在低磁场下利用SABRE超极化技术进行无标记配体相互作用测量

《Analytical Chemistry》：Label-Free Measurement of Ligand Interactions Using SABRE Hyperpolarization at Low Magnetic Fields

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蛋白质-配体结合亲和力是通过在0.85 mT的低场核磁共振（NMR）光谱技术来评估的。通过基于仲氢的信号放大技术（SABRE）对1H核进行超极化，从而获得强信号。通过追踪普遍存在的氢信号来监测这种相互作用。尽管进行了超极化处理，但在低场条件下无标记检测的一个关键挑战是在没有化学位移的情况下区分信号。在对配体和溶剂进行氘代处理后，测量1H信号，并在数值上考虑在超极化过程中产生的正氢信号。自旋-自旋（R2）松弛率用于量化蛋白质-配体相互作用。由于在毫特斯拉磁场中的R2不包含交换贡献，因此与传统的强场NMR相比，计算配体解离常数KD的过程更为简化。这种监测1H信号的技术可以推广到检测任何与蛋白质竞争结合的配体，从而扩展了低场NMR在高通量筛选和涉及配体相互作用的生化过程研究中的应用。

1. 引言
蛋白质和配体之间的相互作用对于信号转导、基因调控以及许多其他生物功能至关重要。(1,2) 测量这些相互作用对于药物发现和基础研究生物调控机制及相关过程是必要的。核磁共振（NMR）光谱技术通过能够观察到在溶液环境中结合时发生变化的配体特异性信号而具有独特的优势。可观测的参数包括化学位移、各种核自旋状态的松弛率、自扩散系数等。(3,4) 传统上，生物分子NMR是在高达20 T或更高的磁场下进行的，这样可以测量出适合确定大分子结构的高分辨率光谱。与配体相互作用相关的问题相对简单，在某些情况下只需判断配体是否与蛋白质结合；而在其他情况下，则需要测量结合亲和力。尽管这些测量不再需要高分辨率，但配体相互作用仍然最常用的是那些为结构研究优化的强场NMR仪器来进行研究。即使在工业环境中，用于药物发现的小分子化合物的筛选也是如此。(5,6) 最近的核自旋超极化技术的发展使得无需高磁场即可测量来自生物小分子的强NMR信号。通常通过在高磁场中平衡自旋系统来实现的自旋极化，现在被在NMR实验之前产生的强超极化所取代。使用低场磁体进行生物分子样品的NMR光谱分析可以降低成本并简化实验过程。此外，低场NMR在简化R2自旋松弛率的解释方面也有显著优势，因为在没有化学位移的情况下，松弛过程中没有交换贡献。(7) 已有多种技术实现了液态NMR中生物分子的超极化，主要包括溶解动态核极化（D-DNP）、(8) 化学诱导动态核极化（CIDNP）和仲氢诱导极化（PHIP）。(10,11) D-DNP可以通过基于微波的泵浦机制从电子自旋极化开始，对13C、1H、19F或31P等多种核自旋进行超极化。大多数生物小分子都与D-DNP兼容，这使其成为一种通用的超极化技术。由于DNP极化器本身需要超导磁体，因此它最自然地与强场NMR结合使用。其他超极化方法则不受此限制。CIDNP提供了一种敏感的方法来研究可以与光敏剂发生光化学反应的配体。(12) 由于CIDNP只需向NMR光谱仪添加光源，因此可以低成本地产生极化。PHIP也具有类似的优势。仲氢（分子氢的反平行核自旋态）可以通过低温冷却氢气来产生，其平行自旋态可以长时间保持稳定，并可以通过加氢或非加氢化学过程转化为超极化状态。信号放大技术（SABRE）可以使与铱中心结合的配体极化，形成极化转移复合物，而不改变配体的化学性质。(13?17) SABRE需要含有电子密度的基团（如吡啶）与金属结合，(13?17) 而类似复合物中的氢化物信号可用于间接检测生物分子的存在。(18) 当将其与蛋白质溶液混合在强场NMR光谱仪中时，可以通过R2松弛的变化来识别SABRE超极化配体的结合。(19,20) 由于SABRE极化发生在毫特斯拉范围内，因此它与同一磁场的NMR光谱分析非常兼容。使用SABRE的低场NMR可以在单次扫描中检测不同类型核（如1H、13C、15N和19F）的信号。(21?24) 我们的团队之前已经证明，通过监测氟信号可以量化蛋白质和配体之间的相互作用。(7,25?27) 在这里，我们使用SABRE超极化1H（生物分子中丰富的核）来测量无标记配体的结合情况。我们展示了低场NMR在简化结合亲和力计算方面的优势，因为R2松弛过程中没有交换贡献。基于此，我们使用SABRE超极化的报告配体来演示结合亲和力的测量。

