RT-PCR）和RT-定量PCR（RT-qPCR），针对M、N、X、P和L基因等基因组区域（Guo等人，2014；Honkavuori等人，2008；Horie等人，2012；Kistler等人，2008；Sigrist等人，2021；Weissenb?ck等人，2009）。然而，这些方法受病毒脱落不一致性的限制，尤其是在无症状鸟类中（Heffels-Redmann等人，2011；Heffels-Redmann等人，2012；Rubbenstroth，2022）。血清学检测（如ELISA）对于检测抗体和确认感染至关重要（Rubbenstroth, 2022）。重组N和P蛋白已被用作间接ELISA（iELISA）检测PaBV抗体的抗原（de Kloet等人，2011；de Kloet和Dorrestein，2009；Guo等人，2014；McHugh和de Kloet，2015；Sa-ardta等人，2019；Vondrá?ková等人，2014）。然而，尚无研究全面评估使用重组PaBV蛋白的iELISA性能，也未探索同时使用多种重组蛋白作为抗原的潜在优势。因此，本研究旨在开发并验证基于PaBV-4衍生的重组N、P和N-P融合蛋白的间接ELISA，以评估其在鹦形目鸟类中检测PaBV抗体的诊断性能。

**材料与方法：**
**样本收集：** 本研究共包含280份鹦形目鸟类的血清样本，包括72份参考样本和208份临床样本。参考样本组由42份PaBV阳性和30份PaBV阴性血清组成，这些样本之前已使用Sa-ardta等人（2019）描述的基于N蛋白的间接ELISA进行了鉴定。这些样本用于确定诊断临界值，并评估所开发iELISA的灵敏度和特异性。其余208份临床血清样本之前未检测过PaBV抗体。根据是否存在与PDD相关的临床症状对鸟类进行分类。这些样本采集于2022年至2024年间，来自Kasetsart大学Bang Khen校区和Kamphaeng Saen校区的兽医教学医院，以及由泰国皇家赞助的动物园组织管理的圈养鸟类。所有程序均按照Kasetsart大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行（协议编号：AUKU65-VET-068）。

**重组表达质粒的构建：** 本研究使用先前已发表的PaBV-4完整基因组序列（GenBank登录号JX065209）（Rubbenstroth等人，2012）作为N和P基因片段表位预测的基因模板。使用BioEdit软件中的Parker Hydrophilicity Prediction方法评估N和P基因编码蛋白的亲水性。线性B细胞表位通过BepiPred Linear Epitope Prediction 2.0和ABCPred服务器进行鉴定，这两种工具均可在IEDB平台上找到。Bepipred-2.0的默认阈值为0.5（Jespersen等人，2017）。ABCPred预测的阈值为0.8，窗口大小为16个氨基酸。此外，还使用NetMHCpan-4.1和NetMHCIIpan-4.0分别进行了针对主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类分子的T细胞表位预测。在NetMHCpan-4.1分析中，百分比排名低于0.5%的肽被视为强结合剂；而NetMHCIIpan-4.0中，排名低于2%的肽被视为强结合剂。然后使用VaxiJen v2.0服务器根据病毒蛋白模型评估预测表位的抗原性。抗原性得分高于默认阈值0.5的表位被视为潜在的保护性抗原。选择具有高亲水性和预测抗原性表位的片段进行截断和后续表达。截断的N和P基因片段被设计为N-P融合蛋白，该融合基因被克隆到pET-28b（+）表达载体中。为了便于定向克隆，在构建物的5'端和3'端分别引入了BamHI和HindIII限制位点。此外，在N和P片段之间插入了BglII和NotI限制位点以实现模块化组装。最终构建体经过密码子优化，以便在大肠杆菌（E. coli）中表达，并由商业服务实验室（Bio Basic Inc., Canada）合成。对于仅需要N基因片段的应用，构建体用NotI和HindIII消化以去除P基因，然后自连接以生成仅含N基因的质粒。相反，P基因片段通过顺序消化分离：首先用BamHI和HindIII切除N-P片段，再用BglII分离P基因。所有限制消化均使用FastDigest试剂（Thermo Scientific, USA）进行。分离出的P基因片段随后连接到预先用BamHI和HindIII消化的pET-28b（+）载体上。含有N或P基因片段的重组质粒使用T4 DNA连接酶（Thermo Scientific, USA）按制造商说明进行连接。

