开发并验证了一种用于分析药膏中硫酸庆大霉素稳定性的高效液相色谱（HPTLC）方法 K. M. Yasif Kayes Sikdar, Md Khairul Islam, Edith Kai Yan Tang, Tomislav Sostaric, Lee Yong Lim, Cornelia Locher

《Applied Sciences》：Development and Validation of a Stability-Indicating HPTLC Method for the Analysis of Gentamicin Sulphate in Pharmaceutical Ointments K. M. Yasif Kayes Sikdar, Md Khairul Islam, Edith Kai Yan Tang, Tomislav Sostaric, Lee Yong Lim and Cornelia Locher

　　摘要：本研究开发并验证了一种用于检测和定量软膏制剂中硫酸庆大霉素的高性能薄层色谱（HPTLC）方法，该方法采用硅胶60 F254 HPTLC板作为固定相，甲醇：氯仿：氨溶液（25%）（1:1:1，v/v/v）作为流动相。分析前使用理想的溶剂比例（氯仿：甲醇，9:1，v/v）来溶解软膏样品。根据国际协调委员会（ICH）的指南，对该HPTLC方法进行了验证，通过分离出所有三个硫酸庆大霉素峰而未受到软膏辅料和/或光解、氧化、酸性和碱性应力条件下产生的降解产物的干扰，证明了其特异性。研究结果还显示，该方法在50–300 ng/峰的范围内具有较高的线性（R2 ≥ 0.99），检测限和定量限分别为7.10 ng和21.53 ng。此外，该方法不需要任何样品预处理，如从软膏基质中提取样品，因此适用于庆大霉素软膏的质量控制。

1. 引言
氨基糖苷类抗生素对于治疗严重的细菌感染至关重要[1]。从化学结构上看，它们由氨基糖通过糖苷键连接到氨基环醇部分组成[2]。这类抗生素具有广谱杀菌活性，主要针对革兰氏阴性和部分革兰氏阳性细菌引起的感染，但由于其肾毒性和耳毒性，治疗范围较窄[2,3]。因此，它们通常用于治疗风险大于益处的严重感染。对接受氨基糖苷类治疗的患者进行密切监测是必要的。庆大霉素、链霉素、卡那霉素和妥布霉素等氨基糖苷类抗生素来源于天然来源，特别是链霉菌和微单孢菌属；而迪贝卡辛、阿米卡星、奈替米星和异帕米星则属于半合成产物[1,2]。
本研究关注的庆大霉素是通过使用微单孢菌紫色菌株进行发酵生产的，通过结合细菌细胞的30S核糖体来抑制蛋白质合成[4,5,6]。庆大霉素包含三种主要活性成分，称为庆大霉素C1、C2和C1a（图1），以及一些次要相关物质[7]。图1显示了庆大霉素的化学结构。常用的硫酸庆大霉素在水中高度溶解，但缺乏发色团，这使得基于光谱检测的分析变得困难。根据欧洲和美国药典的规定，硫酸庆大霉素在药物制剂中的分析采用高效液相色谱结合脉冲安培检测（HPLC-PAD）[8,9]，但该方法在重现性、分离能力和稳健性方面存在一些局限性[10]。HPLC分析的另一个主要缺点是使用荧光或紫外分光光度检测时需要柱前衍生化[11,12,13,14]。其他分析方法如带电气溶胶检测液相色谱（LC-CAD）、脉冲电化学检测（LC-PED）、蒸发光散射检测高效液相色谱（HPLC-ELSD）、毛细管电泳（CE）结合紫外检测、液相色谱-质谱（LC-MS）以及反相液相色谱-质谱（RP-LC–MS）结合正电喷雾离子化（ESI）也可以使用，但这些方法要么耗时较长，要么成本较高[10,15,16,17,18,19]。除了上述方法外，硫酸庆大霉素还可以通过核磁共振（NMR）光谱、气相色谱-质谱（GC-MS）、薄层色谱（TLC）以及放射化学、放射免疫学和免疫酶学方法进行分析，但这些方法要么成本较高，要么需要多个样品制备步骤，或者仅适用于定性分析[2,8,9,20,21,22,23]。鉴于庆大霉素的高极性，先前的研究采用了亲水相互作用色谱（HILIC）技术与LC–MS/MS结合进行检测[24,25]；然而，这些方法成本较高[24,25]。
