下一代测序技术在骨髓增生异常综合征治疗中的应用：从机制到临床实践

《Blood Science》：Application of next-generation sequencing in the treatment of myelodysplastic syndrome: from mechanisms to clinical practice

　　**摘要（通俗语言总结）**
骨髓增生异常综合征（MDS）是一种起源于造血干细胞和前体细胞的恶性克隆性疾病，其特征是造血功能低下以及极易转化为急性白血病。研究表明，MDS的发病机制与基因突变密切相关，其进展可能包括多个阶段，如细胞遗传学和分子层面的改变，最终导致致癌突变的出现。下一代测序（NGS）技术的广泛应用，包括全基因组测序、全外显子测序和RNA测序，显著提高了我们对MDS相关基因改变和转录组修饰的理解。这些技术不仅加深了我们对分子机制的认识，还有助于识别潜在的治疗靶点和预后生物标志物。因此，2022年世界卫生组织分类系统和国际共识分类系统将分子特征纳入了MDS的分类体系中，并引入了分子国际预后评分系统（IPSS-M）。本文旨在总结NGS在MDS的精准诊断、分类、风险评估、治疗方案选择及治疗效果评估中的作用，为血液系统恶性肿瘤的精准医疗发展提供参考。

**骨髓增生异常综合征（MDS）**是一种可能导致白血病的血液疾病，与基因突变有关，其进展涉及基因和分子层面的变化。下一代测序（NGS）技术，如全基因组测序和RNA测序，极大地增强了我们对MDS这些变化的理解。这些工具有助于识别基因改变和潜在的治疗靶点，从而改善诊断和风险评估。2022年WHO分类系统和国际共识分类系统现在包含了MDS的分子特征，并引入了分子国际预后评分系统（IPSS-M），以促进这些血液癌症的精准医疗。

**常见问题解答**
1. **引言**
骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的髓系肿瘤性疾病，起源于造血干细胞，其特征是髓系细胞的异常分化和成熟、病理性或无效的造血功能、难治性细胞减少以及高转化风险为急性髓系白血病（AML）。
- 常见参与MDS的基因突变和异常包括表观遗传调控因子（如TET2和DNMT3A）、剪接复合体（如SF3B1）、信号通路（如NRAS）、转录因子（如RUNX1）以及肿瘤抑制因子（如TP53），这些因素促进了疾病的发病和进展。
- 分子遗传学检测技术的广泛应用，包括全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）和RNA测序（RNA-seq），加深了我们对MDS分子机制的理解，并有助于识别潜在的治疗靶点和预后生物标志物。因此，2022年世界卫生组织（WHO）分类系统和国际共识分类系统将分子特征纳入了MDS分类体系中。基于NGS的MDS诊断工作流程如图2所示。WGS和RNA-seq在MDS的精准诊断、分类、风险评估、治疗方案选择和疗效评估中的作用日益重要。

**图1：** MDS的分子和遗传机制及潜在治疗靶点。
**图2：** 基于NGS的MDS诊断工作流程。

**下一代测序（NGS）技术**已成为基因组学和转录组学领域的关键进展，通过DNA和RNA测序实现了对基因和转录组改变的详细分析。DNA测序可以检测体细胞和基因组改变，主要技术包括WGS、WES和靶向测序。WGS能全面分析所有类型的基因组变异，但成本较高；而浅层全基因组测序（sWGS）则是一种经济高效的方法，主要用于检测染色体水平的拷贝数改变。WES专注于识别蛋白质编码区域内的变异。靶向测序面板能够高效、深入地检测与MDS发病机制、预后、治疗及可测量残留疾病相关的特定基因集。目前，已引入了一种基于NGS的MDS预后分层系统IPSS-M，该系统依赖于基因突变。在治疗方面，基因突变的检测具有双重作用：它不仅确定了靶向治疗的分子靶点，还揭示了对特定药物的敏感性或耐药性，从而及时调整治疗方案。此外，NGS还能评估和监测微小残留疾病（MRD），预测MDS患者的复发风险。

**RNA-seq**（也称为转录组测序）利用高通量技术分析细胞内转录本，从而研究基因表达、转录多样性、剪接变异及其他转录后调控机制。其在MDS临床实践中的主要应用是检测融合基因，有助于识别新的致病基因和疾病生物标志物。RNA-seq还能检测血液系统疾病中的基因表达改变和剪接异常，理论上可以识别所有融合转录本，提高检测准确性和阳性率。然而，RNA-seq的临床应用仍相对有限。