**重组蛋白的表达、纯化和鉴定：**
**表达：** 将含有重组质粒的大肠杆菌单菌落置于37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中过夜培养，培养基中添加了25 μg/mL的卡那霉素，并在180 rpm下摇动。将过夜培养物1:50稀释到新鲜LB培养基中，直到600 nm处的光密度（OD600）达到0.4-0.8。通过添加1 mM异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达，然后在37°C下培养4小时。
**纯化：** 细菌细胞在25°C下以9,500 rpm离心15分钟进行收获。所得沉淀物重新悬浮在溶菌酶溶液（1 mg/mL）中，然后通过超声处理裂解。裂解液再次离心，沉淀物在逐渐增加浓度的尿素溶液（1 M、2 M、4 M和8 M）中溶解以部分纯化。进一步纯化使用Ni-NTA亲和层析（?KTA startTM，GE Healthcare, UK），按照制造商说明进行。洗脱部分通过SDS-PAGE分析，并用Coomassie Brilliant Blue染色以评估蛋白质纯度。
**蛋白鉴定：** 通过Western blot分析确认轉染pET-28b（+）载体的大肠杆菌细胞中重组N-P、N和P蛋白的表达。通过SDS-PAGE分离的蛋白转移到硝化纤维素膜上，然后在37°C下用含有5%脱脂乳、10%马血清和0.02% NaN3的1X磷酸盐缓冲液（PBS）的封闭缓冲液中封闭30分钟。膜在37°C下用含有1:5000浓度的小鼠抗His标签单克隆抗体（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA）封闭30分钟，抗体稀释于含有5%脱脂乳、10%马血清、20%大肠杆菌BL21裂解物和0.02% NaN3的1X PBS的初级抗体缓冲液中。用1X PBS-T（0.05% Tween-20）洗三次后，膜在37°C下用结合有辣根过氧化物酶（HRP）的山羊抗小鼠IgG（1:1000；SeraCare, KPL, USA）孵育30分钟。再洗三次后，用3,3′,5,5′-四甲基苯二胺（TMB）膜过氧化物酶底物溶液（SeraCare, KPL, USA）在室温下孵育15分钟以检测蛋白。为了进一步确认重组N-P、N和P蛋白的抗原性，使用鹦形目鸟类血清进行了额外的Western blot分析。阳性血清和阴性血清按1:100稀释后作为初级抗体，然后用结合有HRP的山羊抗鸭IgG（1:500；SeraCare, KPL, USA）作为二级抗体。鹦鹉血清之前已经通过ELISA方法进行了表征，具体细节在之前的研究（Sa-ardta等人，2019年）中有描述。Western blot实验按照上述协议进行。

**iELISA方法的建立及条件优化**
为了确定抗原包被和血清稀释的最佳浓度，进行了棋盘式滴定测定。使用的抗原是纯化的重组蛋白。抗原包被浓度范围为20至0.156 μg/mL，以10、5、2.5、1.25、0.625和0.313 μg/mL的阶梯式稀释浓度进行测试。血清稀释比例包括1:25、1:50、1:100、1:200、1:400和1:800。此外，还测试了HRP结合的山羊抗鸭IgG在1:250和1:500稀释下的效果，以确定最佳二抗浓度。

重组蛋白被溶解在碳酸氢盐缓冲液（pH 9.6）中，然后以每孔100 μL的量加入96孔ELISA反应板（Greiner Bio-One，德国）。反应板在37°C下孵育1小时，以便抗原固定在孔壁上。孵育后，将PaBV阳性和PaBV阴性的血清样本（用一抗缓冲液稀释）加入孔中，并在37°C下孵育1小时30分钟。随后，用1X PBS-T清洗反应板五次，然后用300 μL的封闭缓冲液每孔封闭并在37°C下孵育30分钟。去除封闭缓冲液后，向每个孔中加入100 μL稀释的血清，并在37°C下再孵育30分钟。再次清洗后，加入100 μL的山羊抗鸭IgG-HRP结合物，并在37°C下孵育30分钟。最后清洗一次后，加入100 μL的KPL SureBlue? TMB微孔过氧化物酶底物（SeraCare，KPL，美国），并在室温下避光反应15分钟。通过加入100 μL的0.25 M硫酸终止反应。

