以富含脂质且具有抗上皮间质转化（EMT）活性的大戟属植物Euphorbia helioscopia种子为研究对象：基于UPLC-ESI-MS/MS技术的代谢组学分析方法

《Industrial Crops and Products》：Valorization of Euphorbia helioscopia seeds as a lipid-rich resource with anti-EMT activity: A UPLC-ESI-MS/MS-based metabolomics approach

　　吕莉莉|李中华|华为新|沈娜|谭妍|崔玉蕾
中国山东省临沂市临沂大学医学院，276000

**摘要**
大戟属植物Euphorbia helioscopia L.是一种传统药用植物，其种子（EHS）常作为农业废弃物被丢弃。本研究旨在探讨EHS与传统全草（EHQ）在代谢谱及抗上皮-间充质转化（EMT）潜力方面的差异。通过基于UPLC-ESI-MS/MS的广谱代谢组学分析，共鉴定出2178种代谢物，其中1423种在EHQ和EHS之间存在差异积累。EHQ富含黄酮类化合物，而EHS则相对富含脂质，尤其是辛酸、硬脂酸和十八烯酸等脂肪酸。通路分析显示两者在脂质和黄酮类生物合成途径上存在差异。体外实验表明，EHS提取物具有更强的细胞毒性（IC50 = 0.80 mg/mL），并能显著抑制A549肺癌细胞的迁移和EMT进程，表现为E-钙粘蛋白上调、N-钙粘蛋白和α-SMA下调。这些发现表明EHS是一种有潜力的抗EMT药物开发资源，有助于实现可持续生物产品生产中未充分利用植物部分的价值。

**1. 引言**
Euphorbia helioscopia L.（俗称太阳大戟或狼奶）是一种属于大戟科的一年生草本植物。其药用部位包括根、乳汁、茎、叶、新鲜地上部分及干燥的全株。该植物在中国大部分地区均有分布（Ma和Wu，1997）。作为一种在中医中使用了上千年的药材，Euphorbia helioscopia L.最早记载于《神农本草经》（汉代），随后被收录于《神农本草经别录》（梁代，480–498年）、《图解本草》（宋代，1020–1101年）和《本草纲目》（明代，1590年）等经典本草著作中（Liu等，2014；Liu等，2012；Sun等，2010；Shi和Liu，2014）。它常用于治疗咳嗽、痰症、哮喘、肺癌、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统疾病，以及银屑病、腮腺炎和结核性肛瘘等皮肤和感染性疾病（Pang和Lian，2007；Yao等，2013；Chen等，2015；Chen等，2014；Huang，1983；Su等，2019）。民族植物学研究表明，Euphorbia helioscopia L.在中国以外的北非、亚洲和欧洲也有传统药用记录，并已引入北美。例如，在巴基斯坦，它被用作泻药和驱虫剂（Qureshi等，2007）；在土耳其，大戟属植物常用于治疗风湿病、肿胀和去除疣（Barla，2006）；在韩国，Euphorbia helioscopia L.被用作抗过敏或抗炎剂（Park等，2001）。

除了药用价值外，Euphorbia helioscopia L.在农业和工业领域也有广泛应用。近年来，从该植物中开发出了多种农业和工业产品，如除草剂、保健茶和树脂。其杀虫活性备受关注，多项研究显示其提取物对芜菁蚜虫（Lipaphis erysimi）、小菜粉蝶（Pieris rapae）、小麦蚜虫（Sitobion avenae）、银叶白粉虱（Bemisia tabaci）和蔬菜叶矿虫（Liriomyza sativae）等害虫具有毒性（Xing等，2013；Gao等，1999；Wang等，2014；Wang等，2012；Guo等，2011）。Chen Hui等的研究还发现，不同植物部位的提取物杀虫效果存在差异：根提取物对小菜粉蝶（Pieris rapae）、桃蚜（Myzus persicae）和山楂红蜘蛛（Tetranychus viennensis）具有强毒性（Xiao等，2016）；茎和叶同时具有杀虫和杀菌作用（Zhu等，2011）；乳汁对桃蚜具有显著的接触毒性和拒食作用（Torres和Ruberson，2004）；种子中的丙酮提取物具有杀螺作用（Ahmad等，2003）。此外，Euphorbia helioscopia还被用于制造各种工业产品和绿色材料，如保健茶成分（Zhang和Jiang，1996）、高光泽涂料膜的增强剂（Fathi，2020），以及用于制造再生轮胎的树脂（Fathi，2020）。它还显示出作为低温燃烧过程有机燃料替代品的潜力，显示出其在可持续工业应用中的前景。