2. 实验部分
2.1. 样品制备
所有在低场和高场磁体中进行的实验样品都包含作为催化剂的氯(1,5-环辛二烯)[4,5-二甲基-1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)咪唑-2-亚烯]铱(I)（C）（Strem，Newburyport，MA）、作为报告配体的3-氨基吡啶盐酸盐（L）（Advanced Chemical Intermediates，Davidstow，Cornwall，英国）以及作为共配体的氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）（CoL）（Cambridge Isotope Laboratories，Andover，MA），它们在氘代甲醇（d4-甲醇）中的浓度比为1:10:10。胰蛋白酶溶液是新鲜制备的，方法是将40 ± 2 μM的牛胰蛋白酶（Alfa Aesar，Ward Hill，MA）溶解在pH 7.2的50 mM磷酸盐缓冲液（NaH2PO4和NaH2PO4）中。胰蛋白酶的浓度通过紫外分光光度法确定（ε280 = 35.1 cm–1 mM–1）。(19) 在竞争性实验中，向蛋白质溶液中加入17.28 ± 0.864 mM的苯胺或苄胺。对于催化剂-配体结合实验，L和CoL的浓度保持在10.00 ± 0.50 mM，催化剂浓度分别为1.00 ± 0.05、5.00 ± 0.25或10.00 ± 0.50 mM。对于蛋白质结合实验，将1.25 mL的胰蛋白酶溶液与0.25 mL的超极化样品混合，将超极化样品稀释6倍，并将注入溶液的浓度降至初始值的5/6。胰蛋白酶和苯胺或苄胺竞争配体的初始浓度分别为1.00 ± 0.05 mM C、10.00 ± 0.50 mM L和10.00 ± 0.50 mM CoL，最终浓度分别为0.167 ± 0.083 mM C、1.67 ± 0.83 mM L和1.67 ± 0.83 mM CoL。胰蛋白酶和苯胺或苄胺竞争配体的最终浓度分别为33.33 ± 1.67 μM和14.40 ± 0.72 mM。

2.2. NMR光谱
低场NMR光谱仪的配置如前所述。(25) 简而言之，电磁体提供0.85 mT的磁场，导致1H拉莫频率为35,240 Hz。图S1a展示了实验装置。NMR管放置在RF线圈、SABRE场线圈和脉冲线圈内，这些线圈都包裹在铝屏蔽层中。磁场由屏蔽层外的四线圈产生。使用注射泵将蛋白质样品与超极化样品混合。在测试实验中，通过有色溶液验证了混合效果。松弛实验分为两组：第一组是催化剂-配体结合实验；第二组是通过注射泵将蛋白质快速注入超极化样品中以测量蛋白质结合。仲氢在29 K下使用闭循环制冷器（Advanced Research Systems，Macungie，PA）进行富集。催化剂在298 K下用仲氢活化5分钟。样品在10 mm NMR管中加压至120 psi。在实验过程中，仲氢以0.2 slpm的流速在样品中 bubbling 20–30秒（图S1b）。在此期间，磁场使用SABRE场线圈逐步升高至5 mT。在关闭SABRE场之前0.2秒停止 bubbling。蛋白质以114 mL/min的流速注入。预扫描延迟t3 = 0.4秒以促进混合。随后应用p90–τ [2·p90–2·τ]×n的脉冲序列来测量R2松弛。延迟τ为50 ms，脉冲长度p90 = 0.35 ms，回波次数n = 100。90°脉冲的相位为x，180°脉冲的相位为y（图S1b）。为了计算[CL]/[L]比率，在400 MHz NMR光谱仪（Bruker Biospin，Billerica，MA）中使用5 mm三共振（TXI）探头测量1H NMR光谱。

