利用台式核磁共振（NMR）和SABRE-超极化[1-13C]丙酮酸技术实现稳健快速的细胞代谢物检测

《Analytical Chemistry》：Robust Rapid Cellular Metabolite Sensing Using Benchtop NMR and SABRE-Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate

　　高分辨率图像下载 MS PowerPoint 幻灯片

超极化核磁共振（Hyperpolarized NMR）已成为一种强大的分析技术，能够显著增强目标核磁共振（NMR）信号，提高对独特化学和生物动态研究的灵敏度。在这里，我们展示了基于可逆交换信号放大（Signal Amplification By Reversible Exchange，简称 SABRE）的超极化策略，用于生成高度可重复的超极化 [1-13C]丙酮酸探针，以进行酵母代谢的台式表征。该方法允许快速、可扩展地在台式设备上制备适用于活细胞实验的生物相容性超极化溶液。我们证明这种生产过程可以整合到一个模块化、紧凑的工作流程中，以表征细胞培养中的实时代谢，使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模型生物。通过高时间分辨率，我们展示了该方法可以解析超极化 [1-13C]丙酮酸转化为氧化脱羧产物二氧化碳（CO2）和碳酸氢盐（bicarbonate）的过程。这种转化在将试剂引入细胞后持续存在并可检测到超过300秒。我们通过代谢物动力学模型显示了脱羧活性，并从二氧化碳和碳酸氢盐（碳酸缓冲系统）的平衡中推导出随时间变化的pH值，以探究活跃代谢期间细胞环境的变化。这些结果突显了台式 SABRE-超极化 [1-13C]丙酮酸作为用于活细胞代谢表型分析的、可扩展且特异性强的探针的实用性，适用于微生物工程、药物反应谱分析和动态代谢筛选等高通量应用。

**引言**

高通量代谢分析是许多生物学研究领域的核心，从癌症生物学到微生物工程都是如此。(1?3) 然而，尽管系统生物学工程和细胞建模取得了进展，但大多数体外代谢测定仍然受到灵敏度、特异性和可扩展性之间权衡的限制。高精度的定量质谱分析可以提供详细的终点信息，但通常需要破坏性采样、标记引入或复杂的样品制备。(4,5) 相比之下，基于荧光的光学方法具有高灵敏度和与活细胞非终止成像的兼容性，但其有限的化学特异性、定量变异性以及对外源探针或基因修饰的依赖性可能会使解释复杂化并干扰天然生物学过程。(6,7) 因此，实时、定量、非终止地追踪大量样本中的内源性代谢物仍然是一个重要的未满足需求。这一差距限制了那些需要时间分辨率和对中心代谢有定量洞察力的领域的发现速度。此外，为了与 NIH 支持的通过新方法减少对动物模型依赖的努力保持一致，对能够在非动物系统中进行详细机制研究的分析工具的需求也在增加。(8,9) 从哺乳动物细胞中的药物筛选到工程微生物中的途径优化，都需要一种广泛可用、高通量的工具，能够以高灵敏度实时监测天然代谢转化。