上皮-间充质转化（EMT）是一个复杂的多阶段生物过程，涉及众多基因和连续步骤，表现为上皮细胞向间充质细胞的转变，伴随形态和功能的改变以及迁移和侵袭性的获得。作为驱动上皮源性恶性肿瘤发展和进展的关键机制之一，EMT与肺癌的侵袭性和转移性密切相关，因此被广泛认为是肺癌的重要预后指标（Yao和Lai，2009；Lamouille等，2014；Huber等，2005；Ali等，2015）。研究表明，Euphorbia helioscopia L.可通过抑制STAT3激活、保持T细胞干性及减轻慢性炎症引起的T细胞耗竭来抑制LPS/NNK诱导的小鼠肺肿瘤发生（Zhou等，2023；Chen等，2020）。然而，目前尚无关于Euphorbia helioscopia对肺癌细胞EMT过程抑制作用的研究报道，特别是其不同药用部位（如全草和种子）在抑制肺癌细胞增殖和EMT过程方面的活性差异。

目前，Euphorbia helioscopia L.的主要药用部位是全草（EHQ），包括茎和叶。由于其成熟蒴果易开裂、种子散布迅速、植株分枝多且种子成熟不同步，导致种子（EHS）的采集效率低下，造成资源浪费（Tang和Wang，2021）。随着科学研究和工业应用对Euphorbia helioscopia需求的增加，全面利用其不同部位的重要性日益凸显。证据表明，不同植物器官间的代谢物组成和含量存在显著差异（Ma等，2021）。例如，Jin等（2021）使用气相色谱-质谱法在Camellia luteoflora的花和叶中分别鉴定出74种和72种挥发性成分，其中花中的主要成分是芳樟醇（16.71%），叶中的主要成分是反-2-己烯醛（20.63%）。Liu等（2018）使用高效液相色谱分析了贵州五种野生山茶属植物的种子中的氨基酸和主要脂肪酸，发现种子中含有高水平的必需氨基酸。Hao等（2021）报告称，Lactuca indica L.的茎中含有比叶更高的槲皮素和芹菜素含量，而花中富含芦丁和木犀草素。这些发现表明，不同植物部位和发育阶段的代谢物分布差异显著，暗示其潜在的药用价值也可能有所不同。

超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）在代谢组学研究中得到广泛应用，结合了高通量非靶向筛选和高精度靶向分析，是生物样本中代谢物定性和定量分析的强大工具（Addi等，2021；Xiao等，2022）。通过使用专门的化合物数据库和分析软件（Liu等，2019；Cao等，2021），UPLC-MS/MS能够快速、准确地鉴定数千种代谢物，有助于研究植物各部位的代谢谱和生物活性成分的积累机制（Hou等，2023；Yan等，2019）。目前关于EHQ和EHS活性代谢物差异的系统报道仍较少。除我们研究组的先前研究（Liu等，2023）外，关于EHS化学成分和生物活性的研究仍然非常有限。我们的初步代谢组学分析结合网络药理学和分子对接研究表明，EHS提取物可能具有抗肺纤维化的潜力，但该研究未系统比较EHQ和EHS中的次级代谢物，也未验证其抗EMT活性。因此，现有证据不足以充分证明EHS作为新型抗EMT药用资源的开发价值。

在本研究中，我们采用广谱代谢组学方法分析了EHQ和EHS的化学成分差异，并通过体外实验比较了这两种提取物对A549肺癌细胞增殖和侵袭的抑制作用，为评估EHS作为新型抗EMT药用资源的潜力提供了研究基础。

**2. 材料与方法**
2.1. 材料与仪器
2023年5月中旬，我们从中国山东省临沂大学校园采集了Euphorbia helioscopia样本，经崔玉蕾副教授鉴定属于大戟科Euphorbia helioscopia物种。手动去除全株种子后，样本分为两部分：EHQ和EHS。两部分样本先进行晒干，然后使用冷冻干燥机（Scientz-100F）真空冷冻干燥。干燥后的材料用研磨机（MM 400，Retsch）以30 Hz的速度研磨成细粉，持续1.5分钟。所有样本保存在临沂大学医学院（中国临沂）。甲醇和乙腈（HPLC级）购自Merck，乙醇（HPLC级）购自Aladdin。

