针对两种环肽（cyclorasin9A5和3003pep）的多实验室生物分析方法开发

《Journal of Chromatography B》：Multi-laboratory development of bioanalytical methods for two cyclic peptides, cyclorasin9A5 and 3003pep

LC-MS方法在七家实验室同步开发用于分析环肽cyclorasin9A5和3003pep，除carry-over外均符合ICH M10指南，证实方法优化后性能可比但存在系统偏差。

　　

Rika Ishikawa | Mikio Shirasaki | Koichi Shiga | Ryoya Goda | Yuki Kishino | Hitomi Shimoda | Koichiro Hotta | Kiyomi Kikuchi | Kazuko Inoue | Masayoshi Saito | Yukiko Sugawara | Takuma Shigeyama | Risa Hamada | Takeru Yamaguchi | Kazuyuki Murata | Hisashi Fujita | Masaaki Kakehi | Ryoma Yamamoto | Kentaro Takahara | Naoko Arashida | Kosuke Saito

日本神奈川县川崎市国立健康科学研究所药物安全科学部门，邮编210-9501

摘要

与线性肽相比，环状肽在治疗应用中展现出许多理想的特性，包括对特定目标分子的选择性和较长的半衰期。由于环状肽结构的复杂性，液相色谱-质谱联用（LC-MS）是对其进行定量生物分析的首选方法。然而，基于LC-MS的生物分析方法面临一些挑战，例如前体离子对碎片化的抵抗以及目标离子存在多种电荷状态。实际上，不同实验室之间的LC-MS系统存在差异；但这些差异对环状肽的生物分析方法的影响尚不清楚。因此，在本研究中，不同实验室同时开发了基于LC-MS的生物分析方法来分析两种环状肽：cyclorasin9A5和3003pep。值得注意的是，在七个实验室使用不同的样品制备条件和LC-MS参数应用这些方法后，除了cyclorasin9A5的携带效应外，所有验证参数均符合ICH M10指南中规定的标准。这些发现表明，在环状肽的分析中，所开发的LC-MS生物分析方法的最佳条件因使用的系统而异；然而，在优化后，这些方法的表现具有可比性，无论实验室设置如何。此外，在一种分析肽的替代样品分析中观察到了潜在的系统偏差，这突显了不同实验室之间数据比较的挑战。

引言

环状肽由一个或多个通过头对尾、侧链对侧链或侧链对主链的环化反应形成的闭合环结构组成。这些结构具有一系列在治疗应用中非常理想的特性，包括增强的效力、特异性和选择性[1]、[2]、[3]。此外，这些环状结构有效地解决了线性治疗肽常见的挑战，如膜渗透性有限和半衰期短[3]、[4]、[5]、[6]。环状肽最初在多种天然来源中被发现，并以其多样的生物活性而闻名[7]、[8]。最近，肽合成技术的进步使得设计新型环状肽成为可能，包括链状、双环和三环肽[3]、[7]。这些创新使得合成更复杂的结构成为可能，最终提高了治疗效果。

由于环状肽结构的复杂性，液相色谱-质谱联用（LC-MS）因其强大的选择性和准确性而成为其定量生物分析的首选方法[9]、[10]、[11]。为了使用LC-MS对环状肽进行定量生物分析，通常采用三重四极杆（QQQ）质谱仪并结合选择反应监测（SRM），因为这种方法具有强大的选择性和灵敏度。然而，仍存在一些分析挑战，例如由于前体离子在碰撞诱导解离（CID）条件下难以生成特定产物离子[12]、[13]、[14]。此外，前体离子存在多种电荷状态，进一步复杂化了生物分析过程[9]。此外，毛细管电压、流动相组成和共洗脱的基质成分等因素显著影响离子化效率，从而影响方法的性能[9]。而且，特别是在分析碱性和疏水性化合物时，肽的携带效应更为常见[15]。

为了解决这些问题，进行了多实验室研究，以开发针对选定环状肽的生物分析方法并识别不同实验室之间的共同挑战。为此，选择了cyclorasin9A5（分子量1586.8）[16]和3003pep（分子量1868.2）[17]作为模型环状肽，因为它们具有不同的结构特性。具体来说，cyclorasin9A5含有四个碱性氨基酸，而3003pep仅含有一个酸性氨基酸以及多个N-甲基和N-乙酰胺键（图1）。作为初始基准，定量下限（LLOQ）设定为1 ng/mL，这反映了某些批准使用的环状肽药物的C_max值通常在静脉给药后为μg/mL范围，因此低100到1000倍[18]。在这项研究中，七个独立实验室分别为每种肽开发了基于LC-MS的生物分析方法。每个实验室系统地评估了关键验证参数，包括选择性、校准曲线、重复性精度和携带效应。此外，所有实验室还分析了共享的替代样品。这项工作代表了首次针对环状肽进行多实验室生物分析研究，预计将提供关于实验室变异性对环状肽生物分析方法开发和验证影响的见解，从而为这类结构的生物分析提供稳健且可重复的方法。

试剂、化学品和材料

cyclorasin9A5从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买，而cyclorasin9A5的结构类似物cyclorasin9A54则从Peptide Institute Inc.（日本大阪）购买，用作内标（IS）。环状肽3003pep及其结构类似物3004pep（IS）是根据既定程序在实验室内部合成的[19]。血浆样品包括来自BioIVT的混合和单独的Sprague Dawley大鼠血浆样本（K2EDTA，未过滤）

cyclorasin9A5的生物分析

表1总结了用于cyclorasin9A5生物分析的LC-MS条件，样品制备的详细条件在表S1和S2中描述。在不同的实验室中，一个实验室使用了基于C2的固相萃取（SPE），而其他六个实验室使用了蛋白质沉淀（PPT），并在萃取溶剂中添加了不同浓度（0.1–2%）的甲酸（FA）。此外，这六个实验室还使用了甲醇或溶剂混合物

结论

在本研究中，首次进行了环状肽的多实验室生物分析研究，并同时为两种环状肽（cyclorasin9A5和3003pep）开发了基于LC-MS的方法。尽管参与研究的七个实验室使用了不同的样品制备条件和LC-MS参数，但两种环状肽的所有验证参数均符合标准，除了cyclorasin9A5的携带效应外

CRediT作者贡献声明

Rika Ishikawa：撰写——原始草稿、可视化、形式分析。 Mikio Shirasaki：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、研究、数据管理。 Koichi Shiga：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、研究、数据管理。 Ryoya Goda：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、研究、数据管理。 Yuki Kishino：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、研究、数据管理。 Hitomi Shimoda：撰写——审阅与

资助

本研究由日本医疗研究开发机构（资助编号：JP22-24ak0101185和JP24-25mk0121286）资助。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Kosuke Saito报告称获得了日本医疗研究开发机构的财务支持。Ryoya Goda与DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED存在关系，包括就业。Yuki Kishino与DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED存在关系，包括就业。Hitomi Shimoda与DAIICHI SANKYO

致谢

作者感谢C. Sudo（国立健康科学研究所）在行政方面的协助。