超极化（HP）磁共振已成为解决这一挑战的变革性技术，可为某些分子物种提供10,000倍或更高的NMR信号增强。(10?12) 具体来说，如丙酮酸这样的13C标记代谢底物可以很容易地被极化，并对代谢动态具有高灵敏度，揭示关于酶促通量通过糖酵解和氧化途径等关键定量和定性信息。(13?15) 在HP方法中，溶解动态核极化（d-DNP）仍然是金标准，提供高极化水平并兼容多种分子靶标。d-DNP 已经使HP [1-13C]丙酮酸在体外细胞代谢研究、临床前动物模型中的心血管、肿瘤学和神经病学疾病成像(20?24) 以及人类患者中的癌症生物学体内可视化和定量(14,25?27) 中得到应用。尽管d-DNP技术取得了成功，但其基础设施要求（包括低温条件和高昂的安装成本）可能会限制技术的广泛采用，并限制某些实验室的访问。(12,27) 基于仲氢的方法，包括氢化仲氢诱导极化（如侧臂氢化，SAH-PHIP），提供了一种比d-DNP更快、更通用的实验室规模替代方案。(28,29) SAH-PHIP 通过将纯自旋异构体的仲氢气体化学结合到分子前体中，然后通过化学转化（例如水解）释放HP靶标来实现快速极化。(29,30) 尽管这种方法已经实现了适用于包括体内成像在内的多种应用的适当极化水平，并展示了丙酮酸及其下游代谢物（如乳酸）的稳健代谢追踪和成像(29,30)，但它需要前体合成和侧臂切割。(29) SABRE（通过可逆交换信号放大）是一种补充的基于仲氢的方法，它通过将自旋顺序直接从仲氢转移到目标分子上来绕过SAH-PHIP的许多固有限制，无需永久性化学转化。(31?34) 因此，SABRE可以避免前体合成和侧臂切割步骤。一些SABRE演示表明可以实现接近完美的极化(35)，并且该方法具有几个优势，使其特别适合台式和高通量工作流程。这些优势包括快速极化循环（大约几十秒）、能够维持可再极化的HP溶液脉冲，以及使用廉价硬件和室温溶剂直接制备HP试剂。(32,36,37) 通过对核心方法的扩展（SABRE in SHIELD 使极化转移到异核素，SABRE-SHEATH)(34,38,39) 和引入配体以扩展该方法到关键代谢物（如丙酮酸）(34,40,41)，SABRE的适用性得到了增强。此外，最近的进展，特别是开发了像Ace-SABRE这样的生物相容性溶剂系统和模块化纯化策略，使得可以直接生成可注射的、生物相容性的代谢物（如 [1-13C]丙酮酸) HP溶液。(32,42?44)

**图1**
图1. 使用SABRE超极化进行细胞代谢通量台式评估的图形工作流程。[A] 细胞制备过程的图形描述，其中可以使用不同的细胞亚型与所示的台式工作流程配合使用。[B] 用于SABRE超极化的气泡装置，其中仲氢气体通过NMR管在屏蔽的磁环境中调节，并施加外部磁场（通常为0.4 μT）。[C] SABRE超极化化学过程，其中仲氢和丙酮酸在铱金属催化剂（这里是Ir-IMes）上可逆交换，通过将仲氢自旋顺序转移到丙酮酸13C核自旋上来生成HP [1-13C]丙酮酸。[D] 台式SABRE极化器和NMR光谱仪，其中注入细胞和HP丙酮酸生成一系列代谢光谱。[E] HP [1-13C]丙酮酸的产物，显示[1-13C]丙酮酸通过丙氨酸氨基转移酶（AAT）转化为[1-13C]丙氨酸，或者被转运到线粒体中并通过有氧代谢进行后续氧化脱羧（转运蛋白线粒体丙酮酸载体，MPC，和丙酮酸脱氢酶复合体，PDH）。

这些特点使SABRE成为一种高度可访问和可扩展的超极化策略，特别是对于需要在多个样本上进行重复测量的应用，如代谢通量筛选、工程细菌中的途径优化或肿瘤细胞系中的高通量表型分析。在这里，我们提出了一个基于SABRE的平台，可以使用HP [1-13C]丙酮酸实时追踪活细胞悬浮液中的代谢(图1)。我们证明这种方法可以解析其转化为下游产物，包括[13C]碳酸氢盐/13CO2（氧化脱羧），从而实现代谢通量的动力学可视化。以酵母为例，我们展示了使用1.4 T台式NMR系统在3分钟内进行代谢读数的追踪，并且无需低温设备。能够以实时分辨率、非破坏性采样和天然底物标记观察细胞代谢，使SABRE HP丙酮酸成为生物学研究中实用且强大的工具。

