《Analytical Chemistry》：Advances in Analysis of Therapeutic Oligonucleotides with Chromatography Coupled to Mass Spectrometry
治疗性寡核苷酸（ONs）已成为针对脊髓性肌萎缩症、遗传性转甲状腺素蛋白介导淀粉样变性多发性神经病及急性肝卟啉症等既往难以用小分子或单克隆抗体靶向疾病的重要药物 modality。自1998年首款产品获美国食品药品监督管理局（FDA）批准以来，已有21款治疗性寡核苷酸产品获批，另有2款处于预注册阶段、1款获欧洲药品管理局（EMA）批准，涵盖15种反义寡核苷酸（ASOs）、6种小干扰RNA（siRNAs）、2种适配体及1种单双链多聚脱氧核糖核苷酸混合物。这类分子通常通过靶向mRNA直接或间接调控转录或转录后水平的蛋白表达，其序列设计赋予高靶点特异性，而化学修饰与递送策略可提升稳定性、细胞摄取效率及药代动力学性质。常见的骨架修饰包括硫代磷酸酯（PS）连接与磷酰二胺吗啉代（PMO）结构，糖基修饰则涉及2′-氟、2′-O-甲基及2′-O-甲氧乙基（MOE）取代；此外，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）或脂质偶联策略可增强组织靶向性与细胞摄取效率。这些修饰虽提升了成药性，但也引入了结构复杂性——尤其是PS连接产生的手性中心会形成影响体内生物活性与毒性的非对映异构体混合物。siRNA作为一类特殊的ONs亚类，为双链RNA分子，亲水性强且分子量较大（约13 kDa），需依赖脂质纳米粒（LNPs）等载体实现细胞递送。随着治疗性寡核苷酸临床管线的快速推进，行业对支持质量控制的高稳健性、高灵敏度正交分析方法需求激增，这类方法需覆盖身份确证、含量测定、PS非对映异构体分析、杂质谱解析及稳定性评估。潜在杂质包括短链体（n-1、n-2等）、长链体（n+1、n+2等）、PS ONs中的磷酸二酯（PO）连接、脱嘌呤与脱氨基产物及残留保护基团加合物（如N3-(2-氰乙基)胸腺嘧啶（CNET））。监管机构（FDA/EMA）明确要求预先定义包括身份、纯度、杂质谱、含量及稳定性在内的质量属性，EMA最新指南指出杂质鉴定限与界定限分别为1.0%与1.5%，而多数方法可实现约0.2%的报告限。然而，低丰度或结构相关杂质缺乏合格对照品，加之ONs结构多样性与降解途径的特殊性，对分析方法的可靠性提出了更高要求。质谱（MS）已成为ONs及其杂质鉴定与结构表征的核心工具，但其高效分析高度依赖兼容且选择性的色谱分离技术。离子对反相液相色谱（IP-RPLC）因兼具高选择性、分离效率与MS兼容性，仍是ON分析的金标准；阴离子交换色谱（AEX）分辨率优异，但传统上受限于非挥发性盐导致的MS兼容性不足。亲水相互作用液相色谱（HILIC）作为新兴的MS兼容正交分离策略，尤其适用于高极性ONs，可提供与IP-RPLC互补的选择性，且流动相更环保，但其保留机制复杂，稳健性与方法选择性仍有待提升。多维LC策略通过耦合互补分离模式（如第一维IP-RPLC/AEX与第二维HILIC）可显著提升峰容量与杂质解析能力，但技术复杂度与仪器配置要求限制了其广泛应用。本综述系统总结了近期色谱-质谱联用技术在治疗性ONs表征中的研究进展，聚焦IP-RPLC、HILIC及多维LC的优势、局限性与互补性，探讨化学修饰、偶联及结构复杂ONs带来的分析挑战；设置专门章节讨论MS检测的结构表征策略，包括电荷态分布、加合物形成、源内裂解及优化采集策略与定制化数据处理流程；同时回顾LC-MS在药代动力学、生物分布研究及代谢产物与降解产物监测中的生物分析应用；最后展望了面向更稳健、可持续、MS兼容及适配生物分析的先进策略发展方向，以支持该领域的持续研发、法规合规与工业转化。
