利用AFM-IR纳米光谱技术对比不同细胞外囊泡分离方法

《Analytical Chemistry》：The Comparison between Different Extracellular Vesicle Isolation Methods by AFM-IR Nanospectroscopy

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细胞外囊泡（EVs）含有特定于细胞类型的特征，并已被提议作为多种疾病的生物标志物。然而，由于它们的尺寸很小以及尺寸分布广泛，这些颗粒的生物物理特性鉴定具有挑战性，目前仍存在争议。衍射极限效应限制了在中红外范围内获取EV样品的光谱数据，使得使用传统的振动光谱方法无法在纳米尺度上捕捉到图像和光谱。在这里，我们采用了原子力显微镜-红外光谱（AFM-IR）技术来阐明从血液（血清和血浆）中分离出的EVs的分子特征，以及它们的地形和生化特征与分离方法之间的直接关联。EVs通过Total Exosome Isolation Reagent（TEIR）、超速离心和尺寸排阻色谱（SEC）从C57BL/6雄性小鼠的血清或血浆中提取，并通过FTIR和AFM-IR分析进行评估。多变量分析（PCA和PLS-DA）显示，磷酸基团会根据EV分离/纯化方法的不同而发生显著变化，糖苷连接也有所不同。SEC处理会大幅减少1150 cm–1以上区域的生物分子量，这包括EVs中的α-螺旋和脂肪酸含量，而蛋白质、核酸、磷脂、碳水化合物和糖蛋白的β-折叠层和随机螺旋/转角/环状构象含量在SEC处理后几乎保持不变。TEIR方法可以在一定程度上保留蛋白质的各种构象含量，但会损伤核酸、磷脂、碳水化合物和糖蛋白。尽管如此，超速离心处理仍能最大限度地保留EVs中的生物分子。然而，观察到膜的结构损伤，例如与膜包装带（1720–1800 cm–1区域）相关的磷脂发生模糊，以及蛋白质带的整体减弱。

引言
细胞外囊泡（EVs）是由脂质双层构成的、膜限制的纳米至微米级结构，似乎由各种细胞释放。(1) 目前的文献报道，可以从培养细胞液、血液（血浆或血清）、尿液、牛奶、唾液、胚胎和微绿蔬菜中分离出EVs。(2,3) EVs含有特定于细胞类型的特征，并已被提议作为多种疾病的生物标志物。(4,35) 从这个意义上说，基于血液的EVs可以用作微创诊断、预后和预测工具。(4) 自90年代以来，诸如纳米粒子跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）和高分辨率流式细胞术等技术进步，增加了对EVs的研究成果。(3) 此外，生化成分分析和显微技术也促进了对EVs的更深入理解。(1) 另一方面，在经典生物分子技术（如Western blotting或流式细胞术）中使用特定的分离标记物存在风险，因为很难选择能够准确代表所分离EVs的标记物，需要通过不同的标记物进行正交分析以进一步鉴定。(3,4) 然而，由于EVs的尺寸很小且尺寸分布广泛，其定量和生物物理特性鉴定仍然复杂且存在争议。(3,7,20) 从血浆或血清中分离EVs是一个挑战，因为血液本身的复杂性很高。白蛋白和其他可溶性血液蛋白的大量存在会导致EV颗粒的污染。(5) 需要指出的是，不同的纯化方法可能会产生复杂且有时相互矛盾的结果，这直接影响了我们对EVs的认识。(3) 同时，不同的EVs分离方法也会影响它们的光谱特征。(1,2) 根据Ter-Ovanesyan等人的研究(6)，没有一种唯一最佳的EVs分离方法，因为纯化方法必须与应用相匹配。因此，开发有效的方法来比较不同分离方法的产量和纯度至关重要。(3) 基于振动光谱（如红外吸收）的生物光谱方法是原位表征生物样本的常用选择，因为它们具有分子和结构敏感性。(8,9) 然而，光衍射效应限制了对亚微米样品的成像，尤其是在中红外范围内，这使得使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）等传统光谱仪无法在纳米尺度上捕捉到图像和光谱。(10) 纳米尺度红外光谱（IR）是一种先进的技术，它将红外光谱与高分辨率显微镜相结合，用于在纳米尺度上表征材料。(11) 传统的IR光谱提供基于分子振动的化学信息，但受到光学衍射的限制，空间分辨率仅几微米。纳米尺度IR技术，如散射型扫描近场光学显微镜（s-SNOM）、光热诱导共振（PTIR）和光诱导力显微镜（PiFM），通过使用尖锐的原子力显微镜（AFM）尖端将空间分辨率提高到数十纳米，克服了这一限制。这些方法能够详细研究纳米尺度上的化学组成、分子相互作用和相分布，包括聚合物、生物样本和纳米结构，对纳米技术、材料科学和生物医学研究具有很高的价值。(3,11) 因此，使用AFM的纳米尺度IR（AFM-IR）有可能区分EVs的分子组成，将其地形与其分子组成直接联系起来，通过中红外光谱促进对EV结构、组成和功能的理解。(2,3,10) 然而，在纳米尺度上，由于缺乏明确的EV振动带分配，不同分离方法如何影响EV光谱尚不清楚。在这里，我们对从小鼠血浆或血清样本中分离出的EVs的AFM-IR光谱进行了详细研究，旨在识别EVs在纳米尺度上的内在和外在特征。