**实验部分**

**[1-13C]丙酮酸的制备和超极化**

通过将13.8毫克基于铱的SABRE前催化剂（[IrCl(COD)(IMes)）（其中COD = 1,5-环辛二烯，IMes = 1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)咪唑-2-亚烯）和15.5毫克[1-13C]丙酮酸（Cambridge Isotope Laboratories, Inc.）溶解在2.0毫升80%（v/v）丙酮（Fisher Scientific）和D2O（Cambridge Isotope Laboratories, Inc.）的混合物中，以及24 mM二甲基亚砜-d6（DMSO-d6，Cambridge Isotope Laboratories, Inc.），来制备用于SABRE的超极化[1-13C]丙酮酸溶液。Ir-IMes的合成方法如前所述。(45) 将混合物放入超声浴中，直到催化剂和底物完全溶解，得到均匀溶液。取1毫升溶液转移到装有1/4英寸PTFE管的常规5毫米NMR管中（更多细节见SI）作为超极化反应器。为了完全激活催化剂，将含有样品的NMR管用100 psi的仲氢（p-H2）加压，并放入位于0.40 mT磁场中的冷水浴中的SABRE极化器中（更多细节见SI）。(37) p-H2（>98%富集，见SI）以100 sccm的流速通过溶液，每2分钟采集一次信号，直到样品信号的变化小于5%（见SI）。激活和极化稳定后，通过导管以100 sccm的流速向溶液中通入仲氢90秒，然后将NMR管直接转移到1.4 T台式NMR（SpinSolve Carbon，Magritek）中进行检测，或者转移到单独的装置中制备水性HP介质。

**[1-13C]丙酮酸超极化介质的制备**

生物相容性溶液的制备方法类似于McBride等人之前描述的协议(44)。超极化后，包含[1-13C]丙酮酸、极化催化剂、丙酮和D2O的HP溶液被转移到表面场约为200 mT的定制单侧Halbach阵列上，并对样品进行减压。减压后，移除p-H2导管，插入新的导管，然后将HP溶液提取到含有4毫升用苏丹蓝II染色的丁酸乙酯的注射器中（图2D，步骤1）。在注射器中混合HP溶液和丁酸乙酯后，发生相分离，形成有机相和水相。然后通过导管将水相从底部提取到干净的注射器中（图2D，步骤2）。接着将此溶液转移到加热到大约70°C的水浴中的Pyrex试管中，通过导管以2.4 slm的流速通入氢气进一步纯化溶液，进一步减少残留的丙酮含量（图2D，步骤3）。然后将水相HP丙酮酸转移到注射器中用于分析或代谢传感实验（图2D，步骤4）。手动制备纯化HP [1-13C]丙酮酸溶液的总时间为50–55秒。

**[1-13C]丙酮酸在酿酒酵母中的代谢传感**

通过将7.0克酿酒酵母（Sc，Baker’s yeast）均匀混合在44.0毫升0.2 M磷酸盐缓冲液（Na2HPO4/NaH2PO4，pH ～ 6.5）中，并在35°C下孵育以激活细胞代谢来制备酵母悬浮液。向酵母悬浮液中加入50 mM蔗糖作为碳源以增强细胞代谢。(19) 在测量酵母代谢通量之前的三分钟，将0.3毫升预孵育的酵母悬浮液转移到35°C预热的高通量5毫米NMR管（Wilmad Labglass）中，并放入1.4 T台式NMR光谱仪（SpinSolve Carbon，Magritek）中。我们没有测量酵母细胞的数量，但在补充信息（SI）中提供了一个估计值。处理后，将大约0.3毫升按照上述方法制备的HP水溶性[1-13C]丙酮酸溶液注入含有酵母的试管中，并使用导管进行均质化处理，以确保均匀分布。通过使用伪二维13C脉冲序列来监测代谢通量，该序列采用7°激发脉冲并进行了质子解耦，采集时间为1.6秒，重复时间（TR）为3.5秒。