离子对反相液相色谱（IP-RPLC）
治疗性寡核苷酸分析的核心在于开发高稳健性、高灵敏度与高选择性的方法，以实现杂质的准确识别、分离与定量。由于多数ONs相关杂质与主序列在尺寸及理化性质上高度相似，不仅主成分与杂质间的色谱分离难度大，杂质彼此间的分离也极具挑战，而PS修饰ONs中存在的多重非对映异构体更会导致峰展宽与分辨率下降，因此方法开发中对高选择性的需求尤为迫切。历史上，阴离子交换色谱（AEX）与毛细管凝胶电泳（CGE）因高分辨率被广泛用于ON分析，但二者与质谱（MS）的兼容性不足，限制了其在全面结构表征中的应用。为突破这一局限，IP-RPLC凭借高色谱分辨率与MS兼容性成为主流技术。IP-RPLC利用带负电的ONs骨架与流动相中添加的带正电烷基胺试剂形成离子对，离子对复合物疏水性增强，与反相固定相亲和力提升，从而改善保留与分离行为。尽管离子对形成会削弱序列组成、化学修饰或偶联基团对色谱行为的直接影响，但离子对试剂仍是提升保留与实现足够分辨率的关键。在优化条件下，IP-RPLC可有效分离截短序列、序列变异体与偶联ONs，但部分降解产物（如脱嘌呤物种）仍难以完全解析。
用于IP-RPLC的烷基胺离子对（IP）试剂浓度通常为5–20 mM，可兼容电喷雾电离质谱（ESI-MS）。烷基胺的选择主要决定ONs的保留与色谱分辨率，而缓冲酸则主要影响MS灵敏度。烷基胺的离子对强度主要由其疏水性与挥发性共同决定，依据沸点可将其分为弱（如三乙胺、丙胺）、中等（如二丁胺、二甲基环己胺）与强（如三丁胺）离子对体系。弱IP试剂通常保留与选择性不足，而疏水性更强的胺类虽可提升保留与分辨率，却可能因离子抑制效应降低MS灵敏度。即使离子对强度相近的烷基胺，其链长、支化度或环状结构的差异也会影响其与固定相、ONs的相互作用，以及试剂挥发度与电离效率，因此需谨慎选择IP试剂以平衡色谱分辨率与MS兼容性。
为提升选择性，IP-RPLC方法正逐步采用双离子对策略，突破单一试剂体系的局限。早期研究已证实，流动相中复配两种及以上IP试剂可显著改善峰形与分辨率。在此基础上，近年发展出离子对梯度技术，即在有机相比例升高的同时，将弱IP试剂逐步替换为强IP试剂，通过同步调节溶剂强度与离子对强度，拓宽洗脱窗口并提升复杂ONs混合物的分辨率。系统研究表明，单一弱或强IP体系均非普适最优：弱体系易出现共洗脱，强体系虽洗脱窗口宽但难以完全分离结构相近的变异体；而可控的弱到强IP梯度可大幅减少共洗脱，实现多样ONs混合物的基线分离。最新研究进一步开发了高度灵活的IP-RPLC策略，利用四元泵实现共溶剂梯度与IP试剂梯度的解耦，允许独立优化溶剂强度与离子对转换，采用分段梯度与灵活的弱到强IP调制模式，显著提升了复杂ONs分离的选择性与保留可预测性。