2.2. 样品制备与提取
使用电子天平（MS105DΜ）准确称取50 mg粉末样品，用1200 μL预冷至-20°C的70%甲醇水溶液提取（若样品质量低于50 mg，则调整提取溶剂体积）。混合物每30分钟涡旋30秒，重复六次。离心12,000 rpm 3分钟后，上清液通过0.22 μm膜过滤，滤液转移至注射瓶中用于UPLC-MS/MS分析。

2.3. UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS条件
a) 液相色谱条件
使用Agilent SB-C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）进行分离。流动相由A）含0.1%甲酸的超纯水和B）含0.1%甲酸的乙腈组成。梯度程序如下：0分钟时5% B，逐渐增加到9分钟时95% B并保持1分钟，然后回到11.10分钟时5% B，直至14.00分钟重新平衡。柱温保持在40°C，进样体积为2 μL。
b) 质谱条件
电喷雾离子化（ESI）源的参数如下：源温度550°C；离子喷射电压5500 V（正模式）和-4500 V（负模式）；气体压力（GSI，GSII，CUR）分别为50、60和25 psi；碰撞诱导离子化设置为高。数据采集采用多反应监测（MRM）模式，使用三重四极杆质谱仪，氮气作为碰撞气体。针对每个MRM跃迁分别优化去聚势（DP）和碰撞能量（CE）。特定MRM离子对对应于相应代谢物的洗脱时间进行监测。

2.4. 代谢物的定性和定量分析
基于内部二级质谱数据库通过匹配MS/MS光谱进行代谢物鉴定。数据处理过程中去除了来自同位素、加合物离子（如K?、Na?、NH??）和高分子量化合物衍生物的信号。使用三重四极杆质谱仪进行多反应监测（MRM）进行代谢物定量。在MRM模式下，第一个四极杆选择性地过滤目标代谢物的前体离子，从而排除具有不同质荷比的离子，这些离子可能是潜在的干扰因素。选定的前体离子随后在碰撞池中被裂解，之后第三个四极杆过滤出特定的特征产物离子以供检测。这种两阶段的选择过程有效地减少了非目标干扰，确保了定量结果的准确性和可重复性。完成所有样本的质谱数据采集后，对应于每个代谢物的色谱峰被积分以获得峰面积。然后对不同样本中相同代谢物的峰积分进行交叉校正。

2.5. 数据分析
从EHQ和EHS获得的原始数据使用Agilent MSD工作站软件进行处理，并转换为CDF格式。这些文件随后被导入R软件（版本2.7.2）中，并使用XCMS包进行数据预处理，包括保留时间校正、噪声过滤和峰匹配。这一过程生成了一个包含每个代谢物的保留时间和峰面积的数据文件。数据使用内标进行标准化，然后导入SIMCA-P软件（版本11.5）进行多变量统计分析。应用主成分分析（PCA）和正交投影到潜在结构-判别分析（OPLS-DA）模型进行模式识别，并筛选差异积累的代谢物（筛选标准：投影中的变量重要性VIP > 1且p值 < 0.05）。通过NIST 11数据库进一步注释了鉴定出的差异代谢物，最终得到了区分EHQ和EHS的特征代谢物。

2.6. CCK-8测定
将A549细胞制备成每毫升40,000个细胞的悬浮液，并以每孔100 μL的密度接种到96孔板中（相当于每孔4000个细胞）。培养12小时后，用不同浓度的EHQ和EHS提取物处理细胞。测试的提取物浓度梯度为：300 μg/mL、600 μg/mL、900 μg/mL、1.2 mg/mL、1.5 mg/mL和1.8 mg/mL。还建立了对照组孔（含有细胞、培养基和不含药物的CCK-8溶液）和空白孔（仅含有培养基和CCK-8溶液，不含细胞或药物）。每个浓度重复三次实验。处理24小时后，向每个孔中加入10 μL的CCK-8试剂，并在37°C和5% CO?条件下再培养30分钟。使用微孔板读数仪在450 nm处测量吸光度。根据获得的吸光度值计算细胞增殖率和细胞毒性。细胞增殖率通过以下公式计算：细胞活力 = [(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%。

2.7. 伤口愈合测定（用于迁移抑制）
胰蛋白酶处理后，计数对数生长阶段的A549细胞，然后以每孔3 × 10?个细胞的密度接种到24孔板中，进行后续实验。轻轻旋转板子以确保均匀分布后，在37°C和5% CO?条件下培养24小时。第二天，使用无菌200 μL移液器尖端在细胞单层上制造均匀的划痕。用无菌PBS轻轻冲洗掉脱落的细胞（2-3次）以形成清晰的伤口间隙。立即拍摄划痕的图像（0小时）。然后细胞分别用以下物质处理：阴性对照（0 μg/mL）、阳性对照（20 ng/mL TGF-β），实验组用20 ng/mL TGF-β处理，并用50 μg/mL、100 μg/mL和150 μg/mL的EHQ和EHS提取物处理。将板子放回培养箱继续培养24小时，之后取出细胞，并在显微镜下拍摄伤口区域的图像。使用Image J软件分析迁移区域以评估细胞迁移能力。