使用微孔读数仪测量450 nm处的光密度（OD）。结果以样本与阳性对照（S/P）比值表示，计算公式为：S/P = 样本OD / 阳性对照OD。

**重组N-P、N和P蛋白作为iELISA抗原的评估**
对重组N-P、N和P蛋白进行了比较测试，以确定最适合用于开发的iELISA的抗原。该测定使用PaBV阳性和阴性血清作为一抗。每种重组蛋白在优化的iELISA条件下制备成10至0.078 μg/mL的系列浓度。测量每种重组蛋白在450 nm处的光密度（OD450），并比较其相对性能。

**iELISA的临界值的确定**
为了确定适当的阳性-阴性临界值，并评估iELISA的特异性和灵敏度，使用了42个阳性样本和30个阴性样本，这些样本之前已经通过基于重组N蛋白的iELISA进行了表征（Sa-ardta等人，2019年）。随后生成接收者操作特征（ROC）曲线，以确定iELISA的最佳阈值，该研究作为将样本分类为阳性或阴性的参考标准。ROC分析使用SPSS版本26 for Windows（SPSS Inc., USA）进行。计算ROC曲线下面积（AUC）以评估测定的整体诊断性能。

**iELISA效率的评估**
在优化条件下，通过内部和外部批次分析彻底评估了iELISA的重复性和再现性。对于内部批次评估，在单个ELISA板上对PaBV阳性和PaBV阴性的鹦鹉血清的混合样本进行了八次重复检测。对于外部批次变异性，将相同的混合样本在三个不同的ELISA板上进行了八次重复检测。计算每个样本的变异系数（CV），以确定测定的精确度和可靠性。

**交叉反应性的评估**
使用针对流感A病毒H5和H9亚型、新城疫病毒和衣原体属的阳性血清，按照建立的iELISA方案进行了交叉反应性评估。PaBV阳性和PaBV阴性的鹦鹉血清都被用作对照。

**临床样本抗体检测**
共收集了208个血清样本，并根据临床PDD状态和之前检测到的PaBV RNA进行分类。样本队列包括：7个同时具有临床PDD和可检测PaBV-4 RNA的样本；18个仅具有临床PDD但未检测到PaBV RNA的样本；11个没有临床PDD但有可检测PaBV RNA历史的样本（其中2个为PaBV-2，9个为PaBV-4）；以及172个既没有临床PDD也没有PaBV RNA历史的样本。注册兽医进行了临床评估，PaBV RNA通过针对N基因的已知引物（Villanueva等人，2010年）的嵌套RT-PCR技术检测到。这些血清样本随后用于评估开发的iELISA。使用皮尔逊卡方检验（Pearson Chi-square test）评估PaBV特异性抗体的存在与临床症状之间的关联。统计分析使用SPSS版本26 for Windows（SPSS Inc., USA）进行。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

**选择亲水性的N和P蛋白域**
BioEdit软件分析和Parker亲水性预测方法识别出N蛋白域中22-371氨基酸和P蛋白域中71-170氨基酸的两个高度亲水区域。这些区域还被预测含有具有潜在保护性抗原特性的B细胞和T细胞表位。

**N蛋白片段的B细胞表位预测**
使用BepiPred-2.0和VaxiJen进行了预测。识别出三个潜在的抗原表位，其抗原性得分从0.7152到1.0604不等。相比之下，ABCpred预测了20个抗原表位，得分范围为0.5537到1.2485。对于T细胞表位，NetMHCpan-4.1和VaxiJen预测了七个抗原表位（得分：0.6051-0.8859），而NetMHCIIpan-4.0和VaxiJen识别了五个抗原表位（得分：0.5405-0.8491）。对于P蛋白片段，BepiPred-2.0和VaxiJen分析识别出一个B细胞表位，其抗原性得分为1.0311。ABCpred预测了三个抗原表位，VaxiJen的得分范围为0.5405到0.8491。对于T细胞表位预测，NetMHCpan-4.1与VaxiJen共同识别出一个抗原表位（得分：0.8888）。NetMHCIIpan-4.0预测的所有表位的得分都低于VaxiJen的0.5阈值，被认为是非抗原性的。预测的抗原表位序列总结在表1中。