关于抗衡离子，1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）已成为IP-RPLC的标准缓冲酸，其高挥发性可促进液滴去溶剂化，减少离子抑制并提升灵敏度（通常达2–3个数量级），同时可锐化色谱峰、改善分辨率，部分通过抑制PS非对映异构体的分离实现；此外，HFIP还提供缓冲容量，有助于稳定流动相pH。但HFIP作为全氟烷基物质（PFAS），存在持久性、生物累积性与毒性风险，成本较高，易造成LC-MS系统持续污染，需专用仪器或深度清洁；且其高浓度下与乙腈溶解度有限，有时需甲醇作为有机改性剂。缓解策略包括：在耐碱杂化硅胶C18柱上通过提高流动相pH降低HFIP用量，减少PFAS负荷、系统污染与MS谱图复杂性，同时保持色谱选择性；最新研究证实乙酸铵/三乙胺/甘氨酸流动相可替代HFIP，甘氨酸作为亲水氨基酸可显著增强电喷雾电离，提供与HFIP/TEA相当的MS灵敏度，为无HFIP的IP-RPLC-MS提供了更环保、低成本的思路，但非挥发性添加剂可能带来仪器长期兼容性风险，仍需进一步优化。
不存在普适的烷基胺与缓冲酸组合可确保对所有ONs的最优分离，离子对效率高度依赖于ONs的长度与组成。强疏水性烷基胺在低浓度（通常5–10 mM）下对长链ONs分离效果更佳，但水溶性受限，此时常选用乙酸而非HFIP作为缓冲酸（后者多与弱IP试剂搭配）。最新研究显示，三丁胺/庚酸体系对PS ONs与常见杂质（包括PO副产物与n-1截短序列）的分离选择性最优，叔或季烷基胺可最小化非对映异构体分离，减少PS峰展宽，而疏水性烷基羧酸进一步增强了PS ONs与杂质间的选择性，即使在位置异构体存在下也可实现清晰分离，且在0.2%–5%杂质水平范围内定量性能可靠，但庚酸挥发性低于短链羧酸，可能增加源污染并抑制电离，降低灵敏度。
流动相pH是影响保留、选择与MS灵敏度的关键参数，可通过调节三乙胺（TEA，升高pH）与HFIP（降低pH）的浓度实现优化，pH 8–9通常是理想区间，可增强ONs电离，进而提升保留、分辨率与选择性；过低pH会因添加剂浓度升高导致非特异性吸附与离子抑制加剧，过高pH则会降低烷基胺电离度、引发聚集并缩短流动相使用寿命。C18柱是反相色谱中最常用的固定相，也是ONs分离的首选；除多孔硅胶基质颗粒外，聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂与表面多孔颗粒也表现出良好的分离性能。各类烷基与芳基固定相（包括C4、C8、C18与苯基配体键合硅胶）均已用于ONs的IP-RPLC分析，但专家指出，常规分析中固定相类型对选择性的影响较小，因为ONs保留主要由离子对相互作用主导（尤其对于疏水性较强的胺类）；仅在部分特定条件下（如PS非对映异构体的部分分离或制备级分离）才会出现微小差异。尽管C18因广泛应用与稳健性占据主导地位，但在优化离子对试剂类型、浓度、梯度与流动相条件的前提下，C4、C8与苯基相通常可提供相似的选择性。
非特异性吸附（NSA）是ONs液相色谱的主要局限，尤其在痕量LC-MS分析（进样量
100 pmol）中NSA影响相对较小。为解决这一问题，传统不锈钢柱已被多种生物惰性材料（如钛衬里、PEEK衬里与杂化有机/无机表面）替代。对比研究显示，ONs吸附主要发生在柱硬件内部（如柱壁与筛板），这些区域构成样品流路的主要金属氧化物表面；生物惰性材料可从首次进样起显著降低NSA，而不锈钢柱往往需要多次进样以饱和活性吸附位点，且不锈钢柱的 conditioning 效果短暂，易被常规操作（如高pH冲洗）逆转，限制了方法的长期适用性与转移可行性。