基于液相色谱-质谱联用技术的毒马草（Coriaria arborea）中马桑毒素（tutin）定量方法及其在纵向研究中的应用

《Journal of Chromatography Open》：A liquid chromatography-mass spectrometry-based method for the quantification of tutin in Coriaria arborea and its application to a longitudinal study

　　

研究人员开发了一种液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）方法，用于定量分析毒马草（tutin, Coriaria arborea）叶片、花和茎样品中的马桑毒素（tutin）。各类型样品的方法重复性在相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）<10%范围内可接受，回收率为72%–87%。柱上检测限和定量限分别确定为0.15 ng和0.48 ng。校准曲线在78.2–1484.9 ng/mL范围内呈线性，且在跨分析批次（n=342）的三次重复校准中保持良好。该方法应用于2021年5月至2022年8月期间从新西兰北部霍克斯湾三个地点采集的毒马草样品（n=266）。结果显示，叶片样品中检测到的马桑毒素绝对含量最高，达3.13 mg/g干重，但平均浓度最高的是花样品，为1.25±0.61 mg/g干重（n=73；均值±标准差）。采样地点对测量的马桑毒素浓度有统计学显著影响（p=0.011）。马桑毒素浓度未表现出明显的纵向趋势，但随时间变化高度可变。总体而言，此处介绍的方法为野生植物种群中准确量化马桑毒素提供了一种快速可靠的途径。

## 研究背景与意义

马桑毒素（tutin）是一种急性神经毒素，存在于新西兰本土植物毒马草（Coriaria arborea）中，也在全球多种相关马桑属（Coriaria）植物中发现。在新西兰，马桑毒素因是导致蜂蜜中毒的主要原因而广为人知，其糖苷类衍生物和马桑毒素醇（hyenanchin，即4-羟基马桑毒素）也参与毒性作用。自19世纪末以来，新西兰即有因直接食用该植物或食用污染蜂蜜而导致马桑毒素中毒的记录。马桑毒素属于多氧化倍半萜苦味素烷类化合物（polyoxygenated sesquiterpene picrotoxane），通过倍半萜途径生物合成，起始步骤为甲羟戊酸（mevalonic acid, MVA）途径或2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP）途径，生成二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate, DMAPP）和异戊烯基焦磷酸（isopentyl diphosphate, IPP）。随后DMAPP与IPP缩合形成倍半萜前体法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate, FPP），经环化和修饰形成苦味素烷骨架，进一步修饰产生马桑毒素及其他苦味素烷衍生物。马桑毒素是γ-氨基丁酸受体和甘氨酸受体的拮抗剂（antagonist），可通过蜜蜂采集 passionvine hoppers（Scolypopa australis）分泌的蜜露而进入蜂蜜，该昆虫以毒马草汁液为食。因此，蜂蜜中马桑毒素浓度具有季节性，与passionvine hopper的生命周期及蜜蜂采集蜜露的时间相关。食用污染蜂蜜后的症状因剂量而异，从轻度头痛、头晕到严重抽搐、昏迷、剧烈惊厥乃至死亡不等。现行法规规定蜂蜜或蜂巢中马桑毒素最高含量不得超过0.7 mg/kg，且因其化学稳定性，无法通过加热或加工降解。

除蜂蜜安全外，近期研究探索了马桑毒素作为新西兰现有灭鼠剂替代品的潜力。研究表明马桑毒素对所有受试动物的致死剂量为55 mg/kg，且比现有替代品提供更快速、更人道的死亡方式。然而，由于相对较高的致死剂量要求、诱饵适口性及非特异性作用模式等因素，其田间应用可能受限。

目前，马桑毒素及其衍生物的定量主要集中于蜂蜜样品和人血清，围绕人类食用安全及相关法规展开。虽有研究从植物组织中提取马桑毒素，但多为用于其他目的的大量提取物（如分离纯化和结构表征），或不适于常规大批量样品分析。此外，针对植物组织的研究往往分析样品数量少，缺乏提取方法的验证数据。因此，关于植物材料中马桑毒素的提取方法、方法重复性、野生种群中的浓度及变异性，以及环境或季节因素影响等方面的公开数据十分有限。另外，马桑毒素作为灭鼠剂的潜在应用，未来可能需要筛选高含量野生植株作为提取纯化的原料，因其化学合成困难且成本高昂。

## 研究目的与技术方法

本研究旨在开发一种快速可靠、适用于处理大批量样品的毒马草各组织定量分析方法，并将其应用于真实样品集，以探究特定地点浓度及其随时间和季节的变化。样品集（n=266）于2021年5月至2022年8月期间采集自三个地理条件不同的采样点。