先前的研究表明，高效薄层色谱（HPTLC）可以有效地应用于药物分析和质量控制领域，通常无需复杂的样品预处理，从而提高了方法的重现性和效率[26,27,28,29]。已经有一些基于HPTLC的方法用于分析药物制剂中的硫酸庆大霉素。然而，这些HPTLC方法耗时且繁琐，因为它们需要与替代分析方法类似的样品预处理步骤，或者涉及HPTLC板的双重制备[1,3,30]。表1总结了之前开发的基于TLC的硫酸庆大霉素分析方法，表明迄今为止尚未开发出具有稳定性指示功能的HPTLC方法，现有方法在检测限（LOD/LOQ）、所需的样品预处理以及多个制备步骤方面存在局限性。鉴于这些局限性，本研究旨在开发一种无需任何样品预处理即可用于分析软膏制剂中硫酸庆大霉素的稳定性指示HPTLC方法。

2. 材料与方法
2.1. 材料与试剂
本研究所有分析均使用分析级试剂和溶剂。硫酸庆大霉素USP购自PCCA（美国德克萨斯州休斯顿）。氨溶液（25%）、氯仿、甲醇和乙醇购自Merck KGaA（德国达姆施塔特），冰醋酸购自Chem Supply Pty Ltd.（澳大利亚吉尔曼）。 ninhydrin分析试剂购自ChemSupply Australia（澳大利亚阿德莱德），商业硫酸庆大霉素0.1%软膏样品购自孟加拉国达卡的药店。实验过程中使用去离子水（RO系统，PSI Water Filters Australia，澳大利亚朗塞斯顿）。
2.2. 方法开发
2.2.1. 流动相选择
尝试了多种流动相，以确定能够在存在降解产物和任何软膏辅料的情况下分离出硫酸庆大霉素所有三个组分的最佳组合。测试了甲苯：乙腈：乙酸乙酯：冰醋酸（6:2:2:0.1，v/v）、氯仿：甲醇：氢氧化铵（25%）：水（1:4:2:1，v/v/v/v）、甲醇：氨溶液（25%）：氯仿（3:2:1，v/v/v）以及甲醇：氯仿：氨溶液（25%）（1:1:1，v/v/v）。由于庆大霉素缺乏发色团并含有氨基，因此按照先前研究的方法使用了ninhydrin试剂和4-氯-7-硝基苯并呋喃唑进行衍生化[23,30]。
2.2.2. 溶剂选择
为了充分溶解药物和软膏基质，测试了不同的溶剂，如去离子水、甲醇、氯仿、氯仿：丙酮（9:1，v/v）、氯仿：甲醇（9:1，v/v）、氯仿：甲醇（8:2，v/v）、氯仿：甲醇（7:3，v/v）和氯仿：甲醇（5:5，v/v），并使用了不同量的硫酸庆大霉素软膏（0.20 g和0.30 g）。经过15分钟的超声处理（Ultrasonicator，Sydney，澳大利亚）以促进溶解后，检查溶液是否出现浑浊或未溶解的颗粒。
2.2.3. 标准溶液、试剂和软膏溶液制备
硫酸庆大霉素在水中高度溶解，因此使用去离子水制备标准溶液。将10 mg的硫酸庆大霉素准确称量到100 mL容量瓶中，定容至100 μg/mL的浓度。对于硫酸庆大霉素软膏样品溶液的制备，将约0.20 g的软膏（药物含量0.1% w/w）准确称量到10 mL容量瓶中，然后加入适量的氯仿：甲醇（9:1，v/v），最终得到20 μg/mL的药物浓度。混合物经过15分钟的超声处理后，储存在-20 °C下待分析。
ninhydrin衍生化试剂的制备方法是：将0.1 g的ninhydrin溶解在50 mL的96%乙醇中，然后加入1.5 mL的冰醋酸。
2.2.4. 仪器与HPTLC方法开发
通过使用半自动HPTLC应用设备（Linomat 5，CAMAG，瑞士穆滕茨），以30 nL/s的速度，在硅胶60 F254 HPTLC板（20 × 10 cm）的下边缘8 mm处和侧边缘11.4 mm处施加逐渐增加的硫酸庆大霉素标准溶液体积（0.5至3 μL），制备校准曲线。色谱分离在自动开发室（ADC2，CAMAG）中进行，该室在相对湿度33%下饱和并活化。流动相由甲醇、氯仿和25%氨溶液按1:1:1（v/v/v）的比例组成。板子在流动相中饱和20分钟后，用流动相预处理5分钟，然后在室温下自动开发至70 mm的距离。开发完成后，板子干燥5分钟。每个板子用4 mL的ninhydrin试剂（Nozzle-Blue，Level 3，CAMAG Derivatiser）处理。衍生化后，板子在115 °C下加热5分钟（CAMAG TLC Plate Heater III），然后冷却至室温，使用HPTLC成像设备（TLC Visualizer 2，CAMAG）在白光下进行分析。使用TLC扫描仪（TLC Scanner 4，CAMAG）捕获所有衍生化峰的图像，并确定其吸光度最大值（λmax）。色谱结果通过仪器的软件（visionCATS，v3.2，CAMAG）进行评估，该软件还管理各种仪器的操作。