柱温是ONs分离的另一关键参数，理想分离温度通常为60°C，对于易形成G-四链体的G富集序列，甚至需要80–90°C以破坏稳定二级结构；高温可使ONs线性化，提升分离效率，对于PS ONs还可抑制非对映异构体分离，获得更尖锐的峰形，同时降低背压、加快分析速度。柱温对siRNA双链分析尤为重要，直接影响柱内双链的解链行为：低于解链温度（Tm）的非变性条件可保持双链完整性，实现与游离单链ONs的分离；远高于Tm的变性条件则使双链完全解链，可用于评估链纯度；而接近Tm的温度会导致柱内部分解链，引起峰展宽、畸变与分辨率下降，应予以避免。
IP-RPLC-UV-MS平台已成为原料药与成品ONs（尤其是ASOs与siRNAs）身份确证、含量测定与杂质谱分析的核心技术。EMA人用药品委员会（CHMP）的公开评估报告凸显了该平台在上市前产品质量控制中的关键作用。尽管紫外检测仍是定量的标准方法，但IP-RPLC与MS的兼容性可实现精确质量测定与详细的MS/MS表征，尤其适用于色谱上无法与主峰分离的杂质的识别与定量，因此IP-RPLC/ESI-MS已成为ONs常规分析的标准方法。
随着PS ONs临床重要性的提升，非对映异构体分离成为研究热点。PS修饰增加了立体化学复杂性，反义ONs可产生数千种可能的异构体，监管机构已强调需采用先进分析工具评估非对映异构体分布与批间重现性，因其可能影响药效与安全性。早期方法开发聚焦于最小化非对映异构体对杂质分析的影响，近期研究则致力于直接分离与表征PS非对映异构体，明确Sp与Rp构型是决定ONs构象与色谱行为的关键因素。研究显示，IP-RPLC中PS非对映异构体的分离受核苷酸碱基组成影响，鸟苷提供的分辨率最高，尿苷最低；亲水性离子对体系可增强非对映异构体分离，而强疏水性离子对试剂则倾向于抑制分离。最新研究进一步证实，烷基胺与抗衡离子的选择对非对映异构体分辨率至关重要：疏水性烷基胺会降低非对映异构体分离，产生更窄的峰并改善n/n-x ONs混合物的分离；将乙酸根替换为HFIP会进一步抑制PS非对映异构体分离；柱温升高同样会抑制非对映异构体分辨率，但同时可改善n/n-x物种的分离。针对siRNAs的研究则发现，在IP-RPLC流动相中添加磷酸盐缓冲盐水（PBS）可提高双链稳定性，改善非对映异构体分离，且ONs结构对非对映异构体分辨率的影响规律与此前观察一致。
亲水相互作用色谱（HILIC）
HILIC已成为分离极性带电化合物（包括ONs）的有力技术。自1990年Alpert针对寡胸腺核苷酸（12–30碱基）的开创性研究以来，HILIC已发展为IP-RPLC的重要替代技术。与IP-RPLC不同，HILIC无需离子对试剂或HFIP添加剂，简化了流动相组成，降低了成本与毒性，提升了环境可持续性，也更适用于制备级HPLC的规模放大。HILIC的保留机制主要源于固定在极性固定相上的富水层与以乙腈为主的有机流动相之间的分配作用，水是强洗脱剂，因此在弱含水条件下（亲水分配占主导）保留最大化；此外，静电作用与氢键作用也对保留有贡献，尤其对于高带电荷的ONs。
对于ONs分析，流动相通常含30%–70%水，这会破坏水层，削弱亲水分配作用，使静电作用（常为排斥作用）与氢键成为保留的主要驱动力。保留行为受核苷酸碱基组成、骨架化学（PS vs PO）、糖修饰（如2′-OMe、2′-F）及流动相参数的影响。一般而言，ONs按链长增加的顺序洗脱，碱基亲水性顺序为A < T < G < C < U，这与IP-RPLC的洗脱顺序大致相反；糖修饰与PS修饰的ONs通常保留更低，且PS物种的峰宽常大于PO ONs，可能与非对映异构体的异质性有关。
