核桃青皮改善苜蓿混合青贮品质、蛋白质降解、微生物群落及其相互关系的研究

《Metabolites》：The Effects of Adding Walnut Green Husk on the Quality of Alfalfa Mixed Silage, Protein Degradation, Microbial Community, and Their Interrelationships Naibi Abulaiti, Gulinigaer Aiyisirehong and Aibibula Yimamu

本综述聚焦农业废弃物资源化，研究发现添加核桃青皮(WGH)可显著改善苜蓿青贮发酵品质，抑制霉菌生长，并线性降低非蛋白氮(NPN)、蛋白酶活性及慢速降解蛋白(PB3)，同时提升快速降解蛋白(PB1)和体外干物质消化率(IVDMD)。研究揭示了WGH通过富集有益乳酸菌（Lactiplantibacillus, Levilactobacillus）抑制蛋白质降解的微生物机制，为反刍动物生产提高苜蓿蛋白利用效率提供了创新策略，并为实现核桃副产物的循环利用、推动农业可持续发展提供了科学依据。

　　

引言

核桃青皮是核桃果实外壳的绿色外层，约占果实总重的71%。中国作为全球最大的核桃生产国，每年产生大量核桃青皮，这类副产物常被作为废弃物丢弃，未能得到有效利用。值得注意的是，核桃青皮含有13.8%的粗蛋白，并富含多酚单宁、萘醌、类黄酮和多糖等生物活性化合物，这些成分赋予其抗氧化和抗菌特性。其中，多酚单宁能够抑制蛋白酶活性，从而有望在青贮过程中减少蛋白质降解和非蛋白氮的产生，这使得核桃青皮成为一种潜力巨大的饲料资源。然而，其在青贮系统中的应用尚未得到系统评估。

另一方面，紫花苜蓿是一种高产、高蛋白的优质牧草，但其高水分含量、高缓冲能力和低水溶性碳水化合物含量使其青贮面临挑战。在发酵过程中，由于植物和微生物蛋白酶的作用，蛋白质会大量降解，转化为非蛋白氮，降低了蛋白质的利用效率。先前研究表明，将苜蓿与富含活性化合物的添加剂（如红枣粉、红三叶草）混合青贮，可以缓解上述问题。鉴于核桃青皮富含多酚单宁，它为改善苜蓿青贮品质提供了一个极具前景的候选方案。本研究旨在综合评估添加核桃青皮对苜蓿青贮品质、蛋白质代谢、微生物群落动态及其相互关系的影响，为提升苜蓿青贮的蛋白质利用效率提供理论依据。

材料与方法

本实验的原材料包括新鲜的“陇威6010”紫花苜蓿和来自新疆阿克苏地区的核桃青皮干燥粉末。实验设置了四个处理组：对照组为纯苜蓿青贮，三个处理组则分别在新鲜苜蓿中添加80 g/kg、120 g/kg和160 g/kg的核桃青皮粉末，分别标记为A1、A2和A3。所有组别在混合时均均匀喷洒了商业复合菌剂。大约300克的混合物被装入真空袋中密封，在25°C的室温下避光青贮60天。青贮结束后，对样品的发酵品质、营养成分、氮组分、蛋白酶活性及细菌群落结构进行了全面分析。发酵品质指标包括pH值、微生物数量、有机酸浓度、干物质、粗蛋白和体外干物质消化率。氮组分分析了非蛋白氮、游离氨基酸氮、肽氮和氨态氮。蛋白质组分则按照康奈尔净碳水化合物-蛋白质系统进行分类。微生物DNA经提取后，对16S rRNA基因的V3–V4区进行扩增和高通量测序，以分析细菌群落结构。