2.8. 蛋白质表达的Western blotting分析
进行Western blotting分析，以检测EHQ和EHS提取物对EMT相关蛋白（E-Cadherin、N-cadherin和α-SMA）表达水平的影响。具体步骤如下：每个孔加载10 μL的蛋白质样本。首先使用带有1.0 mm间隔条和10孔梳的凝胶进行电泳，起始电压为80 V，当样本进入分离凝胶时增加到120 V，总电泳时间约为90分钟。电泳完成后，准备与凝胶尺寸相匹配的滤纸和PVDF膜。使用前，将PVDF膜浸泡在100%甲醇中活化。按照以下顺序组装转移三明治：滤纸、活化的PVDF膜、凝胶和另一张滤纸，确保凝胶朝向阴极（黑色电极）。小心去除气泡。在250 mA的恒定电流下进行湿转移90分钟。转移后，将膜在室温下用5%脱脂牛奶的TBST中封闭1小时，然后用TBST洗涤四次（每次5分钟）。随后，在4°C下用初级抗体在摇床上孵育过夜。第二天，经过三次10分钟的TBST洗涤后，将膜在室温下用HRP结合的二级抗体（1:10,000稀释在5%脱脂牛奶/TBST中）孵育2小时。最后，用TBST洗涤四次（每次5分钟）。使用ECL化学发光试剂盒（混合Reagent A和Reagent B，比例为1:1）可视化蛋白质条带，并进行成像。使用Image J软件分析结果条带；通过计算平均光密度与特定条带面积的乘积来反映相对蛋白质表达水平。

2.9. 统计分析
使用多变量统计方法处理获得的代谢数据，包括主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）和聚类分析。为了评估整体和组间变异，首先对所有样本（包括QC）进行主成分分析（PCA），将数据总结为新的正交变量（主成分）。随后应用正交投影到潜在结构-判别分析（OPLS-DA）进行成对组间比较。根据OPLS-DA模型得出的VIP值以及ANOVA的P值，使用VIP > 1、P < 0.05和FC（倍数变化）> 2或< 0.5的标准筛选差异代谢物。使用MBROLE 2.0（http://csbg.cnb.csic.es/mbrole2/index.php）对这些差异代谢物进行注释和功能富集分析。利用KEGG（京都基因与基因组百科全书）数据库（http://www.genome.jp/kegg/）计算富集显著性[-lg(P值)），并使用OmicStudio工具（https://www.omicstudio.cn/tool）生成富集散点图。使用MetaboAnalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）创建热图，以显示不同样本组间的积累模式。使用Origin 2021（OriginLab Corporation，美国马萨诸塞州北安普顿）生成直方图。为了更准确地表示组内和组间代表性生物活性成分的变化，数据通过log2变换和均值缩放进行标准化；生成的热图显示了它们的平均值。

3. 结果
3.1. EHQ和EHS的广谱代谢组学分析
3.1.1. 样品质量控制分析
为了研究E. helioscopia中代谢物的多样性，采用了广谱代谢组学方法系统地分析EHQ和EHS，旨在阐明不同植物部位之间的次级代谢物谱型的差异。在仪器分析过程中，可以通过叠加不同质量控制（QC）样本的总离子色谱图（TICs）来评估代谢物提取和检测的重复性（图1 A,B）。通过混合E. helioscopia样本提取物制备的QC样本的TICs的叠加分析（图1 A,B）来评估代谢物提取和检测的重复性。结果显示，每个QC样本的TICs中的色谱峰的保留时间和峰强度高度一致，具有很好的重叠度。这些发现共同证明了样品预处理和检测方法的稳健性，以及分析系统的优异重复性和稳定性，从而验证了数据的可靠性。此外，还使用变异系数（CV）评估了数据的稳定性。较低的CV值表示代谢物检测的重复性更好。结果表明，绝大多数代谢物的CV值较低，超过75%的代谢物的CV< 0.3（图1 C）。这表明实验数据的整体变异很小，稳定性很高，为后续的差异代谢物分析提供了坚实的基础。