2.3. 方法验证
根据国际协调委员会（ICH）指南Q2（R2）[31]，对开发的分析方法进行了验证，并用于定量硫酸庆大霉素。评估了该方法的特异性、线性、灵敏度、重复性和稳健性。
2.3.1. 特异性
通过分析样品基质中的硫酸庆大霉素，并将其RF值与相同浓度水平下的药物标准品的RF值进行比较，评估了方法的特异性。还记录了软膏中三个硫酸庆大霉素峰的完整光谱，并与硫酸庆大霉素标准品中相应峰的光谱进行了比较。此外，还考虑了在应力条件下形成的任何降解产物对特异性的影响（见第2.4节）。
2.3.2. 线性
构建了一个从50到300 ng/峰的六点校准曲线。将三个硫酸庆大霉素峰的峰高总和与相应的标准浓度进行绘制。使用回归方程的相关系数（R2）、斜率（m）、y轴截距（c）和标准偏差（SD）来评估这种关系。
2.3.3. 灵敏度
根据ICH指南中的公式，通过定量限（LOQ）和检测限（LOD）来评估方法的灵敏度：LOD = 3.3 × σ/S；LOQ = 10 × σ/S，其中σ是回归线的标准偏差，S是校准曲线的斜率。
2.3.4. 准确性
方法的准确性反映了观察结果与实际值的接近程度。在本研究中，通过在三种不同药物量（100、150和200 ng/峰）下进行三次重复回收实验来评估准确性，并根据应用的标准溶液的平均回收百分比来评估其准确性。根据ICH指南，如果回收率在95–105%范围内，则认为该方法具有准确性[31]。
2.3.5. 重复性
通过在不同时间使用不同仪器或不同分析师对相同条件的样品进行多次分析，评估方法的准确性。在本研究中，通过分析三种不同药物量（100、150和200 ng/峰）的三次重复实验来评估重复性。所得结果以相对标准偏差百分比表示，如果小于5%，则表明方法具有较高的准确性。
2.3.6. 重复性
通过在短时间内重复五次特定量的标准品（150 ng/峰）来评估重复性。重复之间的差异表示为相对标准偏差（%RSD）。当变异小于5%时，认为该方法具有重复性。
2.3.7. 稳健性
分析方法的稳健性反映了其在参数发生微小变化时仍能保持一致性能的能力。为了评估稳健性，本研究略微改变了流动相的组成，并根据回收率和RF值观察了结果。移动相的组成从原始的甲醇：氯仿：氨水溶液（25%）（1:1:1，v/v/v）修改为1:0.8:1，v/v/v和1:1.2:1，v/v/v的比例。2.4. 强制降解研究使用五种不同的条件（例如，光解、光解和氧化、氧化、酸水解和碱水解）进行了强制降解研究，这些条件基于先前发表的HPTLC稳定性指示测定协议，并进行了轻微调整[28]。作为对照，将5 mL的100 μg/mL硫酸庆大霉素水溶液用去离子水稀释至15 mL。为了制备光解样品，将5 mL的硫酸庆大霉素溶液暴露在紫外光下一小时，然后用去离子水稀释至15 mL。对于光解和氧化处理，将5 mL的30% H2O2加入5 mL的硫酸庆大霉素溶液中，并在暴露于紫外光一小时后将样品用去离子水稀释至15 mL。对于过氧化氢处理，将5 mL的硫酸庆大霉素溶液加入5 mL的30% H2O2中，并在80 °C下加热一小时。之后，用水将体积调整至15 mL。对于酸处理，将硫酸庆大霉素溶液用0.01 M HCl处理一小时，并在80 °C下加热。冷却后，用NaOH（0.1 M）中和溶液，并用去离子水稀释至15 mL。对于碱处理，将硫酸庆大霉素溶液用0.1 M NaOH处理一小时，并在80 °C下加热，然后冷却后用HCl（0.1 M）中和，并用去离子水稀释至15 mL。所有处理过的样品在分析前都避光保存，并使用开发的HPTLC测定方法，同时以硫酸庆大霉素溶液作为对照样品。