**2. 在临床实践中的应用**
目前，WGS和RNA-seq在血液系统疾病中的应用日益广泛，涵盖疾病诊断和分类、预后分层、靶向治疗、MRD监测及疾病机制研究。本文详细阐述了NGS在上述各个方面的应用。

**2.1 在诊断和分类中的应用**
在高达90%的MDS患者中，NGS的最新进展使得能够识别在RNA剪接、表观遗传调控、基因转录和细胞信号传导中起关键作用的重复体细胞突变。这些突变对于MDS的诊断至关重要。随着NGS的广泛应用，MDS的诊断标准不断更新和完善。以2016年WHO分类系统为例，该系统引入了NGS技术来分析SF3B1基因的突变状态，进一步提高了MDS-RS（伴有环形铁粒细胞的难治性贫血）和MDS-MLD（多系发育不良型MDS）的诊断准确性。历史上，诊断MDS需要识别超过15%的环形铁粒细胞；而如今只需SF3B1突变超过5%即可诊断MDS-RS。此外，MDS-MLD的诊断标准也从最初的RS<15%修订为RS<15%或存在SF3B1突变时RS<5%。这一变化可能导致更多患者接受luspatercept治疗。2022年WHO和ICC分类系统还新增了两种基于基因改变的MDS亚型：低原始细胞计数伴SF3B1突变的MDS和双等位TP53突变的MDS（MDS-biTP53）。Komrokji等人使用2022年WHO和ICC分类标准重新分类了来自GenoMed4All联盟和Moffitt癌症中心的7017名MDS患者，他们的诊断依据是2016年WHO分类标准，发现3202名（45.6%）患者分类不一致，其中基因定义亚组中有382名（19.1%）患者分类不一致；TP53突变患者中有233名（35.5%）患者分类不一致，SF3B1突变患者中有149名（14.7%）患者分类不一致；del(5q)突变患者中有2820名（56.2%）患者分类不一致，这表明NGS在MDS的诊断和分类中具有必要性。

Huber等人比较了根据2016年、2022年WHO和ICC标准重新分类的717名新诊断MDS患者的情况，发现2022年WHO和ICC分类在MDS-biTP53亚型中变化最为显著（该亚型主要由原始细胞过多的MDS-EB组成，占30/40例）。Zhang等人重新评估了根据2022年WHO标准诊断的MDS患者，其中53名患者被重新分类为MDS-biTP53（其中34名之前被诊断为MDS-EB）。根据2022年WHO分类标准，携带KMT2A、MECOM和NUP98重排及NPM1突变的个体被归类为AML，无论原始细胞比例如何。Huber等人还将12例MDS（包括8例MDS-EB2）重新分类为AML。当比较2016年WHO标准和ICC标准时，8例先前诊断为MDS-EB2的患者根据ICC标准被归类为AML。Zhang等人还重新评估了根据2022年WHO标准诊断的MDS患者，发现30例先前被诊断为MDS-EB的患者被重新分类为AML。

**表1：** 根据2016年、2022年WHO和ICC标准重新分类的MDS患者
| 研究 | 2016年WHO | 2022年WHO | 2022年ICC |
|---------------|-----------------|-----------------|-----------------|
| Huber等人 | 717名新诊断MDS患者 | 12名患者被重新分类为AML | 852名新诊断MDS患者 |
| Zhang等人 | 716名新诊断MDS患者 | 852名新诊断MDS患者 | |