2.3. 数据分析
每个自旋回波都进行了傅里叶变换，并对其峰值进行了积分（图S2）。通过拟合指数曲线来确定R2,obs。每种情况下的松弛数据都使用相应的模型通过最小化残差平方和在Python中进行了拟合。在解离常数测量中，对浓度施加了不超过其初始值的限制。使用蒙特卡洛分析来确定拟合参数的平均值和置信区间。由于得到的分布通常是非对称的，因此置信区间的下限和上限被计算为包含90%值的狭窄区域。

3. 结果与讨论
图1显示了SABRE超极化配体3-氨基吡啶的质子NMR光谱。在9.4 T的传统强场磁体和0.82 mT的电磁体中都观察到了强信号。在这两种情况下，自旋极化都由SABRE过程控制，与测量磁场无关。在高场中，观察到四个芳香质子的信号（图1a）。与非超极化光谱相比，信号增强了多达461倍。此外，还观察到了由SABRE过程产生的正氢信号。虽然由于使用了氘代，溶剂信号大部分被抑制，但仍会出现。相比之下，在0.82 mT下，只观察到一个1H信号（图1b）。在这种磁场范围内，化学位移差异远小于线宽，无法分辨。此外，同核耦合常数处于强耦合范围，因此只产生一个峰。

图1
(a) 在9.4 T磁场（400 MHz拉莫频率）下测量的3-氨基吡啶的1H超极化NMR光谱（橙线）与8倍放大的非超极化光谱（黑线）。(b) 在0.82 mT（35.2 kHz频率）下测量的同一样品的超极化光谱，显示HB、HA、HD和HC的信号分别增强了461、398、381和91倍。在这两种情况下，样品中含有1.000 ± 0.050 mM的氯(1,5-环辛二烯)[4,5-二甲基-1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)咪唑-2-亚烯]铱(I)作为催化剂（C）、10.00 ± 0.50 mM的3-氨基吡啶盐酸盐作为配体（L）以及10.00 ± 0.50 mM的DMSO-d6作为共配体（CoL），溶剂为d4-甲醇。样品体积在(a)中为0.5 mL，在(b)中为0.25 mL。

接下来，这个单一的1H NMR信号将用于确定配体与与超极化样品混合的目标蛋白质之间的相互作用。通过一系列自旋回波的指数衰减来量化这种相互作用，每个回波都分别进行了傅里叶变换（图2）。由于没有用其他能提供独特信号的核对目标分子进行标记，因此检测该分子存在挑战，因为无法区分存在的各种化学物种的1H信号。因此，观察到一个明显非指数时间依赖性，这不允许确定R2值（图2a）。这种信号过程预计是由多个同时发生的自旋极化过程引起的。首先，SABRE使配体、共配体二甲基砜以及可能的甲醇溶剂的质子极化。然后，交叉弛豫在存在的物种之间重新分配极化。（28）此外，SABRE过程将仲氢转化为可观测的正氢。在图2b中，通过用氘代溶剂和共配体来减轻非指数行为，以防止除配体以外的其他分子对质子信号的贡献。由此产生的平滑指数衰减曲线允许确定表征衰减的R2参数。如文末所述，正氢仍然对这个信号有贡献。

图2
(a) 1.000 ± 0.050 mM C、10.00 ± 0.50 mM L和10.00 ± 0.50 mM DMSO（作为甲醇中的共配体）的频域信号。
(b) 含有C、L和10.00 ± 0.50 mM DMSO-d6（作为共配体CoL）的d4-甲醇样品的频域信号。

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R2速率在以下讨论中用于确定蛋白质-配体相互作用。首先，确定催化剂和蛋白质结合对配体R2弛豫速率的影响。随后，使用超极化配体作为报告分子来确定其他配体的KD。