通过降解样品与标准品之间的全谱分析来评估峰纯度（peak purity），以及是否存在额外但分离良好的峰，以确认所开发方法的选择性。3. 结果与讨论 3.1. 移动相、溶剂和吸收峰的选择发现甲醇：氯仿：氨水溶液（25%）（1:1:1，v/v/v）是一个合适的移动相，在115 °C下用新鲜制备的 ninhydrin 试剂衍生化后，在白光下产生了三个分离良好的粉红色条带，其相对保留时间（RF1）分别为0.096 ± 0.03、0.12 ± 0.02和0.145 ± 0.03。这种移动相之前曾用于分析庆大霉素原料药、庆大霉素乳膏和血浆中的庆大霉素，其中使用4-氯-7-硝基苯并呋喃唑作为衍生化试剂，并且使用甲醇进行了板的第二次开发[30]。选择ninhydrin试剂作为本研究中分析硫酸庆大霉素的衍生化剂，因为它不需要第二次开发步骤，而使用4-氯-7-硝基苯并呋喃唑时需要这个步骤。本研究的定量分析在500 nm处进行，该波长是三个庆大霉素条带的吸收峰最大值。由于硫酸庆大霉素包含几种密切相关的成分（C1、C1a和C2），因此开发的HPTLC方法量化了总硫酸庆大霉素含量，而不是分别分离和测量每个成分[30]。在定量分析中，最初绘制了所有三个峰的高度之和与其相应浓度的关系图。发现峰高度之和产生了更可靠和准确的结果。因此，在最终开发和验证的方法中，硫酸庆大霉素的定量是基于所有三个峰的高度之和。对于溶解硫酸庆大霉素软膏，发现氯仿：甲醇（9:1，v/v）是最合适的溶剂。3.2. HPTLC方法验证 3.2.1. 特异性通过研究硫酸庆大霉素标准溶液和硫酸庆大霉素软膏溶液的HPTLC色谱图和峰谱来评估特异性。在RF1 = 0.096 ± 0.03、RF2 = 0.12 ± 0.02、RF3 = 0.145 ± 0.03处，没有检测到任何辅料产生的条带或峰，这证实了该方法在样品基质存在下的特异性（图2和图S1a）。图2. 用ninhydrin试剂在500 nm下衍生化后的硫酸庆大霉素HPTLC色谱图。轨道1：硫酸庆大霉素标准品；轨道2：0.1%硫酸庆大霉素软膏。红色框—硫酸庆大霉素峰。此外，基于各种降解研究的发现，也证实了该方法在应力条件下的特异性。开发稳定性指示测定方法对于支持制剂的质量控制和确定适当的保质期非常重要。为了研究所开发的测定方法是否能够在潜在降解产物存在的情况下准确量化药物，本研究采用了Sidkar等人之前报告的略微修改的协议[28]。使用五种不同的条件研究了硫酸庆大霉素的强制降解，即光解、光解和氧化、氧化、酸水解（0.01 M HCl）和碱水解（0.1 M NaOH）。与对照相比，在光解、光解和氧化以及氧化后，在500 nm处没有检测到额外的条带。记录了这些降解实验后所有三个硫酸庆大霉素条带的光谱，发现与对照相比没有变化，从而确认了峰纯度。因此，可以认为硫酸庆大霉素在这些条件下是稳定的。然而，在碱水解后，没有剩余的硫酸庆大霉素条带或峰，这证实了药物的完全降解，这与之前的研究结果一致[20]。由于硫酸庆大霉素含有几种在碱性条件下易分解的糖苷键，因此预期会发生完全降解[32]。相比之下，氧化降解仅是部分的，可能是由于一级和二级胺基及羟基功能团的选择性氧化，而没有广泛的糖苷键断裂[33]。用0.01 M HCl处理后，总峰高度与对照相比没有变化，但在基线附近观察到一个小的降解峰。这些强制降解实验后的硫酸庆大霉素HPTLC色谱图显示在图3和图S1b中，并在表2中进行了总结。基于这些发现，可以得出结论，即使在应力条件下，所开发的测定方法也是特异性的。图3. 500 nm下的HPTLC色谱图。轨道1：对照；轨道2：光解；轨道3：光解和氧化；轨道4：氧化；轨道5：酸水解（0.01 M HCl）；轨道6：碱水解（0.1 M NaOH）。红色框—硫酸庆大霉素峰。表2. 强制降解研究。3.2.2. 线性通过绘制三次重复实验中三个硫酸庆大霉素条带的色谱峰高度与相应标准浓度（ng/条带）的关系图，评估了硫酸庆大霉素测定的工作范围。使用Microsoft Excel? for Microsoft 365 MSO（版本2508）中的最小二乘回归分析确定了线性范围，数据来自HPTLC visionCATS软件（版本4.0）（图S2）。