HILIC分离ONs常用中性固定相，如酰胺与二醇基团，两性离子相也显示出良好的应用潜力。BEH酰胺柱应用广泛，其生物惰性变体PREMIER BEH酰胺柱可通过最小化非特异性吸附（NSA）提升分析性能。研究明确柱硬件（尤其是柱壁与筛板）是NSA的主要来源，且HILIC模式下NSA比IP-RPLC更显著，尤其对于长链ONs（40–100碱基）。
与IP-RPLC不同，柱温对HILIC保留的影响极小，典型操作温度为40–60°C，仅观察到保留随温度升高略有增加。对于siRNAs，温度仍是调控双链稳定性与分离选择性的关键：低于Tm时双链稳定，呈单一尖峰；接近Tm时部分解离，出现宽而早洗脱的区带；高于Tm时双链完全解链，出现两个 distinct 峰，表明可通过温度策略切换HILIC的非变性与变性条件，直接调控保留行为与分离结果。
HILIC-MS兼容的流动相多为无离子对的缓冲盐体系，如乙酸铵或甲酸铵，盐浓度升高可通过稳定水层增强亲水分配，并减少ONs与硅羟基间的静电排斥，从而提升保留，但为维持MS灵敏度，通常采用中等浓度（5–25 mM）。流动相pH通过改变残留硅羟基与ONs磷酸基团的电离状态影响保留：低pH（~3.5）有利于吸附，高pH（5.5–7.5）则增加负电荷，增强静电排斥，降低保留。乙腈是首选有机改性剂，甲醇等质子性溶剂可能竞争氢键位点并破坏水层，应用较少但可提供独特选择性，相关研究尚不充分。
ESI-MS是ONs鉴定与杂质检测的金标准，ONs因磷酸基团去质子化产生多电荷负离子。HILIC的无离子对、高有机相流动相可减少LC与源污染，并增强负离子ESI效率，但尽管早期预期乐观，HILIC的灵敏度通常低于烷基胺/HFIP体系的IP-RPLC（低1–2个数量级），不过其能更好地保持ONs结构完整性，电荷态分布比IP-RPLC更窄。系统评估显示，HILIC-MS灵敏度较低的原因可能包括碱金属加合物增加、乙腈引起的离子抑制以及低pH下电喷雾去溶剂化效果不佳；而采用中等浓度乙酸铵并在较高pH下操作可改善HILIC-MS/MS信号，实现精确质量测定。值得注意的是，部分研究显示HILIC-MS在某些情况下可获得更陡的响应曲线与更优的定量限，凸显了其作为互补MS兼容分离技术的潜力。
HILIC与AEX、IP-RPLC具有正交选择性，是ONs全面分析的重要补充。研究显示，HILIC可改善含G、C截短产物的分离，并逆转PO杂质的洗脱顺序（在IP-RPLC中PO杂质常与截短物种共洗脱，而HILIC中PO杂质在主峰之后洗脱），这种基于表观亲水性的分离模式可有效区分截短杂质与PO杂质。为利用色谱模式的正交性，最新开发的二维LC-HRMS策略将第一维AEX或IP-RP LC与第二维HILIC耦合，第二维HILIC同时起到有效的在线脱盐作用，通过优化样品环体积与柱尺寸，实现了0.3%水平杂质的检测，其中IP-RPLC在第一维的分辨率优于AEX，而第二维HILIC可进一步分离包括PO与二硫代磷酸酯在内的额外杂质，且该二维LC装置无需溶剂调制或专用仪器即可实现AEX/IP-RP与HILIC的直接耦合。
