创新混合分子印迹传感器用于检测抗氧化生物标志物过氧化氢酶

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Innovative hybrid molecularly imprinted sensor for the detection of the antioxidant biomarker catalase

　　

在本研究中，研究人员构建、优化、表征并应用了一种基于新型混合分子印迹聚合物（MIP）的仿生传感器，用于电化学识别抗氧化生物标志物过氧化氢酶（CAT）。采用层叠方法制备混合传感器：首先，通过计时电流法在裸玻碳电极（GCE）上沉积银纳米颗粒（AgNPs）300秒，随后滴涂多壁碳纳米管（MWCNTs）；然后，在?0.2 V至0.8 V电位范围内，以邻氨基苯酚（OAP）为功能单体、过氧化氢酶为模板，在MWCNT/AgNP/GCE表面进行十次伏安电聚合循环，制备MIP。所制备的传感器在25–500 U/mL线性范围内对CAT呈现快速响应，检测限（LOD）为3.59 U/mL，且对多种测试的可能生物物种无交叉反应。CAT在生物样品中也被成功检测，回收率范围为95.73%至101.60%，相对标准偏差（RSD）为0.41–1.52%，与商业诊断参考试剂盒结果相当，且无需复杂取样步骤。传感器性能依赖于过氧化氢酶的分子识别而非对其底物的反应活性。这一特性，加上传感器的低成本和便携性，使其成为医学领域即时诊断（point-of-care diagnostics）的有前景候选方案。

以下是一篇基于论文原文的浓缩解读文章，按照要求以学术专业性文字总结，避免推测，全部内容均有原文出处。

**研究背景与问题**

酶控制着生物体内绝大多数化学反应。过氧化氢（H₂O₂）是生物系统中最常见的氧化形式之一，而过氧化氢酶（catalase, CAT）作为一种含血红素的四聚体酶，是关键的抗氧化酶，通过将H₂O₂转化为氧气和水来减轻细胞氧化应激，保护生物分子免受氧化损伤。CAT不仅存在于人类中，还存在于所有需氧微生物、动物和植物中。CAT还被报道为预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的有前景的生物医学工具，并作为甲状腺疾病的生物标志物（通过其过表达指示）。此外，CAT也是多种严重疾病的潜在生物学指标，这些疾病与CAT活性降低或改变相关，如帕金森病、II型糖尿病、癌性疾病、COVID-19、威尔森病、高血压、贫血、多种皮肤病、双相情感障碍、精神分裂症、阿尔茨海默病、心血管疾病和慢性阻塞性肺疾病等。

目前已有的CAT检测方法包括高效液相色谱法、分光光度法和化学发光法，但这些技术通常复杂且成本高昂，所用仪器昂贵或不易适配。电化学传感器作为一种快速可靠的替代方法已被广泛应用，例如使用由多壁碳纳米管（MWCNTs）修饰并在聚（藏红T）聚合物膜中包覆的玻碳电极（GCE）进行电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）检测，以及使用电化学沉积金纳米颗粒于MWCNTs/壳聚糖膜修饰GCE的流动注射分析法。分子印迹聚合物（MIPs）是一类可针对特定目标分析物进行设计和定制的合成聚合物基质，用作电化学传感器中的识别元件具有快速、经济、准确和选择性的独特优势。然而，文献检索表明，此前尚无研究将这类人工受体用于CAT检测。因此，本研究首次报道了分子印迹技术在CAT检测中的应用。

研究人员开展了何种研究：本研究首次提出了一种基于AgNPs和MWCNTs作为信号增强剂、OAP电聚合印迹聚合物作为CAT分子识别元件的混合MIP设计，用于CAT的全细胞识别，而不依赖酶对其底物（H₂O₂）的反应活性。传感器通过层叠方式制备，并在优化条件下对CAT进行检测和验证，最终应用于生物样品（血清和尿液），并与商业比色试剂盒进行比较。论文发表在《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用了层叠构建方法：首先，通过计时电流法在干净的GCE表面电沉积AgNPs（300秒，?0.8 V）；然后滴涂4 μL MWCNTs（1 mg/mL DMF）；接着，在?0.2 V至0.8 V电位范围内，以50 mV/s的扫描速率，用含有5 mM OAP和250 U/mL CAT的磷酸盐缓冲液（PBS，0.05 M，pH≈7）进行10次循环伏安电聚合，形成MIP薄膜。模板CAT的洗脱采用0.1 M H₂SO₄浸泡4分钟。所有电化学测量使用2.5 mM [Fe(CN)₆]^3?/4?（FCN）作为活性探针。生物样本来自健康志愿者的血清和尿液（血清样品需经甲醇沉淀蛋白处理，尿液样品离心后稀释）。传感器表面通过原子力显微镜（AFM）、扫描电子显微镜（SEM）以及循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）进行表征。