**总结**
下一代测序（NGS）技术在MDS中的应用日益广泛，涵盖疾病诊断和分类、预后分层、靶向治疗、MRD监测及疾病机制研究。NGS的进步不仅提高了MDS的诊断准确性，还为精准医疗的发展提供了基础。尽管取得了这些进展，但在完全阐明MDS的分子机制并将NGS发现转化为临床实践方面仍存在挑战。李等人28研究了635例新诊断的骨髓增生异常综合征（MDS）患者：MDS-5q（4例），MDS-SLD（94例），MDS-MLD（141例），MDS-RS-SLD（45例），MDS-RS-MLD（26例），MDS-EB1（126例），MDS-EB2（192例），MDS-U（7例）。其中MDS-5q（4例），MDS-SF3B1（62例），MDS-biTP53（46例），MDS-LB（140例），MDS-LB和RS（16例），MDS-h（94例），MDS-IB1（100例），MDS-IB2（149例）以及MDS-f（24例）。有3例患者被重新分类为急性髓系白血病（AML）：伴有CEBPA突变的AML（3例）；162例患者被重新分类为MDS/AML：伴有TP53突变的MDS/AML（37例），伴有MDS相关基因突变的MDS/AML（93例），伴有MDS相关细胞遗传学特征的MDS/AML（12例），MDS/AML，NOS（20例）；470例患者仍被诊断为MDS：伴有del(5q)的MDS（4例），伴有SF3B1突变的MDS（59例），伴有TP53突变的MDS（23例），伴有EB突变的MDS（131例），MDS-NOS-SLD（106例），MDS-NOS-MLD（147例）。Nachtkamp等人29研究了5010例新诊断的MDS患者和690例AML患者（不同亚型的具体数量未详细说明）。其中MDS伴有SF3B1/RS（768例），MDS del(5q)伴有SF3B1突变（19例），MDS-biTP53（49例），MDS-LB（1980例），MDS-5q（207例），MDS-h（143例），MDS-IB1（850例），MDS-IB2（914例），MDS-f（80例）。932例患者被重新分类为MDS/AML；4768例患者仍被诊断为MDS：伴有SF3B1突变的MDS（123例），伴有TP53突变的MDS（59例），伴有TP53的MDS/AML（36例），MDS-NOS-SLD（378例），MDS-NOS-MLD（2360例），伴有del(5q)的MDS（234例），伴有EB突变的MDS（878例）。Bruehl等人30研究了49例新诊断的MDS患者：MDS-SLD（6例），MDS-MLD（9例），MDS-RS-MLD（4例），MDS-RS（1例），MDS-EB1（16例），MDS-EB2（9例），ND（4例）。其中MDS-SF3B1（4例），MDS-biTP53（8例），MDS-LB（12例），MDS-h（1例），MDS-IB1（13例），MDS-IB2（7例），CCUS/CHIP（3例），CMML（1例）。5例患者被重新分类为MDS/AML；44例患者仍被诊断为MDS：伴有SF3B1突变的MDS（3例），伴有TP53突变的MDS（7例），伴有TP53的MDS/AML（1例），MDS-NOS-SLD（6例），MDS-NOS-MLD（7例），伴有EB突变的MDS（15例），CCUS（4例），CMML（1例）。张等人31研究了989例新诊断的MDS患者：MDS-5q（15例），MDS-SLD（57例），MDS-MLD（394例），MDS-RS-SLD（28例），MDS-RS-MLD（45例），MDS-EB1（218例），MDS-EB2（207例），MDS-U（25例）。