与IP-RP HPLC类似，HILIC也会因PS非对映异构体的部分分离导致峰展宽，不利于PS ONs分析，需采取策略抑制非对映异构体分离。研究显示，优化流动相pH、盐浓度与柱温（中性至弱碱性pH、40°C）可减少非对映异构体分离，但PS非对映异构体的峰宽仍比PO类似物宽约25%，表明抑制作用不完全。反之，特定条件下HILIC可增强非对映异构体分辨率，尤其对于含刚性核糖修饰（如2′-甲氧基、2′-氟或锁核酸）的ONs，其分离效率取决于ONs长度、化学修饰类型与位置及PS连接点的位置。最新研究进一步揭示，高阶RNA结构是HILIC中siRNA非对映异构体分离的关键决定因素，通过结合折叠预测、熔解曲线与质谱分析，建立了siRNA构象与非对映异构体分离的直接关联，为调控非对映异构体分离提供了可靠策略，可用于全长度PS siRNAs的批间监测。
HILIC在偶联ONs分析中也有良好应用，例如对含C16脂质偶联的全PS骨架16-mer MOE gapmer ASO的分析，在75°C、25 mM乙酸铵条件下可有效抑制非对映异构体峰分裂，成功分离两个同量异位体与一种未鉴定杂质，展现了HILIC区分脂质偶联ONs亲水性相关杂质的能力。
HILIC分析ONs中样品稀释剂的选择是一大挑战：IP-RPLC中常用的水作为稀释剂在HILIC中是强洗脱剂，会损害保留并导致峰畸变与效率下降；采用70%–80%乙腈溶解样品可改善色谱性能，但受限于ONs的溶解度；减少进样体积允许 aqueous 样品进样但牺牲灵敏度；性能优化进样序列（POISe）等策略通过共注射确定体积的弱溶剂可改善上样过程中的保留，但尚未在ONs HILIC分析中广泛应用。值得注意的是，尽管样品稀释剂对色谱性能影响显著，但现有ONs HILIC研究中很少对其进行系统考察。
尽管HILIC具有与IP-RPLC互补的优势，但其广泛应用仍受限制：选择性通常低于IP-RPLC，尤其对于长度超过~35 nt的ONs；HILIC-MS灵敏度比优化的烷基胺/HFIP IP-RPLC方法低1–2个数量级，且低 analyte 浓度下钠/钾加合物形成更显著，增加数据解析难度；此外，HILIC保留机制复杂（涉及吸附、分配与离子作用的组合），尚未完全阐明，导致方法开发可预测性差、耗时更长，这些问题亟待解决以充分释放HILIC在治疗性ONs常规分析中的潜力。
多维液相色谱
不同HPLC模式在ONs分析中的互补性已被广泛研究。以含PS与核糖修饰（2′F、2′OMe）的23-mer合成ONs为模型，评估IP-RP、HILIC与AEX三种模式对9种常见杂质的正交性，保留时间比较显示HILIC与AEX或IP-RP耦合的正交性最高，反映了HILIC条件下亲水核苷酸碱基的独特保留行为；IP-RP整体分辨率最优，而HILIC与AEX存在更多共洗脱现象。模式间决定系数（R2）范围为0.54–0.84（IP-RP vs HILIC：0.64；IP-RP vs AEX：0.84；AEX vs HILIC：0.54），表明正交性程度存在差异。HILIC与IP-RPLC的互补性进一步体现在：修饰核苷酸的n/n-1分离受相邻碱基疏水性影响显著——n位丢失亲水核苷酸且n-1位为疏水核苷酸时，IP-RPLC分辨率降低而HILIC分离改善；反之，n位丢失疏水核苷酸且n-1位为亲水核苷酸时则呈现相反趋势，该效应幅度取决于相关核苷酸的疏水性差异。此外，PO杂质在HILIC中晚于PS ONs洗脱，而在IP-RPLC中洗脱顺序相反。