3.1 配体-催化剂结合
配体与极化转移催化剂的结合可以用以下方程描述：
C + L ? K_eq CL
C + L ? Keq CL
(1)
这个平衡改变了最终可以与蛋白质相互作用的自由配体的浓度。通过滴定催化剂浓度来确定自由配体和催化剂结合配体的弛豫速率R2,f和R2,CL（图3和S3）。值得注意的是，与催化剂相互作用的配体的观察到的R2速率在0.3–1 s–1范围内，低于在高场条件下的预期值。例如，在9.4 T下，对于类似的配体4-氨基吡啶，在1.27 mM铱复合物的存在下，之前观察到的R2为2.40 s–1。（19）低场下的R2不受其他潜在主导的交换线展宽的影响。（7）相反，它反映了具有更长旋转相关时间（τc）的结合形式的性质。

图3
图3. 催化剂-配体混合物的R2弛豫速率。[Ltot]和[CoL]固定在10.00 ± 0.50 mM。数据点是测量的R2,obs（图S3）。文中描述的数值拟合得到R2,f = 0.231 (0.17–0.28) s–1，R2,CL = 2.92 (1.93–3.85) s–1，以及Keq = 0.050 (0.028–0.079) mM–1。这些值显示为平均值和来自蒙特卡洛分析的90%置信区间。黑色曲线是根据这些值反算得出的。

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观察到的弛豫速率通过以下方程数值拟合：
R2,obs = [CL][Ltot] / (R2,CL + [L][Ltot])
(2)
同时使用方程S1–S3。这些方程假设只有一个配体与催化剂结合，其他配位位点被用作共配体的氘代二甲基砜占据。（29,30）计算还需要知道催化剂结合配体与配体浓度的比率([CL]/[L])，这是使用高场NMR确定的（表S1和图S4）。

3.2 配体-蛋白质结合
在超极化过程后将蛋白质注入催化剂和配体的溶液中，由于蛋白质结合平衡，会导致额外的弛豫变化：
P + L ? K_D PL
(3)
其中KD为解离常数。如果在没有蛋白质的情况下将配体溶液与磷酸盐缓冲液混合，比较图S3a–c和图4的第一个条形图中的速率，只会发现观察到的弛豫有微小差异。在蛋白质胰蛋白酶存在的情况下（图4的第二个条形图），R2,obs显著增加，这表明发生了结合相互作用。R2,obs的增加是由于蛋白质结合配体的弛豫速率R2,PL，即使[PL]/[Ltot]的比例只有几个百分点，R2,PL也可能占主导地位。
R2,obs = [PL][Ltot] / (R2,PL + [CL][Ltot])
(4)

图4
图4. 蛋白质结合实验的观察到的R2弛豫速率，其中蛋白质胰蛋白酶和竞争配体与含有1.000 ± 0.050 mM C、10.00 ± 0.50 mM L和10.00 ± 0.50 mM CoL的样品混合，得到最终浓度0.1667 ± 0.0080 mM C、1.667 ± 0.080 mM L和1.667 ± 0.080 mM CoL。弛豫数据显示在图S5和S6中。误差条是三次测量的标准偏差（黑色）和传播的拟合误差（灰色）；仅在较大时显示。

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添加蛋白质后的弛豫变化远大于催化剂相互作用的贡献R2,CL，因此可以直接观察到蛋白质结合。相比之下，高场NMR需要在揭示蛋白质相互作用之前使用封端配体来使催化剂失活。（19）弛豫变化证明了配体与蛋白质结合，但本身并不提供定量的结合亲和力。

3.3 竞争性配体-蛋白质结合
可以通过使用报告配体（L）进行竞争实验来测量配体结合亲和力。（27）一种可以被仲氢超极化的报告配体会被感兴趣的竞争配体（S）从蛋白质的结合位点置换：
P + S ? K_D,2 PS
(5)
方程5中的平衡是方程3之外的平衡。通过知道报告配体的KD，可以确定竞争配体的KD,2值，或者反之亦然。（20,25）这里，打算使用3-氨基吡啶作为报告配体，因为其含氮芳香环使其容易被SABRE超极化。两种竞争配体是苯甲胺和苄胺。在这两种情况下，观察到报告配体的弛豫速率较慢（图4的第三和第四个条形图）。从弛豫差异可以看出，苯甲胺是比苄胺更强的竞争配体。