20例患者被重新分类为AML：伴有NPM1突变的AML（19例），伴有in-frame bZIP CEBPA突变的AML（1例）；187例患者被重新分类为MDS/AML：伴有TP53突变的MDS（35例），伴有MDS相关基因突变的MDS/AML（97例），伴有MDS相关细胞遗传学特征的MDS/AML（18例），MDS/AML-NOS（37例）；782例患者仍被诊断为MDS：伴有del(5q)的MDS（15例），伴有SF3B1突变的MDS（53例），伴有TP53突变的MDS（39例），伴有EB突变的MDS（212例），MDS-NOS-SLD（64例），MDS-NOS-MLD（389例），无发育不良的MDS（2例），CCUS（8例）。刘等人32研究了125例新诊断的MDS患者，这些患者具有SFB31突变或RS ≥15%且无过多原始细胞：MDS-5q（5例），MDS-SF3B1（102例），MDS-biTP53（11例），MDS-LB（5例），MDS-h（2例）。其中MDS-SF3B1（74例），MDS-NOS（36例），MDS-5q（5例），伴有TP53突变的MDS（11例）。5q-表示孤立的5q缺失，AML表示急性髓系白血病，biTP53表示biallelic TP53失活，CCUS表示克隆性细胞减少意义不明，DGA表示定义性遗传异常，EB1/2表示过多原始细胞类型1/2，IB1/2表示原始细胞类型增加，ICC表示国际共识分类，LB表示原始细胞少，MDS表示骨髓增生异常综合征（肿瘤），MDS-f表示伴有纤维化的MDS，MDS-h表示低原始细胞型MDS，MDS-SF3B1表示伴有SF3B1突变的MDS，MDS-U表示无法分类的MDS，MLD表示多系发育不良，RS-MLD表示伴有MLD的环状铁粒细胞，RS-SLD表示伴有SLD的环状铁粒细胞，SLD表示单系发育不良，WHO表示世界卫生组织。具有KMT2A、MECOM、NUP98重排和NPM1突变的患者无论原始细胞百分比如何均被分类为AML；MDS-U的诊断已被取消，并部分被CCUS取代。此外，下一代测序（NGS）技术有助于识别MDS的前体疾病，如克隆性细胞减少意义不明（CCUS）或克隆性造血潜能不定（CHIP），这些疾病可能发展为MDS。中国科学院血液病医院的张等人使用2022年WHO分类标准重新评估了之前诊断为MDS无法分类（MDS-U）的病例，发现9例被重新诊断为CCUS。在诊断时应检测以下基因的突变以确定CCUS：TET2、DNMT3A、ASXL1、SRSF2、ZRSR2、SF3B1、U2AF1、IDH1/2、RUNX1、EZH2、JAK2、CBL、KRAS、CUX1和TP53。可以评估发展为MDS的风险。此外，NGS技术可用于区分由其他因素（如感染、自身免疫疾病、既往癌症化疗或放疗、或接触毒素）引起的各种类型的细胞减少。这些因素的影响通常是暂时的，而与MDS相关的基因突变则表明存在持续的克隆性疾病。RNA-seq是一种强大的技术工具，可用于检测MDS中的基因融合事件，这些事件有时与特定肿瘤亚型相关。因此，它可以用于诊断目的。Biancon等人开发了eCLIP-seq来绘制蛋白质RNA结合位点。该技术包括增强型UV交联和免疫沉淀，随后进行测序。通过将这些高分辨率结合数据与批量RNA-seq、单细胞RNA-seq（scRNA-seq）和RNA周转数据相结合，研究人员发现Q157R突变导致的异常剪接主要与结合能力丧失相关，而S34F突变导致的异常剪接则表现为结合能力增强。他们随后通过scRNA-seq在RNA水平上验证了应激颗粒在癌症中的上调，并通过免疫荧光（IF）成像在来自U2AF1突变MDS/AML患者的原代样本中验证了这一现象。U2AF1突变细胞中应激颗粒的增加与细胞在应激下的适应性增强有关，这种增强可以通过应用应激颗粒抑制剂来逆转。这些发现表明，在RNA-seq水平上进行的研究可以进一步阐明肿瘤发展的基本细胞机制，从而有助于诊断和治疗。尽管如此，文献中关于RNA-seq在MDS诊断中的应用相对较少，这表明需要进一步研究以探索RNA-seq在这一领域的潜力和应用。随着技术的进步和深入研究，RNA-seq可能成为MDS诊断和治疗的不可或缺的工具。