为利用正交性提升峰容量，多项研究构建了ONs分析的二维LC（2D-LC）方法。早期研究开发了针对二至十聚ONs的全面二维方法，第一维为HILIC，第二维为IP-RPLC，采用C18捕集柱与水相补充流实现维间ONs有效 immobilization，利用27种ONs标准品实现了500的高峰容量，并通过负离子模式ESI-MS实现清晰的ONs鉴定。后续研究将该策略拓展至ASO杂质谱分析，开发了通用的多中心切割2D-LC方法，第一维为AEX或IP-RPLC，第二维为MS兼容的HILIC（25 mM乙酸铵），耦合HRMS，实现了0.3%水平杂质的检测，其中第一维采用IP-RPLC时分辨率最高；通过优化样品环体积与柱尺寸，无需溶剂调制即可实现无缝耦合，且第二维HILIC可对第一维洗脱物进行在线脱盐，避免TEA/HFIP对MS源的污染。
尽管二维LC在ONs分析中取得了成功验证，但仍存在固有局限：IP-RPLC、HILIC与AEX模式间的正交性仅为中等，因为三种技术的保留均主要受ONs长度而非其他理化性质主导；即使有限的正交性也可提升峰容量，但这也凸显了ONs作为2D LC分析对象的特殊性。此外，在线2D LC装置技术复杂，多数方法仍以离线方式运行，限制了其常规应用。
质谱
质谱是治疗性ONs及其杂质结构表征的核心工具，但ONs的MS检测面临多项挑战，可能影响灵敏度、谱图清晰度与数据解析。ONs通常产生复杂的MS谱图，表现为宽的电荷态分布与广泛的加合物形成，且信噪比低，在分析低丰度杂质时尤为突出，单四极杆仪器的灵敏度与分辨率不足，需足够样品量与采集参数的精细优化以确保分析可靠性。宽m/z采集窗口虽适用于完整质量确证，但会稀释信号强度至多个电荷态，降低灵敏度，因此杂质定量通常采用窄m/z窗口，靶向单一丰度电荷态进行提取离子色谱（EICs）分析，配合较高样品量（≈20–50 pmol）；实践中，宽m/z范围的完整质量去卷积用于组分鉴定，而靶向EIC策略则用于高灵敏度杂质检测与定量。
加合物形成进一步增加了谱图解译与去卷积的难度。碱金属加合物（Na+、K+、NH4+）在HILIC-MS中尤为普遍，而IP-RPLC-MS谱图中常见三乙胺（TEA+）与HFIP相关加合物。加合程度受溶剂纯度、玻璃器皿污染、LC系统记忆效应与离子源条件显著影响。缓解策略包括：严格的系统清洁（如甲磺酸冲洗）、使用高纯度溶剂与玻璃器皿、精细控制源参数；提高源内活化（如升高气体流速或温度）也可部分去除TEA/HFIP加合物。但过于苛刻的源条件可能诱导源内裂解（如碱基丢失）或氧化，产生难以与工艺或降解相关杂质区分的伪峰，干扰杂质谱分析，因此需在加合物抑制与 analyte 完整性间取得平衡，典型起始条件包括离子传输管温度~320°C、汽化器气体温度~350°C、源CID能量~10 eV，再根据实际需求优化。
已验证的工作流程通常结合完整质量去卷积进行鉴定与EIC-based杂质定量。为简化这一过程，多家HPLC-MS供应商开发了自动化数据处理解决方案，可执行FLP及其杂质的完整质量去卷积，并生成标准化的EIC-based定量报告，提供所有检出物种的相对丰度信息。
串联质谱（MS/MS）在ONs结构解析中发挥核心作用，可实现序列确证、杂质鉴定与降解途径研究。裂解通常由碰撞诱导解离（CID）或高能碰撞解离（HCD）诱导，产生具有信息量的骨架碎片。但裂解行为高度依赖于前体电荷态、序列长度、化学修饰与施加的碰撞能量，因此MS/MS谱图常存在序列覆盖率不全、中性丢失占主导或裂解路径偏好等问题，需靶向选择前体、控制电荷态并精细优化碰撞能量以获得可重复且具有结构意义的谱图。尽管功能强大，ONs的MS/MS分析仍具挑战：谱图常被多电荷态、金属加合物与修饰依赖性裂解模式干扰，阻碍自动化数据解析；且多数商用软件工具未完全适配治疗性ONs的化学多样性，常需对碎片归属进行大量人工验证，尤其对于PS/PO嵌合体、LNA与PMO类化学结构或偶联构建体。这些局限凸显了优化MS/MS采集策略与开发专用生物信息学工具的必要性。