结果

1. 1.
   核桃青皮对苜蓿青贮品质的影响
   随着核桃青皮添加比例的增加，青贮饲料的干物质含量显著上升，粗蛋白含量略有下降。混合青贮的乳酸、乙酸和丙酸含量降低，pH值升高，且未检测到丁酸。霉菌仅在对照组中被检出。尽管A3组的乳酸菌数量在数值上最高，但各处理组间无显著差异。A3组的酵母菌数量显著高于对照组和A1组。在体外干物质消化率方面，添加核桃青皮的混合青贮均高于对照组，其中A2处理达到了最高水平。正交多项式对比分析表明，随着核桃青皮添加水平的增加，干物质含量、pH值和酵母菌数量呈线性增加，而粗蛋白、乳酸、乙酸和丙酸含量则线性下降。
2. 2.
   核桃青皮对苜蓿青贮氮分布的影响
   与对照组相比，添加核桃青皮的A1、A2和A3组，其非蛋白氮、肽氮、游离氨基酸氮和氨态氮的含量均显著降低。对于非蛋白氮、肽氮和游离氨基酸氮，高添加水平的A2和A3组含量最低且无显著差异。而对于氨态氮，A2组的含量显著低于A3组。分析显示，核桃青皮的添加对非蛋白氮浓度有显著的线性效应，对肽氮、氨态氮和游离氨基酸氮则有显著的线性和二次曲线效应。
3. 3.
   核桃青皮对CNCPS蛋白质组分的影响
   随着核桃青皮比例的增加，快速降解真蛋白和中等降解真蛋白的比例逐渐上升，而非蛋白氮、慢速降解蛋白和不可利用蛋白的比例则下降。在A1、A2和A3组中，快速降解真蛋白和中等降解真蛋白的比例均高于对照组，而非蛋白氮、慢速降解蛋白和不可利用蛋白的比例则低于对照组。随着核桃青皮比例的增加，青贮饲料CNCPS组分中的非蛋白氮、慢速降解蛋白和不可利用蛋白的含量线性下降，而快速降解真蛋白和中等降解真蛋白的含量则线性上升。同时，核桃青皮的添加量对除非蛋白氮外的所有CNCPS组分指标均显示出二次曲线效应。
4. 4.
   核桃青皮对苜蓿青贮蛋白酶活性的影响
   在添加了核桃青皮的A1、A2和A3组中，酸性蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的活性均低于对照组。随着核桃青皮添加比例的增加，青贮饲料蛋白酶组分中酸性蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的活性呈线性下降趋势。同时，核桃青皮的添加量对青贮饲料蛋白酶组分的这些酶活性也具有二次曲线效应。
5. 5.
   核桃青皮对苜蓿青贮细菌群落结构的影响
   细菌群落分析显示，与对照组相比，添加核桃青皮后，青贮中细菌的操作分类单元数量减少。在属水平上，随着核桃青皮比例的增加，处理组中乳植杆菌属和副乳杆菌属的相对丰度高于对照组。在种水平上，随着核桃青皮水平的提高，寡养单胞菌、密歇根克雷伯菌和蚜虫欧文氏菌的相对丰度下降，而杨树类红细菌的相对丰度增加。α多样性分析表明，与对照组相比，A1组的Chao1指数和Observed_species指数显著降低，A3组的Pielou_e指数显著降低。辛普森指数和香农指数在各处理间无显著差异，所有样品的Goods_coverage指数均高于99%。皮尔逊相关性分析评估了前10种细菌物种相对丰度与蛋白质降解因子之间的关系。结果显示，乳植杆菌属与快速降解真蛋白和中等降解真蛋白呈极显著正相关，与游离氨基酸氮和氨态氮呈极显著负相关，与非蛋白氮和慢速降解蛋白也呈负相关。其他九个标记微生物属则与快速降解真蛋白和中等降解真蛋白呈负相关，而与其他指标呈正相关。