结果与讨论：可重复的超极化和[1-13C]丙酮酸的处理
为了强调生物相容性SABRE制备的可重复性，我们在图2A中展示了在5毫米NMR管反应器中（在p-H2压力下）以及转移到水介质后对HP [1-13C]丙酮酸信号的测量结果。对于所呈现的数据，样品首先在原位进行极化并测量，极化测量完成后，再使用上述方法进行纯化，结果如图2D所示。纯化后的样品不再显示结合的丙酮酸共振峰，而是同时显示HP [1-13C]丙酮酸和HP [1-13C]丙酮酸水合物的共振峰，这是由于丙酮酸在水溶液中的水合平衡。为了比较和量化极化水平（详细信息见SI），我们获取了纯[1-13C]乙酸（17.18 M）的单次扫描光谱作为参考（图2B）。
在HP样品的纯化过程中，使用了一个单侧的0.2 T Halbach磁体阵列。如图2C所示，该磁体阵列有助于减少处理过程中HP样品的松弛。在这些松弛实验中，HP样品在5毫米NMR管反应器中进行了原位测量，处理前使用的是SABRE溶液（80%丙酮溶于D2O）。数据是通过首先极化样品，然后将样品转移到松弛场中，接着在1.4 T台式NMR光谱仪中传输和/或获取数据来获得的（见SI）。在这里，0.4 μT（极化场）和地球磁场（EMF）下的松弛时间都比外部更高磁场下的松弛时间短，其中Halbach阵列场的松弛时间和1.4 T台式NMR中的松弛时间都约为100秒（图2C）。我们假设这种趋势是由于在较低磁场下丙酮酸中的1H和13C自旋之间的标量耦合主导了松弛机制，导致相对较快的松弛速率；而在较高磁场下，丙酮酸自旋之间的塞曼分裂（化学位移差异）大于标量耦合，导致松弛时间逐渐延长，在高磁场下松弛趋于平稳或减少，这是由于化学位移各向异性效应。图2C中显示的趋势得到了先前研究（29,46）中类似趋势的支持，并说明了在50-55秒的纯化过程中保持HP [1-13C]丙酮酸样品处于足够高磁场中的必要性，以最小化T1诱导的极化损失。观察到的极化损失主要与T1机制损失相关。
值得注意的是，所使用的纯化方法也导致了处理后溶液结果的稳健性和可重复性，即丙酮酸浓度和残留丙酮浓度。表1显示了图2A中所示三次实验的极化水平、丙酮酸浓度和丙酮浓度。由于先前的研究表明丁酸酯的含量可以忽略不计（<1 mm）且铱的含量少于20 μm（44），因此本工作中没有测量丁酸酯和铱的浓度。我们设想，纯化过程的自动化可以将总处理时间至少减少一半，从而显著降低T1极化损失。此外，通过使用新的脉冲方法或更高效的副氢气输送方式，未来对SABRE超极化的优化有可能将13C极化强度提高2-4倍（47-50）。综合这些未来的发展（作者正在进行的工作），预计可以获得极化强度超过20%的生物相容性HP [1-13C]丙酮酸溶液。

表1. 样品处理后HP [1-13C]丙酮酸溶液的组成（n = 3）
| 解决方案参数 | 参数值 |
|------------|---------|
| 初始极化 | 8.6 ± 0.2% |
| 最终极化 | 4.0 ± 0.3% |
| 处理后[1-13C]丙酮酸浓度 | 74 ± 5 mM |
| 处理后残留丙酮浓度 | 26 ± 3 mM |

使用SABRE HP [1-13C]丙酮酸对酵母细胞的代谢感应
为了评估SABRE超极化[1-13C]丙酮酸的代谢敏感性和生物学适用性，我们对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）悬浮液中的中心能量代谢进行了时间分辨NMR测量。选择酵母作为模型系统，是因为其代谢的稳健性、快速生长以及在工业生物技术和生物医学研究中的相关性。准备了SABRE HP [1-13C]丙酮酸的处理溶液，并将其与在D2O中活跃呼吸的酵母细胞悬浮液混合（见方法部分）。混合物在1.4 T台式NMR光谱仪（SpinSolve Carbon, Magritek）中测量，从混合后大约3秒开始。该实验重复进行了三次（n = 3），以展示该方法的可重复性，所有数据均使用奇异值分解（SVD）和自动化积分协议进行处理（数据处理详情和所有处理数据见SI）。图3A-D分别显示了35秒、105秒、175秒和336秒时的代表性光谱。这些光谱清晰地显示了多种由丙酮酸衍生的氧化脱羧产物：13CO2和[13C]碳酸氢盐（通过丙酮酸脱氢酶），以及丙酮酸的水合形式[1-13C]丙酮酸水合物。