回归分析结果显示，所有三次重复实验的决定系数（R2）均大于0.99，符合ICH指南定义的可接受线性[31]。表3. 硫酸庆大霉素标准的线性数据。3.2.3. 灵敏度通过使用回归线的标准偏差和校准曲线的斜率，评估了方法的灵敏度（LOD和LOQ）。LOD和LOQ分别为7.10 ng和21.53 ng（表3）。与之前的研究相比，所开发的HPTLC方法表现出相当的灵敏度；然而，它不需要样品预处理或双重开发步骤，从而提供了方法学优势[30]。3.2.4. 准确性通过平均药物回收率来评估所开发的HPTLC方法的准确性。进行了三次重复分析，分别在三个水平（100、150和200 ng/条带）下进行，平均回收率在98.06%到101.64%之间，均在ICH指南规定的可接受范围内，从而确认了方法的准确性（表4）[31]。表4. 准确性。3.2.5. 精密度在本研究中，根据同一天（日内）或连续三天（日间）分析三种不同药物量（100、150和200 ng/条带）的重复分析结果来评估精密度。日内精密度的情况下，% RSD值范围为0.41%到1.71%（表5）。日间精密度? % RSD值在0.80%到2.87%之间（表6）。两组结果的% RSD均低于ICH指南规定的最大允许变化范围（5%）[31]。因此，所开发的方法表现出高度的精密度。表5. 日内精密度。表6. 日间精密度。3.2.6. 系统精密度（重复性）通过重复分析相同体积的标准溶液来评估方法的重复性。本研究进行了五次重复实验。结果发现，平均回收率为101.56%，% RSD为2.96%（表7），这证实了所开发的HPTLC测定方法具有高度的重复性，符合ICH指南的定义[31]。表7. 重复性（系统精密度）。3.2.7. 坚牢性通过故意改变移动相的比例来评估所开发HPTLC方法的稳健性。RF值没有显著变化，当理论量为100、150和200 ng/条带时，%回收率在97.93%到104.40%之间，这证实了方法的稳健性（表8）。表8. 坚牢性研究。3.3. 将开发的HPTLC方法应用于定量软膏中的硫酸庆大霉素使用所开发的HPTLC方法分析了商业硫酸庆大霉素0.1%（w/w）软膏，该软膏含有光矿物油和白色凡士林作为基础成分，以及甲基对羟基苯甲酸酯和丙基对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。硫酸庆大霉素的产量（n = 3）以理论值的百分比报告（表9）。结果显示，所研究软膏中的药物含量处于可接受水平，这证实了所开发的HPTLC方法适用于药品制剂的质量控制。鉴于该方法在分析前不需要任何样品处理，因为脂溶性软膏辅料的分离是在单次色谱开发过程中原位发生的，因此该方法比其他已发表的分析方案更为方便[30]。表9. 商业软膏中的硫酸庆大霉素含量。4. 结论本研究描述了一种完全验证的、用于硫酸庆大霉素的稳定性指示HPTLC测定方法，适用于无需提取等预处理即可分析软膏中的药物。此外，该方法表现出优异的灵敏度水平（LOD：7.10 ng和LOQ：21.53 ng），与其他研究相当[1,3,30]，并且在软膏辅料存在的情况下具有高水平的线性、准确性和特异性。此外，强制降解研究证实了该方法适用于硫酸庆大霉素制剂的稳定性测试。由于HPTLC具有操作简单和能够快速同时分析等优点，所开发和验证的方法为硫酸庆大霉素软膏的质量控制提供了一种有前景的稳定性指示测定方法。补充材料以下支持信息可在https://www.mdpi.com/article/10.3390/app16052613/s1下载：图S1：(a) 硫酸庆大霉素的HPTLC指纹图谱：轨道1. 标准硫酸庆大霉素；轨道2. 0.1%硫酸庆大霉素软膏；(b) 硫酸庆大霉素的降解研究：轨道1. 对照；轨道2. 光解；轨道3. 光解和氧化；轨道4. 氧化；轨道5：酸水解（0.01 M HCl）；轨道6. 碱水解（0.1 M NaOH）。所有图像均在白光下记录。图S2：来自HPTLC visionCATS软件的示例回归图。