由于之前不知道报告配体的KD，首先使用常规NMR（50 mM Tris、100 mM NaCl和5 mM CaCl2，pH 8.0）确定的苯甲胺的亲和力来测定它。（27）图4的第二个和第三个条形图中显示了3-氨基吡啶（L）与胰蛋白酶以及L与胰蛋白酶和苯甲胺（S）的观察到的弛豫速率。使用方程3–5以及结合平衡（方程S2–S8）和R2,f、R2,CL和Keq（图3）进行拟合。结果，报告配体和胰蛋白酶的解离常数确定为KD = 141.1 (138.9–143.1) μM。这个值接近于类似配体5-氟吡啶-3-羧酰胺（FCPA）的KD，其报道的KD范围为179 ± 12 μM。（25）

最后，我们展示了使用与报告配体的竞争实验来测量苄胺的解离常数KD,2。使用与苯甲胺竞争的报告配体（L）的弛豫测量（图4的第四个条形图）以及上述确定的KD。因此，苄胺的解离常数确定为KD,2 = 170 (140–154) μM（方程4和5，S2–S8）。置信区间外的平均值是由于蒙特卡洛计算中的一些异常输出值。KD,2值的计算展示了在低场弛豫测量报告配体以筛选其他配体与蛋白质相互作用的有用性。

使用DNP超极化和常规NMR（50 mM Tris、100 mM NaCl和5 mM CaCl2，pH 8.0）（27）确定的苄胺的KD为238 ± 36 μM；（27,31）以及使用高场NMR竞争实验（45 mM磷酸盐、10% MeOH，pH 7.6）（20）确定的KD为200 ± 80 μM（20）。在这里（42 mM磷酸盐、16% MeOH，pH 7.2），测量到的值略低，为170 (140–154) μM。较高的亲和力可能是由于溶液中甲醇浓度增加的趋势，尽管差异接近不确定性范围。

3.4 正氢的信号
虽然样品组分的氘代消除了这些化合物的信号，但H2气体的质子可能是可观测的。在高场NMR仪器中观察到的样品超极化表明，配体和H2同时极化，导致信号符号相反（图1a）。氢信号来源于SABRE过程的副产品——仲氢转化为正氢。因此，正氢对测量的弛豫数据有贡献。在高场下，正氢的自旋-自旋弛豫速率确定为R2 = 0.961 ± 0.022 s–1（表S8）。在假设其弛豫速率和相对信号幅度与高场相同的情况下，估计了正氢信号对低场确定的结合亲和力的贡献。正氢的信号贡献是图1a中配体信号的4倍。为了估计低场下的效应，将由于正氢产生的模拟积分加到测量数据中，以估计配体的净信号（图S7）。使用这些模拟信号，得到配体（L）与胰蛋白酶的KD为141.2 (138.6–142.7) μM，苄胺与胰蛋白酶的KD为171 (140–154) μM（表S7）。报告配体与胰蛋白酶的KD变化在未考虑正氢信号的情况下确定的范围内。KD的最小变化表明，o-H2对多个测量弛豫率的影响导致模型浓度中的误差部分抵消。

4. 讨论
通过使用SABRE超极化在低场磁体中测量弛豫来解释蛋白质和配体之间的结合相互作用。低场NMR光谱缺乏化学位移分辨率，但与常规高场NMR甚至台式NMR相比，这种测量可以以更低的成本进行。SABRE产生的基底极化比高场NMR中的玻尔兹曼极化高几百倍，从而在亚毫摩尔浓度范围内产生可观测的信号。在配体浓度为1.67 ± 0.83 mM的稀释实验中，信噪比为16.0 ± 3.5；因此，使用所描述的仪器和超极化水平，超极化配体可以检测到300 μM的浓度，而无需进一步优化（表S9）。这个浓度略高于之前使用氟超极化获得的100 μM。（25）实验中的蛋白质浓度为33.33 ± 1.67 μM。对于更低配体浓度的结合实验，这个浓度也可以进一步降低。