**表1. BepiPred-2.0、ABCpred、NetMHCpan-4.1、NetMHCIIpan-4.0和VaxiJen服务器对PaBV-4的N和P蛋白的B细胞和T细胞表位预测及抗原性分析结果**

**构建N-P基因融合蛋白**
选择这些亲水性氨基酸片段作为构建N-P基因融合蛋白的目标。选择了N蛋白（1,053 bp）和P蛋白（300 bp）的相应核苷酸序列用于构建重组N-P融合蛋白。

**表达、纯化和免疫反应性分析**
使用SDS-PAGE评估纯度，并通过Western blot分析评估免疫反应性。重组蛋白表现出与抗组氨酸抗体和PaBV阳性血清的特异性结合，但与PaBV阴性血清无反应。估计的分子量分别为：N-P融合蛋白约48 kDa，N蛋白约39 kDa，P蛋白约11 kDa（图3）。这些结果证实了重组蛋白的成功表达、纯化和抗原反应性，可用于后续的iELISA开发。

**iELISA的最佳反应条件**
使用棋盘式滴定方法确定了检测PaBV特异性抗体的最佳iELISA条件。最佳抗原包被浓度为10 μg/mL，最佳血清稀释比例为1:25。HRP结合的山羊抗鸭IgG二抗在1:500稀释下表现出最佳性能。

**比较评估**
使用PaBV阳性和阴性鹦鹉血清作为一抗，对重组N-P融合蛋白、N蛋白和P蛋白进行了比较评估，以确定最适合作为iELISA抗原的蛋白。N-P融合蛋白在低至2.5 μg/mL的抗原浓度下即可检测到反应性，而N蛋白需要5 μg/mL，P蛋白需要10 μg/mL才能达到相似的信号强度。这些结果表明，N-P融合蛋白作为开发的iELISA中的最佳抗原具有更优越的检测灵敏度。

**临界值的确定**
通过ROC曲线分析确定了开发的iELISA的诊断临界样本与阳性比值（S/P）值。使用之前基于重组N蛋白的iELISA（Sa-ardta等人，2019年）特征化的26个PaBV阴性血清样本作为参考样本，确定了临界阈值。ROC曲线得出AUC为0.985（95%置信区间[CI]：0.964-1.000），表明诊断性能优异（图4）。最佳临界值为S/P比值0.2064，相当于92.9%的灵敏度和96.7%的特异性。基于此阈值，S/P值等于或超过0.2064的血清样本被分类为阳性，低于此值的样本被分类为阴性。这些结果突显了所开发检测方法的准确性（图2）。

**iELISA效率的评估**
通过比较PaBV阳性和阴性血清样本的S/P比值，评估了iELISA的内部和外部批次变异性。内部批次变异性通过在一个ELISA板上的八次重复检测进行评估，外部批次变异性通过三个不同ELISA板上的八次重复检测确定。内部批次测量的变异系数（%CV）为阳性样本1.55%，阴性样本7.54%。外部批次测量的%CV分别为4.54%和8.64%。内部和外部批次变异性的%CV值均低于10%和11%。这些精确度测量的详细信息见表2。

**表2. 使用阴性和阳性鹦鹉血清进行的iELISA的内部和外部批次重复测试结果**

**评估潜在的交叉反应性**
使用开发的iELISA测试了流感A病毒H5和H9亚型、新城疫病毒和衣原体属的阳性血清。每项检测都包含了阳性对照和阴性对照。结果未显示出交叉反应性，非PaBV病原体的S/P值分别为0.054、0.0772、0和0.0244。PaBV阳性血清产生了阳性结果（S/P = 0.2998），而阴性对照则产生了阴性结果（S/P = 0.0252）。这些发现证实了所开发的iELISA在检测PaBV特异性抗体方面的高重复性、可重复性和特异性。

**临床样本结果**
共分析了208份血清样本，其中142份（68.27%）对PaBV特异性抗体呈阳性。大多数血清阳性样本（112/142）来自之前未检测到PaBV RNA的无症状鸟类。
在临床有症状的鸟类中，有21份样本血清呈阳性；值得注意的是，其中14份在检测时对PaBV RNA呈阴性。相反，在18份检测到PaBV RNA的鸟类中，有16份（88.9%）血清呈阳性。所有之前对PaBV-2 RNA呈阳性的鸟类都检测到了抗体，而在16份对PaBV-4 RNA呈阳性的鸟类中，有14份也检测到了抗体（见表3）。