3.1.2. E. helioscopia不同部位的代谢物组成和分类
通过对EHQ和EHS进行广谱代谢组学分析，共鉴定出2178种代谢物，这些代谢物被分为13个主要类别。主要包括：347种黄酮类、277种氨基酸及其衍生物、277种酚酸、205种脂类、200种萜类、182种生物碱、131种木脂素和香豆素、100种有机酸、66种核苷酸及其衍生物、64种单宁、38种醌类、3种甾醇和288种其他代谢物（图1D）。结果表明，黄酮类、氨基酸及其衍生物和酚酸在种类和数量上都是最丰富的化合物类别，共同揭示了E. helioscopia代谢物的高度化学多样性。

3.1.3. E. helioscopia样本的主成分分析
主成分分析（PCA）是一种常见的降维方法，用于识别多变量数据中的主要变异模式，并通过一组紧凑的主成分来表示它们。对所有样本应用PCA可以初步评估组间的整体代谢差异以及组内的变异程度。EHQ和EHS样本的二维PCA结果（图2 A）显示，PC1和PC2的贡献率分别为70.6%和7.9%。EHS组内的QC样本和重复样本紧密聚集，表明代谢物谱型高度一致，组内变异较小。相比之下，EHQ样本的较大分散表明该组内的代谢异质性较高。在PCA得分图中，两种植物部位的样本形成了不同的簇，显示出它们代谢物谱型的显著差异，突出了植物器官对代谢组成的显著影响。三维PCA得分图（图2B）更直观地可视化了样本的聚类和分离。前三主成分（PC1、PC2和PC3）分别占总变异的78.9%、7.4%和6.0%。该图中EHQ和EHS组之间的明显分离进一步证实了它们不同的代谢组成。总之，PCA结果表明E. helioscopia的不同部位显著影响了其代谢谱型的组成。

3.2. EHQ和EHS的差异代谢物分析
尽管PCA可以揭示组间差异，但它无法有效排除组内错误和随机变异的干扰。为了进一步区分EHQ和EHS之间的代谢物差异，采用了正交投影到潜在结构-判别分析（OPLS-DA）。该方法正交化了与类别分离无关的不需要的变异，从而有效地识别出能够稳健区分组的差异代谢物，提高了分类和解释的准确性。在OPLS-DA得分图（图2 C）中，EHQ和EHS样本沿第一个主成分轴清晰分离，两者之间的距离较大，表明代谢组成存在显著差异。与PCA相比，OPLS-DA得分图中的样本在组内聚类更紧密。这证明了该模型在压缩组内变异的同时强调了组间差异的有效性，进一步验证了两种植物部分的独特代谢谱型。模型验证参数显示R2X、R2Y和Q2值分别为0.816、0.999和0.996。所有三个值都大于0.5，且Q2> 0.9（图2D），表明构建的OPLS-DA模型具有较高的解释能力和预测可靠性，适合后续的差异代谢物筛选和鉴定。

3.1.5. EHQ和EHS之间的差异代谢物分析
聚类热图（图3 A）显示EHQ和EHS之间的代谢物积累模式明显不同，尽管它们来自同一植物，但代谢谱型存在显著差异。基于OPLS-DA模型得出的变量重要性（VIP）值，初步筛选出了差异代谢物。通过设置VIP ≥ 1，并结合倍数变化（FC ≥ 2或FC ≤ 0.5）和统计显著性，最终确定了E. helioscopia不同部分之间的标记差异代谢物。共筛选出1423个差异代谢物，其中与EHQ相比，EHS中有313个代谢物上调（图3B），1110个下调。此外，从EHS和EHQ的比较中选出了上调和下调最显著的10个代谢物（图3C）。上调的前10个代谢物包括8种黄酮类、1种生物碱和1种萜类化合物，按相对含量减少的顺序排列（表1）：7''-O-甲基amentoflavone（黄酮类）、5′-甲基bilobetin（黄酮类）、benzamide（生物碱）、isoginkgetin（黄酮类）、salcolin A（黄酮类）、7-O-甲基amentoflavone（黄酮类）、tricin-4′-O-(guaiacylglycerol)醚（黄酮类）、(1?s,2e,6e,10z,14?s)-14-hydroxy-3-isopropyl-6,14-dimethyl-15-oxabicyclo [8.4.2]hexadeca-2,6,10-trien-16-one（萜类）、3-O-acetylpinobanksin（黄酮类）和tricin-5-O-guaiacylglycerol（黄酮类）（图4A）。在EHS与EHQ的比较中，上调的前10个代谢物包括3种酚酸、5种有机酸和1种萜类化合物，按相对含量增加的顺序排列（表1）：melilotic acid（酚酸）、4-hydroxyhex-2-enoic acid（有机酸）、3-methyl-2-oxopentanoic acid（有机酸）、suberic acid（脂质）、ornatipolide（酚酸）、β-hydroxyisovaleric acid（有机酸）、bilobalide（萜类）、met-Ile（氨基酸及其衍生物）、2-hydroxyisobutyric acid（有机酸）和2-hydroxybutyric acid（有机酸）（图4B）。