材料与方法
实验遵循1979年巴西联邦法律第6,638号的规定，该法律 regulates the use of animals in scientific experimentation，并在ABC联邦大学研究伦理委员会（3192040123）的协议下进行。(1) 使用了6至8周龄、体重在20至28克之间的雄性C57BL/6小鼠。所有动物被放置在最多容纳五只动物的集体笼子中，光照/黑暗周期为12小时，室温保持在25°C，提供充足的水和食物补充。血浆样本是通过刺破下腔静脉并用0.5 M EDTA抗凝后收集的总血液获得的，然后在300、3000和20,000g下离心15分钟获得。血清样本是从不含抗凝剂的血液中获得的，置于4°C下以12,000g离心10分钟得到。血浆和血清在-80°C下保存直至分离。每种方法提取的三个样本被合并，然后使用以下方法分离EVs：

**从血清样品中分离EVs**
分离过程按照Total Exosome Isolation Reagent（TEIR）制造商的说明进行。(22) 简而言之，第一步是将血清样品以2000g离心30分钟以去除细胞和碎片。然后将含有澄清血清的上清液转移到新的试管中，不干扰沉淀物，加入20%（相对于血清总体积）的TEIR试剂，混合并在4°C下孵育30分钟。孵育后，样品在室温下以10,000g离心10分钟。沉淀物重新悬浮在不含exosome的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后用膜过滤器（PES 0.1 μm）过滤，再用超纯PES 0.1 μm过滤的水稀释至1:10。

**使用血浆样品的超速离心**
差速超速离心利用高g力根据EVs的大小和密度差异进行分离，(29) 是分离和浓缩EVs的金标准。(30) 在超速离心（UC）方法中，血浆样品在4°C下以100,000g离心两次，每次1小时。然后，将样品重新悬浮在1 mL 1X过滤PBS中，并在4°C下以100,000g离心一次，持续1小时30分钟。沉淀物重新悬浮在500 μL 1X过滤PBS中，再用过滤的超纯水稀释至1:10。

**使用血浆样品的尺寸排阻色谱**
从血浆样品中分离EVs是通过尺寸排阻色谱（SEC）使用qEV1 70 nm Gen 2柱（Izon）实现的。选择富含小EVs的7–10 fractions进行进一步的浓缩。这些 fractions通过单次超速离心（100,000g，4°C下1小时30分钟）合并。沉淀物重新悬浮在50 μL 1X过滤PBS中，然后用过滤的超纯水稀释至1:10。随着EV分析灵敏度的提高，需要获得更高的EV浓度和更好的下游结果。(32?34)

**白蛋白**
近年来，由于白蛋白在EVs吸收中的作用，对其的研究越来越多，因为这些蛋白质不仅是污染物，还是EVs外层结构的一部分。(12,13) 在这种情况下，考虑白蛋白对EVs光谱的贡献具有基础重要性。小鼠血清中的白蛋白（Sigma-Aldrich, A3139）也以1:1的比例制备在1X过滤PBS中，用于光谱比较。