**表3. 首饰鹦鹉中PaBV抗体的iELISA检测结果，与PDD临床表现和历史PaBV RNA检测结果相关**

| iELISA结果 | 临床症状 | 是否存在 | 总计 | RNA阳性 | RNA阴性 | RNA阳性 | RNA阴性 |
|---------|---------|-------|-------|-------|-------|-------|
| 正性 | 7 | 14 | 9 | 11 | 2 | 14 | |
| 阴性 | 0 | 4 | 2 | 6 | 0 | 6 | |
| 总计 | 7 | 18 | 11 | 17 | 20 | 108 |

在有症状且血清阳性的鸟类中，14只仅表现出胃肠道症状，而7只同时表现出神经系统和胃肠道症状。统计分析未显示PaBV抗体检测与临床症状组合或历史病毒RNA检测之间存在显著关联（P = 0.126）。PaBV抗体与临床症状单独存在（P = 0.072）或历史病毒RNA检测单独存在（P = 0.114）之间也未观察到显著关联，这表明血清阳性并不能可靠地预测活跃的疾病状态。我们的结果表明，鹦鹉中存在高比例的亚临床PaBV感染，强调了血清学筛查在全面监测中的重要性。

**讨论**
本研究描述了一种基于重组N–P融合蛋白的新型间接ELISA的开发和验证方法，用于检测鹦鹉中的PaBV特异性抗体。抗原设计是通过全面的计算机模拟表位预测来确定的，以识别N蛋白和P蛋白中的亲水区和免疫优势区。这些蛋白在感染期间表达丰富（Zimmermann等，2014）。先前的疫苗研究表明，这两种蛋白既能引发强烈的免疫反应，又可能提供针对禽类出生病毒感染的防护免疫力（Hameed等，2018；Olbert等，2016；Runge等，2017）。用纯化的N蛋白和P蛋白进行免疫可刺激CD4+ T细胞反应（N?ske等，1998；Planz等，1995），同时在N蛋白中鉴定出一个重要的CD8+ T细胞表位（Planz和Stitz，1999）。此外，这两种蛋白已被成功用作血清学抗原（de Kloet等，2011；Kerski等，2012），支持它们用于诊断开发。本研究采用的方法确保重组蛋白保留了抗体识别所需的关键抗原表位，这一点通过SDS-PAGE和Western blot分析得到了证实。Western blot结果显示，该蛋白与PaBV阳性血清具有特异性反应，而与PaBV阴性血清无反应，从而证实了其诊断适用性。
在比较重组N蛋白、P蛋白和N-P融合蛋白作为潜在的iELISA抗原时，N-P融合蛋白产生的免疫信号比单独的N蛋白或P蛋白更强。尽管之前的研究已将重组N蛋白和P蛋白提出作为iELISA中检测PaBV抗体的抗原（de Kloet等，2011；de Kloet和Dorrestein，2009；Guo等，2014；McHugh和de Kloet，2015；Sa-ardta等，2019；Vondrá?ková等，2014），但本研究是首次评估N-P融合蛋白。N蛋白被广泛认为具有高免疫原性（Guo等，2014），而抗P抗体通常检测到的滴度较低（de Kloet等，2011；McHugh和de Kloet，2015）。结合两种抗原域可能增加了表位密度并提高了抗体捕获效率。类似的多抗原策略已提高其他病原体的ELISA灵敏度（Fernandez等，2023；Jaramillo Ortiz等，2018；Li等，2022；Zheng等，2024），我们的发现支持这种方法用于PaBV血清学诊断。
二次抗体的选择也会影响检测性能。虽然之前的研究主要使用抗金刚鹦鹉或抗鸟类二次抗体（de Kloet等，2011；de Kloet和Dorrestein，2009；Guo等，2014；McHugh和de Kloet，2015；Vondrá?ková等，2014），但本研究使用了与HRP结合的山羊抗鸭IgG。尽管有报道称抗鸭抗体信号强度较低（Escandon等，2019），但本研究中优化抗体浓度后改善了信号性能。开发的检测方法显示出优异的诊断准确性，基于ROC曲线分析的AUC为0.985。
iELISA表现出高度的重复性和可重复性，内在和人际间的变异系数较低。未观察到与甲型流感病毒（H5和H9）、新城疫病毒和衣原体属血清的交叉反应性，支持了该检测方法的分析特异性。这在鸟类诊断环境中尤为重要，因为多种病原体的暴露很常见（Antonio等，2025；Bansal等，2022；Baydo等，2021；Blanco-González等，2024；Chowdhury等，2020；de León-Robles等，2021；Hawkins等，2006；Herrera等，2001；Mase等，2001；Riccio等，2024）。尽管对208份野外样本的检测显示血清阳性率为68.3%（142/208），但超过了泰国之前报告的48.7%（Sa-ardta等，2019）。该检测方法能检测到针对PaBV-2和PaBV-4的抗体。尽管血清阳性率较高，但未观察到血清阳性与PDD临床症状或先前病毒RNA检测之间存在显著关联。大多数血清阳性鸟类无症状，这与先前的报道一致，即PaBV感染的鹦鹉可能在保持持续抗体反应的同时仍然保持临床正常（Rubbenstroth，2022）。这些发现强调了血清学筛查在识别亚临床感染中的重要性。
尽管分子技术仍然是检测PaBV的参考标准，但其灵敏度可能受到间歇性或无病毒脱落的限制，从而导致假阴性结果（Rubbenstroth，2022）。因此，血清学检测方法应被视为评估宿主免疫反应的辅助工具，而不是活跃病毒脱落的指标。将血清学和分子诊断方法结合起来可以提供更全面的PaBV监测方法。
本研究成功开发并验证了一种使用重组N蛋白、P蛋白和N–P融合蛋白的iELISA，用于检测鹦鹉中的PaBV特异性抗体。鉴于目前缺乏许可疫苗且依赖于管理策略进行疾病控制（Rubbenstroth，2022），可靠的血清学工具对于监测至关重要。本文开发的iELISA是PaBV监测的宝贵补充。未来的研究应进一步评估其在更广泛鸟类群体中的性能，并扩大特异性范围。
仍有一些局限性需要考虑。未进行结构建模（包括分子对接分析），这可能提供有关抗原-抗体相互作用的额外机制见解。此外，也未进行基于细胞的正交验证。虽然对选定的病原体评估了分析特异性，但使用其他鹦鹉病毒（如禽多瘤病毒和鹦鹉喙羽病病毒）的确认阳性血清进行额外评估将加强验证。尽管存在这些局限性，本研究为可扩展的PaBV血清学监测奠定了坚实基础，并支持将该检测方法整合到常规的鸟类健康管理计划中。