2.2. 预后分层应用
就特定的临床和分子风险因素而言，MDS与向AML进展的程度不同。因此，提出了各种预后系统来提高预测MDS患者向AML进展的能力，其中修订后的国际预后评分系统（IPSS-R）已被广泛采用。随着分子检测技术（如NGS）的临床应用，越来越多的临床研究关注基因突变与MDS预后的关系。德国慕尼黑MLL白血病实验室的Haferlach等人尝试通过全基因组测序（WGS）从遗传学角度对MDS患者进行综合分类。多变量Cox分析显示，biallelic TP53失活、复杂核型、RUNX1、ASXL1和SF3B1突变是影响总体生存（OS）的独立因素。这项研究表明，基于遗传异常的分类优于形态学分类，并为未来MDS的精准治疗提供了基础。Fang等人回顾性分析了根据FAB标准分类为LR-MDS的233名患者的临床和实验室变量，并使用NGS数据评估了IPSS-R添加后突变状态对LR-MDS患者生存期（OS）和无进展生存（PFS）的相对贡献。多变量生存分析显示，将JAK2和RUNX1突变以及骨髓原始细胞纳入IPSS-R可以改善LR-MDS患者的风险分层。Liang等人使用来自基因表达组学数据库（GEO）的201名MDS患者开发了一个新的MDS预后评分模型，该模型包括6个风险因素（年龄、骨髓原始细胞百分比、ETV6、TP53、EZH2和ASXL1）。一个由115名来自中国西北部的MDS患者组成的单中心队列用于外部验证。与IPSS和IPSS-R相比，该预测模型改善了整个分析队列的预后分层，从而证明了NGS在MDS患者分层中的预测价值。随着NGS在临床应用中的增加，我们对MDS的分子机制有了更深入的理解。因此，在2022年开发了分子IPSS（IPSS-M）分类系统。IPSS-M不仅包括特定的临床和染色体异常，还包括一组预后相关的体细胞遗传改变，这些改变可以更准确地预测MDS患者的预后，包括SF3B1、TET2、RUNX1、ASXL1、DNMT3A、TP53和EZH2，这些因素与疾病预后相关，并有助于更准确地分层MDS患者的风险。为了广泛验证IPSS-M评分系统，Sauta等人回顾性分析了使用GenoMed4All联盟的2876名原发性MDS患者的临床数据。结果表明，IPSS-M在所有临床终点上的预后区分能力优于IPSS-R（无病生存率的一致性分别为0.81 vs 0.74，无复发生存率的一致性分别为0.89 vs 0.76）。IPSS-R和IPSS-M风险组之间的五对五比较导致1324名患者（46%）被重新分层，其中679名（23.6%）被上调，645名（22.4%）被下调。在接受造血干细胞移植（HSCT）的患者中，IPSS-M显著改善了疾病复发和移植后生存的预测（复发概率的一致性分别为0.76 vs 0.60，无复发生存率的一致性分别为0.89 vs 0.70）。Lee等人验证了基于2022年ICC的IPSS-M在649名原发性MDS患者中的预后能力，并将其与IPSS和IPSS-R进行了比较。结果显示，42.5%的患者被重新分类，29.3%的患者从IPSS-R中被升级。重新分类后，16.9%的患者接受了不同的治疗策略。多项研究评估和验证了IPSS-M在MDS中的应用（表2）。表2 - IPSS-R和IPSS-M在MDS中的预后分层和生存比较。向左或向右滚动可查看完整表格。研究 | IPSS-R | IPSS-M | 非常低 | 低 | 中等 | 高 | 非常高 | 非常低 | 低 | 中等低 | 中等高 | 高 | 非常高 |
--- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
Sauta等人44（N=2876） | 293（2年无复发生存：61.8%） | 806（2年无复发生存：59.8%） | 610（2年无复发生存：40.2%） | 595（2年无复发生存：18.2%） | 572（2年无复发生存：5.9%） | 275（2年无复发生存：66.8%） | 797（2年无复发生存：62.3%） | 306（2年无复发生存：41.8%） | 555（2年无复发生存：28.3%） | 319（2年无复发生存：16.4%） | 624（2年无复发生存：9.7%） |
Lee等人45（N=649） | 22（中位无复发生存：162.1个月） | 170（中位无复发生存：155.7个月） | 173（中位无复发生存：53.8个月） | 141（中位无复发生存：16.0个月） | 143（中位无复发生存：7.5个月） | 18（中位无复发生存：155.7个月） | 132（中位无复发生存：185.5个月） | 95（中位无复发生存：85.2个月） | 121（中位无复发生存：50.6个月） | 92（中位无复发生存：25.1个月） | 191（中位无复发生存：7.8个月） |
Kewan等人46*（N=1281） | 261（NA） | 439（NA） | 222（NA） | 186（NA） | 173（NA） | 178（NA） | 384（中位无复发生存：30个月） | 164（中位无复发生存：21个月） | 152（中位无复发生存：15个月） | 214（中位无复发生存：8个月） | 193（中位无复发生存：4个月） |
Tentori等人47（N=5380） | 867（NA） | 2149（NA） | 1055（NA） | 649（NA） | 660（NA） | 534（2年无复发生存：63.3%） | 1842（2年无复发生存：64.7%） | 709（2年无复发生存：59.6%） | 580（2年无复发生存：46.7%） | 795（2年无复发生存：36.0%） | 947（2年无复发生存：16.3%） |
Sabile等人48（N=144） | 13（中位无复发生存：83.5个月） | 37（中位无复发生存：59.2个月） | 35（中位无复发生存：49.5个月） | 33（中位无复发生存：24.3个月） | 26（中位无复发生存：10.5个月） | 11（NA） | 33（中位无复发生存：59.2个月） | 28（中位无复发生存：56.2个月） | 26（中位无复发生存：24.3个月） | 46（中位无复发生存：9.9个月） |
Lincango等人49（N=182）? | 29（NA） | 68（中位总生存期：84.7个月） | 36（中位总生存期：60.8个月） | 20（中位总生存期：53.6个月） | 13（中位总生存期：16.5个月） | 21（NA） | 62（中位总生存期：84.7个月） | 43（中位总生存期：53.6个月） | 33（中位总生存期：31.0个月） | 23（中位总生存期：18.7个月） |
Aguirre等人50（N=2355） | 295（NA） | 671（NA） | 442（NA） | 381（NA） | 544（NA） | 96（中位总生存期：12.3年） | 560（中位总生存期：6.9年） | 327（中位总生存期：3.6年） | 258（中位总生存期：2.2年） | 454（中位总生存期：1.4年） | 660（中位总生存期：0.5年） |