**FTIR测量**
从三种分离方法获得的EVs和小鼠白蛋白样本进行了测量和比较。分析是在1 mL滴涂在Pt基底上的EVs上进行的，这些EVs先干燥10分钟。使用FTIR微光谱仪（FT-IR 660 – Varian Inc.）进行测量，检测面积为24 μm2的Ge探测器，采用微反射法。分辨率设置为4 cm–1，扫描次数设置为100次。

**AFM-IR测量**
EV样品在室温下在层流中解冻以避免污染。将2 μL EV溶液滴在平坦的金基底上；使用 Bruker的nanoIR2-s设备在接触模式下获得地形图像和红外光谱（IR）。扫描使用的是Nominal弹簧常数为0.2 N/m、尖端半径小于50.0 nm的BudgetSensors ContGB-G探头。测量中使用的红外光源是Daylight Solutions MIRcat-QT-2400量子级联激光器（QCL），工作光谱范围为950–1920 cm–1。每个数据点来自3次单独扫描，共进行了32次光谱叠加以提高信噪比。每种提取方法共采样了40个EVs。

**数据分析**
**主成分分析（PCA）**
对每个样本至少30个颗粒的均值中心原始数据进行了经典的主成分分析（PCA），以剔除异常值并识别潜在的实验偏差。(23) 所有的光谱分析步骤都在R软件中使用ChemSpec vignette完成。(24) 使用减少的Q残差和T2 Hotelling统计量来识别异常值。减少的Q残差衡量样本与其在模型保留因子上的投影之间的差异。检查减少的Q残差可以检测出显著的残差异常值。相比之下，Hotelling的T2值衡量样本在模型内的变化，表示每个样本与模型中心的偏离程度（得分=0）。这是衡量异常值的指标。原始光谱数据使用T2 Hotelling与减少的Q残差图进行检验。

**偏最小二乘：判别分析（PLS-DA）**
去除异常值后，所有剩余的光谱都经过预处理以使其在统计上可比。使用Lieber和Mahadevan–Jansen提出的基于最小二乘多项式曲线拟合的曲线拟合方法进行了基线校正。(25) 所有光谱都进行了归一化并使用总强度进行缩放。(26) 然后进行了PLS-DA分析。这是一种多变量监督方法，通过原始数据的线性回归来预测类别成员身份。我们使用了R pls包中的plsr函数来进行PLS回归。(25,26) 分类和交叉验证使用caret包的相应包装函数完成。(27) 使用排列测试评估类别区分的性能。在每次排列中，构建了一个PLS-DA模型，该模型将数据与排列后的类别标签进行关联，使用基于原始类别分配通过留一法交叉验证确定的最佳组件数量。通过分类准确性、R2和Q2来评估类别区分的性能。前者由预测准确性决定。R2参数衡量模型根据组间和组内平方和之间的比率来拟合数据的有效性。另一方面，Q2是从交叉验证中获得的“可预测性”或预测变异。在PLS-DA模型中，使用了两个量化指标来评估振动带频率的相关性。第一个是方差重要性投影（VIP）分数，它是PLS载荷的平方和的加权值，考虑了每个维度中解释的光谱强度波动量。另一个相关性度量基于PLS回归的加权总和。权重是通过将平方和除以PLS组件的数量来确定的。在多组分析中，将为每个组构建确切的预测因子数量，并使用特征系数的平均值来表示基于系数的整体相关性。

样本量的适当性通过重采样稳定性（38）和基于排列的统计功效分析（39）根据我们的光谱数据进行了评估。当每组样本量超过30个时，分类性能趋于稳定。统计功效超过80%，表明研究设计足以检测多变量组间差异。

FTIR光谱
图1显示了通过三种不同方法分离出的EVs的FTIR光谱，以及小鼠白蛋白的光谱。小鼠白蛋白光谱显示在图1中。这些光谱主要由强烈的Amide I（1650 cm–1）和Amide II（1550 cm–1）带组成，其次是υPO2–（1070 cm–1）带、CH2和CH3断裂（1450 cm–1）带，以及预期的氨基酸特征带。（14,15）我们注意到所有EV样本都呈现了白蛋白带。与生物分子（如核酸、膜脂质和蛋白质）相关的带也在所有EV样本中观察到。然而，正如已经描述的那样，（18）即使使用微尺寸技术可以避免PBS晶体盐的形成，也无法从其他非EV载体（例如含有血液蛋白质的载体）中分离出EVs，这些非EV载体将在远场红外光谱中被检测到。因此，EV的指纹可能仍然隐藏在在大面积样本区域获得的空间平均红外光谱中。