**结论**
本研究开发并验证了一种使用重组N–P融合蛋白的高精度间接ELISA，用于检测鹦鹉中的PaBV特异性抗体。计算机模拟表位预测指导了免疫优势区的选择，从而支持了该构件的强免疫原性。N–P融合抗原的表现优于单独的N蛋白或P蛋白，提高了检测灵敏度和诊断区分度。应用于野外样本的结果显示了较高的血清阳性率，并突显了该检测方法在识别亚临床感染方面的实用性。总体而言，这种iELISA提供了一种实用且可靠的血清学工具，可补充诊断方法并支持全面的PaBV监测策略。

**资金声明**
本研究由卡塞萨特大学研究与发展研究所（KURDI）资助（项目编号：FF(KU-SRIU)8.68）。

**伦理声明**
所有实验程序均按照卡塞萨特大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行（方案编号：AUKU65-VET-068）。

**作者贡献声明**
Kongmadee Piyaporn：资源提供、调查。
Preeda Lertwatcharasarakul：撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目管理、资金获取、概念构思、初稿撰写。
Phawaran Meetipit：资源提供、调查。
Parut Suksai：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、调查、数据分析、数据管理、审稿与编辑。
Siriluk Jala：验证、方法学。

**编写过程中的人工智能和人工智能辅助技术声明**
在准备本手稿期间，作者主要使用ChatGPT（OpenAI，GPT-5）和Grammarly进行语言润色、可读性提升和格式调整。数据收集、统计分析或科学解释均未使用任何人工智能辅助技术。所有由AI生成的建议都经过作者的严格审查和编辑，作者对工作的准确性、完整性和最终内容负全责。