讨论

1. 1.
   核桃青皮添加对苜蓿青贮品质的影响
   核桃青皮中相对较高的水溶性碳水化合物和单宁含量可能通过提供额外的可发酵底物和抑制蛋白水解活性，改善了青贮的发酵品质并减少了蛋白质降解。本研究中，添加核桃青皮提高了混合青贮的干物质含量，其中A1和A2组的干物质含量落在推荐的青贮材料范围（30–35%）内。所有青贮的pH值在4.62至4.97之间，处于苜蓿青贮可接受范围，且无异味。所有处理组的有机酸含量均符合优质青贮标准。添加核桃青皮的组别有机酸含量低于纯苜蓿青贮，进一步表明富含单宁的材料可以抑制产酸细菌的增殖。值得注意的是，仅在纯苜蓿青贮中检测到霉菌，这表明在厌氧条件下，添加核桃青皮提供了充足的可发酵底物，从而抑制了霉菌生长，提高了苜蓿青贮的整体发酵品质。A2组显著提高了苜蓿青贮的体外干物质消化率，这可能与核桃青皮中的缩合单宁抑制有害微生物、减少蛋白质水解和细胞内容物浸出，从而更好地保存营养物质有关。
2. 2.
   核桃青皮添加对苜蓿青贮氮组分的影响
   在苜蓿青贮过程中，由植物和微生物酶驱动的蛋白质降解会将真蛋白转化为非蛋白氮。本研究显示，添加核桃青皮使非蛋白氮含量线性下降，表明蛋白质水解受到抑制，利用效率提高。这种效应可能与两种机制有关：一是核桃青皮的高干物质含量可能抑制了蛋白酶活性；二是核桃青皮中的单宁可能与蛋白质结合，增加了抵抗降解的真蛋白比例。非蛋白氮组分包括氨态氮、游离氨基酸氮和肽氮。随着核桃青皮的添加，这三种组分的含量逐渐降低，其中A2组的氨态氮和肽氮水平最低。这种减少可能与核桃青皮富含单宁有关，单宁可以结合并抑制关键的蛋白酶，导致其水解产物的减少，进而使得后续由微生物蛋白酶对游离氨基酸氮的脱氨基作用减弱，氨态氮积累降低。在CNCPS框架内，PB组分按降解速率分为快速降解、中等降解和慢速降解蛋白。快速降解和中等降解蛋白是瘤胃微生物蛋白合成的重要氮源。本研究中，增加核桃青皮的添加量显著提高了快速降解和中等降解蛋白的含量，同时逐渐降低了慢速降解蛋白的比例。这种转变表明，核桃青皮可能通过改变发酵底物、抑制植物蛋白酶活性和梭菌发酵，从而增加了瘤胃中可溶、易利用的蛋白质库。相反，慢速降解蛋白（通常与瘤胃非降解蛋白相关）的减少，意味着逃逸瘤胃发酵的蛋白质比例降低，这可能会增加瘤胃后吸收的蛋白质比例，最终提高青贮饲料的整体蛋白质利用效率。其潜在机制可能涉及核桃青皮的添加优化了苜蓿青贮中蛋白质的分子结构，从而影响了蛋白酶的可及性并减缓了降解。
3. 3.
   核桃青皮添加对细菌群落的影响
   青贮发酵涉及复杂且动态的微生物变化，微生物的组成和数量直接决定着最终产品的品质。在本实验中，所有样品的Goods_coverage指数接近1，表明测序深度足以代表原位微生物群落。核桃青皮的添加降低了细菌群落的多样性，这可能与青贮过程选择性塑造群落结构有关。可以推测，添加核桃青皮可能有助于在青贮过程中更快地建立厌氧条件。同时，核桃青皮处理增加了有益菌属（如乳植杆菌属和副乳杆菌属）的相对丰度，这些菌属已知能改善青贮品质并防止腐败。在种水平上，短副乳杆菌成为最优势的物种，这可能抑制了有害细菌并减少了微生物竞争。此外，乳植杆菌属与氨态氮和游离氨基酸氮呈高度显著的负相关，表明该菌属与青贮过程中的氮代谢密切相关，从而有助于抑制蛋白质降解和氨基酸的脱氨基作用。总之，添加核桃青皮通过富集有益乳酸菌并可能抑制蛋白水解，有利地改变了细菌群落，共同促进了苜蓿青贮发酵品质和蛋白质保存的改善。

结论

在苜蓿青贮中添加核桃青皮与降低有机酸和氨态氮含量、增加乳酸菌数量相关，这表明其可能改善发酵品质，特别是减少了不良发酵产物。此外，该处理还与更高的干物质含量、改善的营养品质、提高的体外干物质消化率以及减少的蛋白质降解相关，表明核桃青皮的添加可能与青贮过程中植物蛋白酶活性的抑制存在联系。它还对苜蓿青贮发酵过程中的非蛋白氮、中等降解蛋白和慢速降解蛋白等蛋白质组分产生了积极影响。另外，随着核桃青皮添加比例的增加，它降低了细菌群落的多样性，增加了有益细菌乳植杆菌属和副乳杆菌属的相对丰度，降低了克雷伯菌属和沙雷氏菌属的相对丰度，有效增加了有益细菌群落的丰度。总体而言，综合考虑对发酵品质、蛋白质组分和消化率的综合影响，在测试的添加水平中，120 g/kg的核桃青皮添加量似乎最为适宜。