图3
图3. 使用HP [1-13C]丙酮酸表征酵母细胞代谢的一个实验中获得的代谢和时间分辨率的示例光谱。实验中每3.5秒获取一次光谱，上面显示了四个示例光谱：[A] 35秒时，第10个瞬态；[B] 105秒时，第30个瞬态；[C] 175秒时，第50个瞬态；[D] 336秒时，第96个瞬态。

高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片
在整个实验过程中，光谱的分辨率和质量保持较高，证明了SABRE方法与活细胞悬浮液的兼容性以及延长监测窗口的能力。重要的是，这些结果展示了SABRE平台在台式代谢分析中的几个关键优势。首先，使用完全基于台式的设备（极化器和探测器），我们利用所描述的技术在5分钟内监测代谢物信号（特别注意到在336秒时[13C]碳酸氢盐和13CO2的信噪比（SNR）超过了10:1），这表明使用低场光谱学结合SABRE极化可以实现长时间的代谢通量追踪。其次，所描述的技术可以在几分钟内生成生物相容性的极化丙酮酸，从而能够解析不同的酶促途径，包括氧化通量。

为了定量了解活酵母细胞中[1-13C]丙酮酸的代谢动态，我们将每个代谢物的时间分辨信号拟合到基于常微分方程（ODE）的模型中，使用单一衰减常数（γ）来解释相应产物的所有衰减来源。这种方法利用了初始的强极化和高底物浓度，将丙酮酸视为一个伪饱和库，允许使用一阶模型来处理下游产物的动力学，而无需反向耦合（51）。丙酮酸水合物的时间轮廓是通过使用由生产和衰减项控制的单室模型来拟合的。相比之下，氧化脱羧产物CO2和碳酸氢盐则使用双室模型进行建模，以考虑它们通过碳酸缓冲液平衡的相互转化，同时捕捉CO2的直接酶促产生和随后的转化为碳酸氢盐的过程。丙酮酸转化为这些产物的相应流程如图4A所示。所有模型数据集（n = 3）的平均拟合结果见表2，其中一个数据集的示例拟合结果见图4B-D（其余数据见SI）。所有模型均使用最小二乘优化进行拟合，微分方程和拟合约束的更多细节见SI。

图4
图4. [A] HP [1-13C]丙酮酸转化为产物的途径。一个实验中丙酮酸及其产物的数据和拟合结果：[B] 丙酮酸拟合为单指数衰减，用作下游产物动力学模型的驱动输入函数；[C] 丙酮酸水合物拟合为单室ODE模型；[D, E] CO2和碳酸氢盐分别拟合为双室ODE模型。

高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片
表2. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中丙酮酸代谢的动力学分析拟合参数
| 拟合参数 | 参数值 |
|------------|---------|
| τPYR | 121 ± 14 sk |
| PYR→CO2 | 0.00023 ± 0.00003 s–1 |
| kBIC→CO2 | 0.06 ± 0.01 s–1 |
| kCO2→BIC | 0.023 ± 0.003 s–1 |
| PYR→PH | 0.0023 ± 0.0003 s–1 |
| γPH | 0.052 ± 0.002 |
| γBIC/CO2 | 0.015 ± 0.002 |

如图4B所示，HP [1-13C]丙酮酸的单指数信号衰减表明，丙酮酸可以被视为一个源项，其中拟合的单指数衰减（衰减常数τPYR）代表了随时间变化的底物信号可用性，并用作下游产物动力学模型的驱动输入函数。由于丙酮酸的产生，丙酮酸水合物的含量在实验过程中急剧增加，然后逐渐减少，这与一级转化动力学一致。CO2在采集的第一分钟内迅速增加，反映了丙酮酸脱羧的初始氧化爆发。碳酸氢盐的形成相对于CO2延迟，但一旦在细胞内基质中建立平衡，其浓度也会随之上升。