差异代谢物首先根据OPLS-DA模型得出的变量重要性（VIP）值进行初步筛选。通过设置VIP ≥ 1，并结合倍数变化（FC ≥ 2或FC ≤ 0.5）和统计显著性，最终确定了E. helioscopia不同部分之间的标记差异代谢物。共筛选出1423个差异代谢物，其中与EHQ相比，EHS中有313个代谢物上调（图3B），1110个下调。此外，从EHS和EHQ的比较中选出了上调和下调最显著的10个代谢物（图3C）。上调的前10个代谢物包括8种黄酮类、1种生物碱和1种萜类化合物，按相对含量减少的顺序排列（表1）：7''-O-甲基amentoflavone（黄酮类）、5′-甲基bilobetin（黄酮类）、benzamide（生物碱）、isoginkgetin（黄酮类）、salcolin A（黄酮类）、7-O-甲基amentoflavone（黄酮类）、tricin-4′-O-(guaiacylglycerol)醚（黄酮类）、(1?s,2e,6e,10z,14?s)-14-hydroxy-3-isopropyl-6,14-dimethyl-15-oxabicyclo[8.4.2]hexadeca-2,6,10-trien-16-one（萜类）、3-O-acetylpinobanksin（黄酮类）和tricin-5-O-guaiacylglycerol（黄酮类）（图4A）。在EHS与EHQ的比较中，上调的前10个代谢物包括3种酚酸、5种有机酸和1种萜类化合物，按相对含量增加的顺序排列（表1）：melilotic acid（酚酸）、4-hydroxyhex-2-enoic acid（有机酸）、3-methyl-2-oxopentanoic acid（有机酸）、suberic acid（脂质）、ornatipolide（酚酸）、β-hydroxyisovaleric acid（有机酸）、bilobalide（萜类）、met-Ile（氨基酸及其衍生物）、2-hydroxyisobutyric acid（有机酸）和2-hydroxybutyric acid（有机酸）（图4B）。