**研究结果**

**优化印迹前的电极表面**
通过计时电流法在不同时间（100–500秒）沉积AgNPs，发现300秒为最佳沉积时间。MWCNTs滴涂体积优化表明4 μL可有效增强电荷转移。所有优化实验通过差分脉冲伏安法（DPV）监测2.5 mM FCN溶液氧化电流的变化（ΔI）来确定。

**混合印迹传感器的制备**
在MWCNT/AgNP/GCE表面进行OAP电聚合（10个循环）制备MIP，循环伏安图显示OAP氧化电流随循环次数增加而下降，表明非导电聚合物膜形成。CAT的加入未引起电聚合伏安图的明显变化，说明CAT在电聚合过程中未发生电化学变化。

**实验参数优化**
电聚合循环次数优化显示，10个循环时ΔI最大；洗脱溶剂以0.1 M H₂SO₄效果最佳；洗脱时间以4分钟为最优；模板与单体比例（T:M）为1:2时ΔI最高；CAT再结合（rebinding）孵育时间3分钟即可达到最高ΔI，表明传感器响应快速。

**传感器表面表征**
AFM表征显示：裸GCE的均方根（RMS）粗糙度为1.94 nm，AgNP/GCE为7.42 nm，MWCNT/AgNP/GCE为1.59 nm，含CAT的MIP表面为10.07 nm，洗脱后CAT-free MIP表面为10.73 nm（证实成功去除CAT并形成空腔），NIP表面为10.90 nm。SEM图像证实AgNPs均匀沉积（平均粒径16.7±11.0 nm），MWCNTs管状结构均匀分布，MIP洗脱后出现凹腔，而NIP表面均匀无孔。CV和EIS表征表明：AgNP和MWCNT修饰显著增加峰电流、降低电荷转移电阻（Rct）；MIP膜形成后Rct增大（1636.0 Ω），洗脱后Rct降低，CAT再结合后Rct再次增大，证实了印迹和识别过程。不同扫描速率的CV实验表明FCN在MIP电极上的反应为扩散控制过程，Randles–Sevcik方程计算得有效表面积为0.498 cm²，约为裸GCE（0.071 cm²）的7倍。

**电化学性能**
CAT检测：在25–500 U/mL浓度范围内，ΔI与CAT浓度呈线性关系（R=0.993），线性方程为ΔI=0.156[CAT]（U/mL）+4.397，检测限（LOD）为3.59 U/mL（S/N=3）。选择性：在存在等摩尔、五倍和十倍浓度的葡萄糖、尿酸、肌酸、黄嘌呤或脲酶时，CAT的回收率在100.1%–103.7%之间，表明传感器对CAT具有高选择性。实际样品应用：在加标血清和尿液样品中，回收率范围为95.73%–101.60%，RSD为0.41%–1.52%，与商业比色试剂盒结果一致。验证实验表明：传感器具有良好的重现性（三个不同传感器RSD 2.60%）和重复性（同一传感器五次测量RSD 1.54%），并在4°C存放30天后仍保持初始响应的86.9%，稳定性高。

**总结讨论与结论翻译**

讨论部分指出，传感器的高选择性归因于印迹空腔对CAT的特异性识别，而非对底物H₂O₂的反应活性。相比于以往依赖酶活性的方法，本传感器直接测量酶分子浓度，避免了酶活性不稳定带来的限制，且具有成本低、便携、响应快等优势，适用于非侵入性即时检测。

**结论部分翻译**：本工作提出了第一个基于AgNPs和MWCNTs作为响应增强剂、OAP电聚合印迹聚合物作为CAT分子识别元件（而非对其底物的反应活性）的混合CAT传感器。CAT使用0.1 M H₂SO₄成功从MIP中洗脱，形成了与模板（CAT）形状和大小相当的互补空腔。这些空腔允许FCN探针通过，从而出现氧化还原峰。传感器在25–500 U/mL范围内呈线性，LOD为3.59 U/mL（S/N=3）。所提出的MIP/MWCNT/AgNP/GCE传感器无需复杂制备步骤，响应时间极短，可使用便携式设备，适用于临床即时诊断领域中对临床患者CAT水平的监测。