图1
图1. 从尺寸排阻色谱（SEC）、总外泌体分离试剂（TEIR）和超离心（UC）EV样本以及小鼠血清白蛋白获得的FTIR平均光谱。

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TEIR EV的酯基团在1745 cm–1处的振动是最强烈的带。它与脂质、胆固醇、磷脂和寡糖有关，这些可能与膜、膜结合的寡糖、多糖以及可能从其他化合物中分离出的DNA特征相关。此外，UC直接影响了光谱的强度，因为UC分离过程得到的EVs微克数较少。（19）还观察到了分配给胆固醇、多肽和RNA的带。PBS中的磷酸盐在1230 cm–1区域与核酸区域有信号重叠。然而，在1000–1700 cm–1光谱窗口中，与白蛋白和TEIR光谱相比观察到了整体红移。

SEC分离的EVs FTIR光谱与白蛋白的光谱非常相似。否则，与UC方法相比，观察到了相同的红移带，表明TEIR与UC和SEC样本相比发生了化学修饰。与白蛋白光谱中看到的Amide I和II相关的带，以及甘油三酯、胆固醇、脂质、多肽、磷酸盐/DNA/RNA/PBS和RNA的酯基团也被观察到。此外，还检测到了由PBS缓冲液和分离方法分别提供的与磷酸盐和DNA相关的带。

正如Di Santo等人（3）所描述的，（3）考虑外泌体的一个挑战是它们的异质性，这既源于它们的纯化和表征，也源于它们的生物发生，即使在体外研究中也是如此。（20）另一方面，重要的是要指出没有一种EV纯化方法适用于所有分析，遵循可重复的步骤是很重要的。Di Santo等人（3）提供了一个丰富的示意图，支持我们在本文中的观点。然而，也可以看到，在体内和体外研究中，在微观尺度上也可以预期到白蛋白的特征。另一个挑战是在样品干燥后形成的1x PBS晶体，这限制了对样品边缘的分析（图2a）。

图2
图2. (a) 单一滴EV样本的立体显微镜（40×）图像，可以看到PBS 1x缓冲液晶体，以及比中心更清晰的滴液边缘。(b–d) 从SEC EVs（b）、TEIR（c）和UC（d）样本获得的AFM-IR地形图像（5 × 5 μm2）。

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使用AFM-IR分析了同一组样本，获得了地形图像（图2和3）及其接触模式下的红外光谱（图3）。在1x PBS中稀释的样本的干燥模式（图2a）显示了滴液中盐类的结晶形成，阻碍了在该位置的AFM-IR测量。如图2b–d所示，没有清晰地分辨出单个EVs。即使在避免了白蛋白的大聚集体，纳米尺度下的红外光谱中仍然存在白蛋白特征的光谱噪声，表明EVs界面仍存在白蛋白。（图3a–c）

图3
图3. 左侧图像中标记点处的AFM-IR光谱的箱形图，分别对应SEC（a）、TEIR（b）和UC（c）样本，这些样本在超纯水中稀释（1:10）。光谱是从50个EVs中获得的（仅显示代表性点）。

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尺寸排阻色谱（SEC）
如AFM-IR结果（图3a）所示，在1:10超纯水中分离的SEC EVs呈现出单个颗粒的地形，并显示出颗粒之间的高度分子均匀性。值得注意的是，尽管在FTIR（图1）和之前的中红外范围研究中可以检测到Amide II带，但其强度明显减弱。（35）这一事实表明SEC方法存在特殊问题，因为这种方法去除了来自血液EVs的丰富蛋白质。（29）

脂质、脂肪酸酯、脂质中的亚甲基链和核酸对SEC样本的特定振动有贡献。总外泌体分离试剂（TEIR）样本中观察到了与脂质和核酸（如RNA）相关的带，包括Amide I和Amide II蛋白质带。在这种浓度下观察到的地形与白蛋白的地形高度相关。（21）大多数单个颗粒在1:10稀释下可以与背景基底形成对比。选择了不同的样本区域来区分潜在的分离出的EVs与其他生物聚集体。在1745 cm–1处仍有一个与脂肪酸相关的强带，同时也观察到了与蛋白质（如Amide I和II）相关的带，以及核酸带。