差异代谢物的初步筛选基于OPLS-DA模型得出的变量重要性（VIP）值。通过设置VIP ≥ 1，并结合倍数变化（FC ≥ 2或FC ≤ 0.5）和统计显著性，最终确定了E. helioscopia不同部分之间的标记差异代谢物。共筛选出1423个差异代谢物，其中与EHQ相比，EHS中有313个代谢物上调（图3B），1110个下调。从EHS和EHQ的比较中选出了上调和下调最显著的10个代谢物（图3C）。通过迭代浓缩、还原、脱水和七轮链延长反应，合成了棕榈酸（Gope, Mauro, 2025）。进一步的修饰包括去饱和和延长反应，可以生成不饱和脂肪酸，如辛酸和十八酸（Rhee et al., 1997），这些脂肪酸在EHS中的积累量相对较高，这与我们在代谢组学数据中观察到的以脂质为中心的代谢表型一致（图8B）。3.2. EHQ和EHS提取物对A549肺癌细胞的细胞毒性效应比较使用倒置显微镜观察了EHQ和EHS提取物处理后A549细胞的形态变化。如图9A所示，正常对照组细胞形态规则，呈椭圆形或卵圆形，边界清晰，排列紧密，大小均匀，细胞体完整。在EHQ处理组中，随着提取物浓度的增加，细胞数量显著减少，分布变得稀疏，细胞形态变为细长的纺锤形，排列无序，颗粒度增加。在EHS处理组中，随着浓度的增加，细胞逐渐变圆，边界模糊，出现空泡化，并观察到核碎片化。CCK-8检测结果（图9B）显示，随着EHQ和EHS提取物浓度的增加，A549细胞的存活率显著下降（P < 0.01）。24小时处理后，EHQ和EHS提取物的IC50值分别为1.881 mg/mL和0.8031 mg/mL。测试的浓度梯度为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5和1.8 mg/mL。显微镜观察和CCK-8结果的综合分析表明，EHS提取物对A549细胞的细胞毒性比EHQ提取物更强。下载：下载高分辨率图像（489KB）下载：下载全尺寸图像图9. (A) EHQ和EHS抑制A549细胞的增殖。A549细胞的形态变化。(B) 细胞毒性效应。3.3. EHQ和EHS提取物对A549细胞迁移的影响使用伤口愈合实验来评估提取物对A549细胞迁移的影响。如图10所示，与对照组相比，EHQ或EHS提取物处理24小时后，细胞迁移能力受到抑制，表现为伤口闭合率显著降低。这种抑制效应具有浓度依赖性，并且具有统计学意义。这些发现表明，EHQ和EHS提取物都能有效抑制A549细胞的迁移。下载：下载高分辨率图像（614KB）下载：下载全尺寸图像图10. (A) EHQ和EHS抑制A549细胞的侵袭和迁移。不同浓度EHQ和EHS处理的A549细胞的伤口愈合实验。(B) 细胞存活率（**p < 0.01, ****p < 0.0001 vs. 对照组）。3.4. EHQ和EHS提取物对A549细胞上皮-间充质转化标记蛋白表达的影响如图11所示，与对照组相比，EHQ或EHS提取物处理显著下调了A549细胞中间充质标记物N-Cadherin和α-SMA的表达水平，而上皮标记物E-Cadherin的表达则呈现显著上升趋势。值得注意的是，在EHS提取物浓度为150 μg/mL时，对这些EMT相关蛋白的抑制作用最为明显，所有变化都具有统计学意义。这些结果表明，EHS提取物可以在体外抑制A549细胞的EMT过程，并且这种效应具有浓度依赖性。下载：下载高分辨率图像（278KB）下载：下载全尺寸图像图11. (A) TGF-β诱导的A549细胞中EMT标记物（E-Cadherin, N-Cadherin, α-SMA）的表达水平，经过EHQ和EHS处理。(B-D) EHQ和EHS对TGF-β诱导的A549细胞中EMT标记物（E-Cadherin, N-Cadherin, α-SMA）表达的影响（*p < 0.05, **p < 0.01 vs. 对照组）。4. 讨论本研究首次系统地比较了大戟属植物（Euphorbia helioscopia L.）的全草（EHQ）和种子（EHS），结合了广泛靶向的代谢组学和体外药效学验证。我们的核心发现揭示了它们在化学组成和对肺癌细胞上皮-间充质转化（EMT）的生物活性方面的根本差异。重要的是，传统上被忽视的种子（EHS）在抑制A549细胞增殖、迁移和逆转EMT标记物表达方面表现出比传统全草（EHQ）更强的效果，这使EHS成为抗EMT药物开发的有希望的新资源。我们的代谢组学分析明确指出，植物部位是决定E. helioscopia代谢物谱型的关键因素。虽然EHQ富含黄酮类化合物（15.93%），但全草中的黄酮类化合物积累量高于种子，这与其传统上用于抗氧化和抗炎的作用一致（Chen et al., 2014）。EHS则表现出以脂质、有机酸和特定萜类化合物为主的独特代谢谱型。其中，候选脂质在E. helioscopia中占9.41%，其在种子中的积累量高于全草。这可能是由于不同植物和器官之间化合物表达、代谢合成途径和关键酶的差异所致。KEGG通路富集进一步将这些差异归因于以脂质为中心的通路，如“脂肪酸生物合成”和“α-亚麻酸代谢”。