*IPSS-M = 分子国际预后评分系统；IPSS-R = 国际预后评分系统（修订版）；LFS = 无白血病生存期；MDS = 骨髓增生异常综合征；NA = 未批准；NE = 未评估；OS = 总生存期。

**额外说明：** 本研究中的数据需要验证，且病例总数存在不一致之处。**?** 在本研究中，16名患者的IPSS-R评估结果为NE（未评估）。此外，特定的分子标志物（如变异等位基因频率≥20%；非DNMT3A、TET2和ASXL1（DTA）突变；以及至少存在2种突变）也可作为MDS的高风险进展标志物。这些标志物可以预测尚未符合MDS诊断标准患者的疾病进展。

**与WGS相比，目前关于RNA-seq在MDS预后分层中的应用研究有限。** 最近，Zeng等人在《转化医学杂志》上报告了骨髓增生异常肿瘤中造血干细胞的转录组改变。单细胞转录组结果显示，MAML3和PLCB1高表达的MDS患者总生存期较短，且MDS-EB患者的MAML3和PLCB1表达水平显著高于非MDS-EB患者。此外，诊断时的白细胞计数和中性粒细胞数量较低，PLCB1高表达组中“非常高”风险的患者比例高于PLCB1低表达组。Todisco等人的研究整合了基因组和转录组分析，以评估转录组分析是否能够改进现有的风险分层方法。他们得出结论，SF3B1、SRSF2或TP53多重突变是89%的RS（复发型）MDS患者的疾病修饰因素，不同类别之间的预后差异显著，强调了识别TP53多重突变状态在MDS患者中的重要性。转录组定义的造血祖细胞特征可以在多变量分析中独立于突变类别和IPSS-M预测生存期，表明造血祖细胞定量是骨髓肿瘤中有价值的预后标志物。因此，未来MDS的风险分层可能会从转录组角度进行评估，尽管仍需进一步研究。

**2.3 在精准医疗中的应用** MDS是一种高度异质性的髓系恶性肿瘤，因此患者管理和治疗应个性化。过去，MDS的治疗方案主要基于患者的预后分层，并结合年龄、体能状态、合并症和治疗依从性等因素选择个体化治疗方案。在分子分析时代，有大量信息可用于指导MDS患者的治疗决策并推动精准医学的发展。NGS（下一代测序）可为医生提供关于MDS患者疾病谱的全面了解，并识别预后良好或不良的患者。这些数据可以增强针对AML中已确定的特定突变的靶向治疗，现在也扩展到MDS。对于低风险MDS，激活素受体配体trap（luspatercept）在具有SF3B1突变的MDS中的促红细胞生成活性是精准治疗的一个典型例子。2023年欧洲血液学协会（EHA）的报告表明，对于常见的MDS突变（如SF3B1、ASXL1、TET2、DNMT3A、EZH2、IDH2和U2AF1），luspatercept优于促红细胞生成素（EPO）。**低甲基化药物（HMAs）**（如阿扎胞苷、地西他滨和地西他滨/塞达西滨）可以改善具有甲基化相关突变（如TET2和DNMT3A突变）患者的长期预后。Roxadustat（FG-4592）是一种口服的缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶抑制剂，可调节氧感知通路并增加慢性肾病患者的EPO生成和红细胞生成。MATTERHORN是一项随机、双盲、三期临床试验，结果显示接受roxadustat治疗的患者比安慰剂组具有更高的输血独立率。**单核细胞中较高的端粒酶活性和端粒酶逆转录（TERT）表达是MDS的不良预后特征。** Imetelstat是一种竞争性端粒酶抑制剂，对于对促红细胞生成剂（ESAs）无反应或不适合使用ESAs的重度输血依赖性LR-MDS患者，显示出持久的输血独立性和疾病修饰作用。2024年6月，美国食品药品监督管理局（FDA）正式批准imetelstat用于从低风险到中等风险、依赖输血且对ESA治疗无反应或不适合ESA治疗的MDS成人患者。

**对于高风险MDS患者（尤其是原始细胞比例高的患者），** HMA（低甲基化药物）、抗癌药物和异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是最常见的治疗选择。然而，allo-HSCT仍然是唯一的根治性疗法，allo-HSCT后的复发是影响长期生存的主要因素。NGS指导的精准治疗为这些患者提供了新的治疗途径。例如，ASXL1、TET2和DNMT3A突变通常与不良预后相关，但阿扎胞苷治疗可以延长这些患者的长期生存期。U2AF1突变与不良预后相关，多项研究表明，MDS骨髓细胞中的U2AF1和SF3B1突变可诱导目标基因IRAK4的致癌异构体，导致NF-κB信号通路过度激活和白血病干细胞及祖细胞（LSPCs）的适应性增强。IRAK4抑制剂CA-4948在临床前研究和MDS临床试验中均显示出疗效，携带剪接因子突变的患者反应率更高。大约5%的MDS患者携带IDH1/IDH2突变。Ivosidenib（AG-122）和enasidenib（AG-LH）分别是IDH1和IDH2的口服小分子抑制剂，具有良好的耐受性，并能在MDS患者中引发反应。TP53异常在大约5%至10%的de novo AML和MDS患者中观察到，与不良预后相关。Eprenetapopt（APR-246）是一种恢复WT p53构象和功能的前药，在TP53突变的AML/MDS患者中显示出高反应率和良好的耐受性。magrolimab（Hu5F9-G4）是一种针对CD47的单克隆抗体，与阿扎胞苷联合使用，在新诊断的高风险MDS患者中显示出更好的疗效。最近的研究报告了MDS中的KMT2A重排（KMT2Ar）。KMT2Ar患者预后较差，尤其是在治疗相关病例中。KMT2A抑制剂JNJ-75276617（bleximenib）是一种口服、高效、选择性的menin-KMT2A结合蛋白-蛋白抑制剂，在具有KMT2A或NPM1改变的白血病中表现出临床前活性，并与gilteritinib、venetoclax和阿扎胞苷具有协同作用。venetoclax与阿扎胞苷联合使用目前正在测试用于高风险MDS的治疗。