另外，发现CO2和碳酸氢盐之间的转化率是不对称的，正向水合速度比反向脱水速度快，这与在微酸性环境中的预期一致（52）。这种建模框架的一个潜在优势是能够从这些相对信号动态中提取生理化学见解。具体来说，我们可以利用CO2和碳酸氢盐的拟合结果来计算实验过程中的这些产物的比例。这里，我们假设这个比例估计了系统的表观细胞内pH值，因为文献（52）中的数据与这些比例计算出的pH值一致（我们计算出采集开始时的细胞内pH值为4.8 ± 0.1，实验结束时上升到6.2 ± 0.1）。图4中显示的同一实验的pH变化在图5中也有绘制（所有数据见SI），同时显示了HCO3–/CO2信号比随时间的变化。值得注意的是，这些值与实验前后测量的整体悬浮液pH值（分别为5.9和6.4）不同。因此，我们假设测量的比例和计算出的pH值反映了细胞内产生的HP 13CO2信号的显著贡献。这种CO2可以在细胞内或细胞外转化为碳酸氢盐，但随着时间的推移向细胞外pH值的逐渐转变可能反映了代谢物跨细胞膜的运输和平衡。虽然需要更严格的实验来完全解析这些动态，但目前的结果突显了这种方法无创探测细胞内微环境的潜力。

图5
图5. 从拟合模型得出的碳酸氢盐和CO2比例的比较 [A] 使用Henderson–Hasselbach方程和碳酸缓冲系统的pKa（6.1）来估计细胞内pH值。

高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

总体而言，这些结果强调了SABRE HP 13C光谱学的独特能力，不仅可以捕获酶促通量，还可以捕获完整细胞中的动态生化缓冲状态。使用定制的ODE模型，可以以亚分钟级的分辨率可视化和量化不同的细胞代谢，为基于细胞的代谢表型分析提供了一个可扩展且信息丰富的平台。这种方法对于筛选工程微生物菌株或受扰动的哺乳动物细胞具有潜力，其中途径活性和环境因素（例如细胞内pH值和线粒体功能）在表型表达中起着关键作用。SABRE平台的可扩展性和简单性使其非常适合用于台式工作流程，有助于推动生物医学和生物技术研究的未来应用。通过实现实时的、非侵入性的细胞代谢追踪，SABRE 13C超极化代谢物提供了一种新的方法，可用于表型和功能筛选。在哺乳动物系统中，包括在肿瘤学和免疫代谢学中的应用，SABRE可以用于高通量版本的现有应用，例如监测丙酮酸到乳酸的转化、氧化代谢和氧化还原状态，从而为治疗反应和肿瘤分析提供信息（我们合作实验室正在进行的工作）（12,20,24,32,53）。在微生物系统中，基于SABRE的代谢分析可以加速途径优化和菌株工程，例如识别大肠杆菌（54,55）或酿酒酵母（56）在乙醇和丁醇生产中的通量瓶颈。

结论
这项工作展示了基于SABRE的HP [1-13C]丙酮酸作为台式细胞代谢传感平台的开发。我们在酿酒酵母上的结果确立了该平台的关键能力，能够在超过3分钟的时间范围内以亚分钟级的分辨率可视化细胞代谢。可重复的超极化水平以及生物相容性的纯化方案证明了该方法在完全基于实验室台式设备的流程中用于活细胞的可靠性。除了简单的通量测量外，对二氧化碳和碳酸氢盐产物比例的分析还能够实现pH动态的实时估算。这种能够直接且无创地探测细胞微环境的能力代表了细胞代谢传感技术的一项重大进步。这项工作是建立基于SABRE的平台作为通用实验室平台的首步，该平台可用于在基于细胞的系统中进行代谢通量测量。快速极化循环、室温操作以及实验室台式工作流程的结合，充分利用了SABRE超极化技术的便捷性和可扩展性，以及台式核磁共振（NMR）检测技术，使得这种方法特别适合在未来广泛应用于各个领域——从药物筛选到工程微生物中的代谢途径优化等高通量研究。