这种化学基础的根本差异为解释EHQ和EHS之间的生物活性差异提供了依据。上皮-间充质转化（EMT）是一个动态的、受调控的过程，对胚胎发生和肿瘤进展至关重要。这一过程及其逆过程（MET）对正常发育至关重要，并且与肿瘤侵袭和转移密切相关。部分EMT是肿瘤的常见特征，它增强了细胞的可塑性并促进了侵袭能力（Kar et al., 2019）。EHS的卓越抗EMT活性可能归因于其独特的脂质组。EHS中显著上调的关键脂肪酸，如辛酸（C8:0）、硬脂酸（C18:0）和十八烯酸（C18:1），已在独立研究中显示出抗肿瘤作用。像辛酸这样的中链脂肪酸会经历快速的β-氧化，诱导代谢应激并破坏癌细胞信号传导（Fu et al., 2023）。饱和脂肪酸如硬脂酸可以通过触发内质网应激、DNA损伤和UPR通路诱导的凋亡来抑制肿瘤生长（Ogura et al., 2024）。此外，这些脂肪酸的结构特性可以影响细胞膜流动性并调节参与EMT的关键信号通路（Schwab et al., 2024）。因此，EHS中的特征性脂质组合可能通过多种协同机制发挥其强大的抗EMT作用。目前，关于E. helioscopia在肺癌治疗和EMT方面的研究开始受到关注。Chen et al.（2025）发现，E. helioscopia的水提取物可以抑制炎症反应，调节肿瘤增殖相关蛋白，并调节NF-κB/STAT3和Bcl-2/BAX信号通路，从而对小鼠从COPD到肺癌的进展具有治疗和缓解作用。Duan et al.（2025）证明，E. helioscopia可以通过抑制STAT3激活和维持T细胞干性来缓解慢性炎症引起的T细胞耗竭，从而抑制LPS/NNK诱导的小鼠肿瘤发生。然而，目前尚不清楚E. helioscopia中的哪些具体物质负责这种生物活性。研究表明，如油酸和二十二碳六烯酸等脂质物质可以调节NF-κB/STAT3、Bcl-2/BAX和STAT3等通路，并显示出调节T细胞的能力。这表明E. helioscopia种子中的脂质物质可能通过调节这些通路来抑制EMT过程，从而发挥抗肿瘤作用（Zhang et al., 2023, Yang et al., 2025）。然而，这项研究也存在一些局限性，为未来的研究提供了指导。首先，尽管我们的方法涵盖了广泛的脂质代谢物，但它没有提供总脂质含量的绝对定量或全面的脂肪酸谱型。EHS提取物是一种复杂的混合物，观察到的活性可能来自多种化合物类别（如萜类、有机酸）或协同效应。尽管代谢组学已经识别出EHS中的特征性脂质，但仍需要分离和验证具体负责抗上皮-间充质转化效应的活性单体。这项研究为后续的分离工作奠定了重要基础。未来的研究将集中在从富含脂质的组分中纯化活性成分，以验证其抗EMT作用。其次，目前的证据仅限于体外模型；这些成分在复杂的体内微环境中抑制EMT和肺癌转移的有效性需要通过动物模型来确认。最后，EHS提取物调节EMT的精确分子机制，例如与TGF-β/Smad、Wnt/β-连环蛋白或其他经典通路的特定干扰，仍有待完全阐明。代谢组学已成为植物化学中的关键工具，不仅用于编目代谢物，还用于指导药用植物资源的靶向发现和利用。这项研究就是一个例子。通过采用广泛靶向的代谢组学，我们超越了对E. helioscopia全草（EHQ）的传统关注，发现了其之前被忽视的种子（EHS）中独特的、富含脂质的代谢谱型。这种化学差异为我们的后续药理学研究提供了基础假设：EHS可能具有独特的生物活性。EHS在抑制A549细胞增殖、迁移和EMT方面的卓越效果验证了这一假设，直接将种子特有的代谢组与强大的抗肺癌活性联系起来。从代谢谱型到生物活性确认的这一范式展示了现代组学技术如何将开发重点转向未充分利用的植物部分，将它们从废弃物转化为有价值的资源。类似于Lei et al.（2025）提出的生物精炼概念，我们的发现提倡对E. helioscopia采取靶向策略。未来的发展可以战略性地利用种子，特别是其脂质部分，用于抗EMT治疗。因此，这项研究为基于代谢组学的可持续利用药用植物建立了可复制的模型，其中化学见解直接指导资源利用和药物发现流程。我们的发现从根本上改变了人们对EHS的看法，从“农业废弃物”转变为“高价值药用资源”。由于收获困难，EHS目前尚未得到充分利用，但它代表了巨大的未开发潜力。这项研究为其价值化提供了科学基础。未来的发展可以采用“零废物生物精炼”方法：优化提取具有抗转移活性的脂质组分，同时探索其在绿色农药（利用其历史上的杀虫活性）和功能性食品成分方面的潜力，因其富含脂肪酸。这使得整个E. helioscopia植物能够得到多层次的利用。5. 结论总之，这项研究不仅描绘了E. helioscopia全草（EHQ）和种子（EHS）的独特代谢谱型，还从药理学上验证了种子作为对抗EMT的更优资源。通过将组织特异性代谢物积累与抗EMT活性相关联，我们的发现为在未来抗EMT药物开发中优先考虑种子提供了植物化学和药理学依据。这项工作还为解码支持EHS增强治疗潜力的具体代谢途径和生物活性化合物提供了宝贵的参考数据集。