尽管分离出的囊泡的地形更好，但可以看出这些囊泡的表面仍然与血液蛋白质相互作用。如TEIR用户指南（22）所描述的，（22）沉淀是这种分离方法的原理，基于结合水分子，其中试剂使不溶解的成分（如外泌体）从中析出，从而可以在短暂的低速离心后收集它们。另一方面，如果没有额外的纯化方法，这也可能允许其他亲水性血清化合物沉淀。

使用血浆样本进行超离心
在UC样本中，选择了两个不同的区域来收集地形和光谱，因为如文献（30,32）所预期的，有较少的清晰界定的囊泡。（30,32）此外，这种类型的方法由于蛋白质或EV聚集而导致纯度较低，使得进一步区分EV亚群变得更加困难。（30）根据微反射FTIR光谱，白蛋白对整体光谱有很大贡献。然而，根据AFM-IR结果，UC EVs之间存在很强的异质性，尽管大多数EV中保留了与蛋白质（1665和1520 cm–1）相关的强带。另一方面，即使在使用一种细胞系的体外研究中，也预期在同一EV群体内存在异质性，（20）因为EV的特征将反映它们的载荷。

先前的研究致力于描述UC的优点和缺点（30,33），得出结论由于UC过程中蛋白质的聚集，纯度较低，影响了下游分析，因此建议结合两种或更多类型的分离方法（如SEC）以获得更多的纯EVs。（31）我们的发现强有力地证实了这一点，突出了区分分离出的EVs与其他血浆化合物的挑战。

多变量分析
对完整的AFM-IR光谱集进行了数据挖掘。PCA分析结果总结在图4中。我们注意到SEC、TEIR和UC EV分离方法呈现了非常独特的光谱特征，使得这些样本的光谱之间具有高度区分度（图4a）。特别是，PC1与PC2的组合使得组间的区分度超过90%。双图检查（图4b）显示，967–977 cm–1（磷酸离子的对称伸缩模式）和1025–1031 cm–1（糖苷键）的带对这种区分度贡献最大。树状图（图4c）中的聚类分析清楚地表明形成了3个数据簇，主要由SEC、TEIR和UC样本组成。磷酸基团是细胞膜的重要组成部分，可能会根据EV分离/纯化方法而显著改变。糖苷键的作用至关重要，因为它们构成了EV的糖衣基础，参与了EV的生物发生、细胞识别和摄取。（37）这些基于糖的键将单糖连接在一起，并将糖连接到EV表面的蛋白质（糖蛋白）或脂质（糖脂）上。这些键的特定模式影响EV的功能，例如它们如何与受体细胞相互作用，并且在疾病中可能会改变，使它们成为潜在的生物标志物或治疗靶点。（37）

图4
图4. 主成分分析（PCA）总结了尺寸排阻色谱（SEC）、总外泌体分离试剂（TEIR）和超离心（UC）EV分离方法，显示了主成分对组合（a）、PC1和PC2的双图显示方差椭圆（b）以及光谱的树状图（c）。

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监督式PLS-DA方法也揭示了类似的趋势（图5）。如图5a中的对分数图所示，组间的区分得到了确认，其中的区分带基本相同（图5b）。区分的准确率为93%（图5c）。因此，我们可以得出结论，EV的制备方法对其生化组成有决定性影响，识别和分离这些关键的外源变化至关重要。

图5
图5. ? ?? ?? ?? ?? ??（PLS-DA）总结了尺寸排阻色谱（SEC）、总外泌体分离试剂（TEIR）和超离心（UC）EV分离方法，显示了主成分对组合（a）、PC1和PC2的双图显示方差椭圆（b）以及性能参数（c）。

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在此阶段，确定组间的光谱相似性和差异性非常重要，目的是确定特征EV光谱。然后，我们计算了每个组与主要非EV细胞成分（即结合在EV表面的白蛋白）的平均光谱。我们将白蛋白光谱拟合为多个伪Voigt线形的总和，并调整了每个白蛋白成分对SEC、TEIR和UC光谱的贡献（图6）。然后，我们对原始数据进行了反卷积处理，以去除与白蛋白相关的条带，并观察每种情况下纯EV光谱的估计值。