**值得注意的是，大多数靶向药物的效果尚未得到证实。** RNA-seq仅在最近才应用于临床实践，因此其临床应用的研究相对有限。Berastegui等人通过分析HSC转录组发现MDS特异性病变中DNA损伤诱导转录因子3（DDIT3）的上调。健康HSC中DDIT3的过表达会诱导类似MDS的转录状态和红细胞生成障碍，而在MDS患者的CD34+细胞中敲低DDIT3可恢复红细胞生成。Zeng等人根据伪时间报告了MDS中HSPCs的转录组变化，并强调PLCB1在MDS进展为白血病中的关键作用。PLCB1抑制剂U73122可抑制增殖、诱导细胞周期停滞并激活白血病细胞的凋亡。针对PLCB1的药物治疗可能为PLCB1高表达的患者提供一种策略。

**2.4 应答评估应用** 传统上，MDS患者的MRD（微小残留病）监测主要集中在MDS-EB患者上，这些患者中MRD监测的临床意义尚不明确。最近的多中心临床研究表明，移植前流式细胞术（FCM-MRD）阴性的MDS-EB患者具有更好的长期生存率。2023年国际工作组（IWG）提出，高风险MDS（HR-MDS）的响应标准应首先纳入MRD状态作为探索性终点，并建议将MRD状态视为“CR等效”标准，适用于因不良细胞遗传学和/或严重细胞减少而患有HR-MDS的患者。根据这些标准，达到完全细胞遗传学反应且血液计数符合CR标准的患者被视为“CR等效”，但应单独报告。然而，IWG 2023年的标准并未提供关于MRD检测的具体应用或MRD反应的正式定义。先进的技术，如下一代测序（NGS），使得能够持续监测基因突变并追踪患有高风险骨髓增生异常综合征（HR-MDS）患者的克隆进化动态轨迹。基于NGS的微小残留病（MRD）检测方法通过深度测序扩增子或富集分子，可以实现高灵敏度和特异性，能够检测到低至0.001%的白血病细胞水平，并提供有关肿瘤克隆结构和进化的额外信息。92–97 TP53突变细胞往往对多种疗法（如羟基脲疗法HMAs和异基因造血干细胞移植HSCT）表现出抗性；然而，TP53突变的清除（通常是不完全的）与更长的反应时间和更长的总生存期（OS）相关。97,98 Hunter等人98的研究表明，在HMMA治疗期间清除TP53突变与接受异基因HSCT患者的更好OS和预后改善有关。90 在评估阿扎胞苷加eprenetapopt治疗效果的II期研究中，TP53变异频率（VAF）的显著降低与更好的临床反应相关。80 Yun等人99使用单变量和多变量Cox回归模型，基于157名患者的突变清除率（NGS）结果，全面分析了NGS轨迹对OS的预后影响。多变量分析显示，实现基于NGS的突变清除的患者与持续突变的患者相比，OS显著改善。连续的TP53 VAF评估可以预测结果，TP53清除是OS改善的独立协变量。此外，Hou等人100建议，通过流式细胞术（FCM）监测MRD以及在第30天监测基因突变的清除情况，有助于预测MDS患者移植后的疾病进展。在MDS患者中，FLT3突变的清除率与预后相关。对1012项BRIGHT AML和MDS研究的分析显示，在基线时显示FLT3突变并在CR（完全缓解）状态下的患者中，所有患者的FLT3突变都被清除（VAF <0.05）。当监测到复发的患者的FLT3突变时，VAF增加，表明持续的分子监测是必要的。90 如预期，HSCT后MRD标志物的检测或重新出现与更高的复发率和较差的预后相关。Duncavage等人101对接受HSCT的MDS患者的骨髓样本进行了纠错测序。他们的发现表明，骨髓中持续存在疾病相关突变（VAF ≥0.5%，无论是在异基因HSCT后第30天还是第100天）的患者，其疾病进展风险显著增加，且无突变患者的无进展生存期（PFS）较低。101 在另一项研究中，Tobiasson等人11使用滴液数字聚合酶链反应（ddPCR）监测HSCT后通过NGS先前识别的多个突变，并证明任何时间点的MRD阳性与更短的OS和无复发生存期强烈相关。此外，阳性截止值与预后之间存在关联，当使用0.1%、0.3%和0.5%的VAF作为截止值时，首次阳性MRD后的估计累积复发率分别为41%、55%和63%。11 总而言之，上述研究强调了治疗期间连续NGS的临床价值，并前瞻性地验证了NGS阴性作为评估治疗结果的生物标志物的有效性。在MDS（涉及大量基因的情况下），评估建立用于诊断和随访的最小共识基因组的可行性至关重要，因为基因组的大小直接影响实验室在临床可行时间内提供结果的能力，并影响所需的测序深度和样本处理量。此外，MDS的最佳监测策略可能需要整合多种技术，如嵌合体分析、流式细胞术和分子生物学技术，以确保全面和准确的疾病管理。102 新技术的出现（包括提供基因组和蛋白质组数据的单细胞测序）可能代表了疾病监测发展的新进展，无论是测量MRD还是准确表征这种状况。103