通过检测未标记配体的1H信号来实现测量。低场NMR不受样品中未超极化组分的干扰；然而，其他超极化的质子可能会对观察到的信号有所贡献。使用氘代来去除其他可能超极化的分子的信号，这些分子的信号会与质子信号重叠。在SABRE过程中出现的H2信号仍然会增加配体信号，但可以估计并扣除它，以改进对应于超极化配体的弛豫计算。

SABRE在甲醇中进行，其中含有4,5-二甲基-1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)咪唑-2-亚基配体的催化剂产生了最佳极化。在用蛋白质样品稀释后，溶液中存在的16.67%的d4-甲醇可能会影响蛋白质的稳定性，从而干扰蛋白质-配体相互作用。使用活性测定法研究了溶剂对胰蛋白酶的影响，监测N-苯甲酰精氨酸乙酯（BAEE）的转化。反应在两种不同条件下进行——一种在水性缓冲液中，另一种与实验中相同的d4-甲醇浓度（图S9）。在两种情况下都观察到了与酶动力学预期的零级速率定律非常匹配的结果。在含甲醇的条件下，反应稍微提前了一些，但在SABRE实验的时间（10.2秒）内没有观察到显著差异。因此，预计蛋白质在实验过程中处于天然构象。先前的一项研究将pH值为8.0的Tris缓冲液与不同浓度的甲醇混合，得出了相同的结论。(19) 可能不同的蛋白质会受到甲醇影响的程度不同。还可以对溶液条件进行其他优化。例如，某些SABRE催化剂可以直接用于水溶液中。通过使用反胶束组成的两相介质，可以进一步克服氢气的低溶解度和其他效率限制。(32) 同样，还需要考虑配体对极化转移催化剂与蛋白质结合的影响。在这里，配体不太可能与胰蛋白酶发生强烈结合，因为胰蛋白酶是一种不含酰胺基团的小分子，并且其浓度低于配体。所描述的实验方法利用了低场NMR仪器中的原位超极化技术，其中超极化的配体保持静止状态，而蛋白质被注入其中。混合是通过足够快速的注入引起的湍流来实现的。观察到的R2弛豫衰减数据被拟合为单指数曲线，这符合没有浓度梯度的均匀混合溶液的预期。在几乎所有情况下，R2拟合参数的误差范围都小于由于其他实验误差导致的标准偏差，表明每条曲线与指数模型非常吻合。用于R2测量的NMR脉冲序列不包含脉冲场梯度，因此不会受到NMR管内湍流混合引起的残余运动的影响。尽管如此，实验的技术改进可以包括使用流动池。(33) 流动池可以与高通量分析兼容，用于筛选配体结合，可能每小时可以进行数百次实验。从实验角度来看，使用流动池还需要在混合装置中外部混合蛋白质和配体溶液，这可以分别进行优化。(19,25) 对于这一应用的其他改进可以包括开发异相催化剂系统，(34) 这最终可能允许在不消耗催化剂的情况下实现配体的流动极化。在SABRE实验中，由于信号是在高场下测量的，催化剂结合会显著影响弛豫速率。而在低场下，这种交换效应不存在。因此，在实验前无需使催化剂失活。此外，在低场下，由于蛋白质注入引起的样品不均匀性（如起泡）不会影响信号。利用1H检测报告配体来确定蛋白质和配体的结合，扩展了低场NMR在药物发现中的配体筛选应用。(7,25) 这种两步法的一个关键特点是SABRE超极化报告配体的作用，首先确定报告配体的KD值，然后使用相同的报告配体来确定其他非超极化配体的亲和力。5. 结论总之，我们已经证明，利用SABRE超极化技术对1H核进行低场NMR可以用于研究配体与蛋白质之间的生物相互作用。自旋-自旋弛豫变化提供了一种简便的方法来确定实验中的结合亲和力，每个配体只需要进行一次超极化步骤。通过检测质子化的报告配体，扩展了基于SABRE超极化的配体筛选平台的应用范围。观察NMR信号不需要添加氟或其他标记物，只需要设计一个具有与极化转移催化剂结合的功能基团的配体。结果表明，这种方法可以用于药物发现中的片段筛选或涉及配体结合的生化过程的研究。