离子淌度质谱（IMS）日益成为ONs表征的有力且新兴的分析工具，通过在气相中基于离子尺寸、形状与电荷进行分离，增加了补充常规LC-MS策略的结构维度，可区分仅靠m/z无法区分的构象异构体、位置异构体或序列变异体。最新研究显示，将IMS集成至在线LC-IMS-CID-MS工作流程中，可在单次进样中实现多电荷态的同时分离，促进电荷态特异性裂解，显著提升测序信息含量与分析通量。尽管如此，IMS仍存在局限：对于较长或化学修饰的ONs序列覆盖率不全，且需针对 analyte 优化碰撞能量与高级数据处理流程。早期研究证实，IMS衍生的碰撞截面（CCS）测量可提供有价值的、与序列无关的结构信息，区分磷酸二酯与PS骨架，并支持ONs长度与构象异质性的评估；近期研究则表明，尽管完整siRNA链段的离子淌度差异有限，但基于碎片的IMS-MS/MS方法可实现气相分辨率与PTO非对映异构体的定量分析。这些研究共同表明，IMS（尤其与气相裂解结合时）为解析常规LC-MS难以应对的PTO非对映异构体提供了独特且有力的补充手段。
尽管优势显著，IMS仍面临成本高、技术复杂、普及度低的挑战。完全集成的LC-IMS-MS平台需要先进仪器、专业技能与复杂数据分析，限制了其在受控环境（尤其是常规应用）中的推广。IMS分离对离子电荷态与实验条件高度敏感，且常依赖间接策略（如气相裂解）而非直接分离完整物种；此外，漂移时间重现性、校准策略与标准化数据处理流程在药物QC应用中仍处于发展阶段。尽管如此，现有研究已证明IMS可为ONs分析提供显著的分析优势，尤其对于复杂、修饰与立体化学异质性系统，未来应用潜力巨大。
生物分析用于PK/PD研究
ONs的生物分析技术快速发展，以满足临床前与临床药代动力学/药效学（PK/PD）研究的需求。LC-MS因兼具定量灵敏度与结构选择性，尤其擅长区分全长度ONs与结构相似的核酸酶代谢物，已成为主导分析平台。IP-RPLC-MS是最成熟的方法，可实现亚ng/mL水平的检测灵敏度，并在母体ONs与截短代谢物间提供有所改善但仍具挑战性的选择性。色谱分辨率仍是主要瓶颈，尤其对于结构高度相关或同量异位代谢物，且最优离子对试剂的选择仍主要依赖经验性试错法。
因此，无离子对替代技术如HILIC-MS受到越来越多的关注。采用酰胺固定相与铵盐流动相的HILIC方法在ONs生物分析中展现出良好性能，但目前受限于相对较低的色谱分辨率，亟需开发专为ONs分离设计的HILIC吸附剂。样品前处理是复杂生物基质中 assay 性能的关键决定因素，无离子对提取策略（包括固相萃取与杂交法）正被越来越多地探索，以减少离子抑制并提升MS兼容性，但这些策略仍需在吸附剂化学与提取机制方面进行优化，回收率不足与重现性差仍限制其广泛应用。
总体而言，当前治疗性ONs生物分析的局限主要源于色谱分辨率不足与提取性能欠佳，尤其对于低丰度代谢物。在此背景下，高分辨质谱相比单位分辨仪器具有显著优势，可提升选择性、减少交叉离子干扰并实现回顾性代谢物鉴定。色谱材料的持续进步与高分辨定量MS的发展有望进一步强化治疗性ONs的PK/PD与生物分布研究。