3. 局限性和解决方案
尽管NGS技术具有高通量和高灵敏度等优点，但在其技术和操作方面仍存在一些挑战和局限性，包括临床应用、数据解释和其他潜在问题。104,105 首先，NGS平台通常生成的读长较短，通常只有几百个碱基对，这使得重组事件、重复序列和结构基因组变异的分析变得复杂。其次，NGS产生大量数据，需要大量的计算资源进行存储、管理和分析，以及专业的生物信息学支持，这增加了技术应用的复杂性和成本。第三，某些NGS平台可能具有较高的错误率，特别是在读段末端，可能导致假阳性或假阴性，从而影响突变检测的准确性。此外，许多NGS方法在样本准备阶段涉及PCR扩增，这可能会引入扩增偏差，尤其是在GC含量高或低的区域。这些偏差可能影响数据的一致性和可重复性。最后，尽管某些基因突变具有预后相关性，但相应靶向药物的临床疗效仍不尽如人意。将NGS发现有效转化为临床应用以改善患者预后是一个必须解决的关键挑战。为了克服这些限制，基因和转录组测序领域出现了新的研究方法。对于基因组测序，第三代测序技术实现了单细胞长读长基因组测序。106 单分子测序技术可以在单个分子水平上对DNA进行测序，避免了PCR扩增过程中引入的错误。107 最近的研究表明，单细胞测序可以通过比较MDS细胞的转录组和表观基因组与最近的正常细胞或细胞群的转录组和表观基因组来区分异质性亚克隆。108 新兴的单细胞分析技术能够精确表征单个细胞，并已经改变了我们对正常和恶性造血的理解。纳米孔测序技术使用纳米孔对DNA分子进行测序，易于操作，测序速度更快，且成本更低。109,110 在转录组学方面，单细胞转录组学、空间转录组学和可编程全长异构体转录组学等新研究技术的进步提供了对MDS转录组改变的更深入理解。空间转录组学通过监测基因表达来检查组织内细胞类型的空间分布。111,112 这种方法阐明了细胞间的相互作用、空间排列和功能，特别是在肿瘤微环境以及发育和组织再生过程中。单细胞转录组测序能够对单个细胞的转录组进行表征，为几乎所有给定状态下的转录本（包括蛋白质编码mRNA和多种非编码RNA）提供全面和快速的序列和表达数据。113 该技术还捕捉了细胞间的异质性，并增强了对基因表达模式、调控机制和生物过程（如疾病启动和进展）的理解。可编程全长异构体转录组测序（PROFIT-seq）采用组合逆转录方法捕获多聚腺苷酸化、非多聚腺苷酸化和环状RNA，并结合一个可编程控制系统，在测序过程中选择性地富集目标转录本。这种方法提供了一种准确高效的目标转录本测序新方法，同时保持了整体转录组的量化，未来可能在临床诊断和靶向富集方面有应用前景。113 此外，随着技术的发展，多组学测序已成为一种重要的研究方法。114 通过联合分析基因组、转录组和蛋白质组数据，研究人员可以更全面地理解遗传信息和调控机制。

4. 总结与展望
NGS技术正在快速发展，并已广泛应用于科学研究、临床诊断和治疗管理。全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES）技术能够全面获取遗传信息，涵盖肿瘤细胞基因组的结构和表达特征。RNA-seq有助于在转录组水平上精确分析MDS中的基因结构和功能，阐明疾病发病机制和进展的生物学特征和分子机制。基于NGS的MRD监测为选择最佳治疗策略提供了有力证据。总体而言，这些发现支持临床精准诊断和治疗。此外，包括时空转录组学、多组学整合和机器学习辅助变异解释在内的新兴技术将进一步阐明控制MDS启动和进展的分子机制。随着NGS的广泛应用和这些新兴技术的发展，MDS的分子机制将得到进一步阐明，为准确诊断、预后分层、个性化治疗和疾病监测提供新策略，从而提高治疗效果和患者预后。

作者贡献
Y.-Y.M.、L.Z.和X.Z.参与了概念和设计。所有作者共同起草了手稿。Y.-Y.M.和C.Z.对重要学术内容进行了关键修订。X.Z.负责审阅和编辑工作。