图6：处理原始SEC、TEIR和UC光谱以提取白蛋白成分。实线表示原始数据，虚线红色线条表示从白蛋白光谱反卷积得到的伪Voigt线形的总和，开圆圈表示每种情况下反卷积后的EV光谱。

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图7显示了经过白蛋白反卷积处理的EV平均光谱。乍一看，可以发现光谱之间存在显著差异，这表明每种处理方法都对EV膜的结构产生了明显的影响。

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SEC处理显著减少了那些位于1150厘米^-1以上区域的生物分子数量，该区域包括EV中的α-螺旋和脂肪酸成分。有趣的是，蛋白质的β-折叠和随机卷曲/转角/环状构象成分、核酸、磷脂及糖蛋白的成分几乎在SEC处理后得以保留。另一方面，TEIR方法虽然能够保留蛋白质的各种构象成分，但会损害核酸、磷脂、碳水化合物和糖蛋白的含量。在TEIR过程中还需要考虑的一点是TEIR试剂与膜之间的残留物。将EV的TEIR光谱与TEIR试剂处理前的光谱进行比较时，可以清晰地看到一些关键条带仍然存在（由垂直箭头标出）。尽管如此，UC处理能够保留EV中最多的生物分子。然而，观察到了膜的结构损伤，例如与膜包装相关的磷脂条带（1720–1800厘米^-1区域）变得模糊，以及整体蛋白质条带的减弱。

结论

FTIR结果在很大程度上支持了文献中关于表征血液中的细胞外囊泡的红外特征的示意图。(3,35,36) 然而，这些光谱也与白蛋白光谱有所重叠，除了与甘油三酯、膜结合的寡糖、脂质和核酸特征相关的条带。尽管如此，正如AFM-IR地形图所显示的，SEC处理的EV样品具有更好的单囊泡地形和更高的光谱均匀性，即使考虑到血浆样本的复杂性。此外，与酰胺II相关的白蛋白特征在AFM-IR纳米光谱和SEC结果中并未出现，这可能与之前描述的蛋白质EV冠状结构的减少有关。(12) 这一现象也得到了我们结果的支持。

另一方面，需要指出的是，酰胺I的减少和酰胺II峰的存在之前已被研究作为通过红外光谱表征循环EV时血液污染物减少的潜在证据，这与等离子体学有关。(35) 其中酰胺II与这些污染物的较低贡献有关。因此，根据EV的分离方法及其生物流体来源，进一步研究EV中的酰胺I和酰胺II峰是必要的（表1,2）。

表1. 通过TEIR、UC和SEC分离的EV样本的中红外（IR）光谱分配

波数（厘米^-1） TEIR UC SEC FTIR AFM-IR FTIR AFM-IR FTIR AFM-IR
分配
1767 1767 C═O 折伸-磷脂-膜包装
1745 1743 C═O 折伸-磷脂
1692 1700 酰胺I - β-折叠（反平行）
1667 1660–1639 酰胺I 随机卷曲/转角/环状（蛋白质-脂质相互作用）
1642 1645 酰胺I α-螺旋
1600–1615 C═N, C═C, 核酸
1542 1550–1575 脂肪酸或磷脂中的脱质子化羧基
1397 1397 磷脂中的CH/CH3-甲基化
1281 1280 磷脂、核酸中的不对称S═O、硫酸化脂质、糖胺聚糖
1251 1257 脂肪酸、核酸中的不对称S═O
1251 1260 磷脂、核酸中的C–O伸缩/PO2–
1168 1144 磷脂、核酸中的C–O伸缩/PO2–
1100 1078 磷酸振动；磷酸[PO2–（对称）伸缩；胶原和核酸的磷酸二酯基团
1032 1035 糖苷键的C–O伸缩/PO2–
1038 9899 磷脂的O–P–O对称伸缩

表2. 每种EV制备方法的主要负面生化影响

方法 生化负面影响
SEC α-螺旋和脂肪酸含量减少
TEIR TEIR试剂污染
Nucleic acids, phospholipids, carbohydrates, glycoproteins含量减少
UC 磷脂，尤其是膜磷脂的含量减少