研究所采用的主要关键技术方法包括：（1）样品采集与前处理：从新西兰北部霍克斯湾Pihanui牧场的三个地点采集叶片、茎和花/果实样品，每地点三棵树，采样点依据海拔、日照、风力和降雨等地理特征选择，样品经冷冻干燥后采用珠磨式均质器粉碎；（2）乙醇超声萃取与固相萃取（solid phase extraction, SPE）纯化：使用Phenomenex Strata-X聚合物反相SPE柱进行纯化；（3）液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）分析：采用Thermo Scientific Accela HPLC系统串联Q Exactive Orbitrap质谱仪，配备加热电喷雾离子源（heated electrospray ionisation, HESI），使用Agilent Zorbax Rapid Resolution HD SB-C₁₈色谱柱，以含10 mM甲酸铵的水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，质谱在负离子模式下以全扫描MS1和平行反应监测（parallel reaction monitoring, PRM）模式采集数据；（4）定量分析：采用二氯荧光素（dichlorofluoroscein, DCF）作为替代内标，通过5点校准曲线（78.2–1484.9 ng/mL）进行定量，线性由已知马桑毒素浓度与马桑毒素/DCF峰面积比绘制获得；（5）质量控制：每20个样品分析一个混合质量控制（pooled quality control, QC）样品，分析批次始、中、末各进行一次完整校准，每40个样品进行技术QC重复标准品进样；（6）统计分析：使用R软件rstatix包进行非参数检验，采用Kruskal-Wallis秩和检验及Dunn's事后多重比较检验（Benjamini-Hochberg法校正p值）。

## 研究结果

**校准与色谱分析**：马桑毒素在校准范围内呈线性响应（R²=0.999），且在342次进样的分析批次中保持稳定。马桑毒素和DCF的色谱峰形优良，马桑毒素保留时间稳定性极佳（7.31±0.04 min），DCF有轻微保留时间漂移（8.68±0.21 min）。MS²碎片模式清晰，马桑毒素甲酸加合物（m/z=339.1015）产生两个主要碎片离子（m/z=153.0516和139.0361）用于定量和确证。技术QC计算浓度（79.0±4.5 ng/mL）与已知浓度（78.2 ng/mL）偏差在10%以内，混合QC样品16次重复测定的一致性在11%以内。

**精密度、回收率与检测限**：与C₁₈反相SPE柱相比，聚合物反相SPE柱的回收率显著提高（高4–7倍），因此选用Strata-X聚合物反相柱。各组织类型的三次重复提取分析结果可重复（RSD<10%），通过再次提取估算茎、花和叶片样品的提取回收率分别约为92%、96%和98%，单次提取后校正回收率分别为72%、81%和87%。仪器检测限和定量限（instrument detection limit, IDL和instrument quantitation limit, IQL）分别为29 ng/mL和96 ng/mL（柱上0.15 ng和0.48 ng），方法检测限和定量限（method detection limit, MDL和method quantitation limit, MQL）以干重计分别为11和38 μg/g，若直接测量SPE洗脱液而不稀释可改善至0.6和1.9 μg/g。

**样品分析结果**：共分析266个样品，包括84个叶片、88个茎、73个花、12个果实和9个老花头样品。各组织类型的马桑毒素浓度存在统计学显著差异（p=2.01×10^-16），叶片样品中检测到最高绝对含量（Site B, 3.13 mg/g干重），但花的平均浓度最高（1.25±0.61 mg/g干重）。采样地点对浓度有显著影响（p=0.011），Site B浓度最高，Site C最低。事后检验显示叶片浓度Site B与Site C间（p=0.04）、茎浓度Site B与Site C间（p=0.001）存在显著差异。同一采样点内不同树木间无显著差异。

不同组织类型间，茎与花、茎与叶的马桑毒素浓度在全数据集上存在一定相关性（R²=0.46和0.32，p<0.01），但主要由Site B数据驱动，Site C无明显相关性，花与叶之间无相关性。马桑毒素水平与采样日期无明确关联模式，未发现清晰的时间变化趋势。尝试与微气候数据关联分析受限于气象站故障及数据缺失，结果尚无定论。

## 讨论与结论

该方法适用于植物组织样品中马桑毒素的监测，方法变异远低于样品间变异，使得不同植物种群和组织类型间的比较成为可能。马桑毒素浓度在不同地点间存在显著差异但同一地点内无差异，提示其浓度可能依赖于生长条件或亚群体，即同一地点的树木具有相似的马桑毒素水平。

尽管组织类型和采样地点的差异具有统计学意义，但本研究未观察到基于季节的清晰趋势。各月份及随时间的变化未显示共同趋势，这一发现与既往报道中马桑毒素水平与季节无关的结果一致。但由于部分时间点样品数量不足及样品缺失，统计分析可能受到影响。马桑毒素浓度甚至在相对较短的时间尺度上也高度可变，表明这是一个高度动态的系统。茎浓度与花、叶浓度的相关性总体较弱，可能与仅检测游离马桑毒素而未包括其糖苷结合态有关，未来方法可扩展至马桑毒素糖苷、马桑毒素醇和二氢马桑毒素等相关化合物。

研究结论部分指出，该方法为植物样品中马桑毒素的快速可靠定量提供了有效工具，检测限适用于可能遇到的浓度范围，且可通过调整分析前稀释因子轻松改变以适应低浓度样品。该方法的扩展应可实现，前提是获得相应的标准品，这将允许对植物及种群内的分布、转运和季节变化进行更详细、更稳健的研究。综上所述，本研究开发并验证了一种基于液相色谱-质谱联用技术、适用于大批量样品处理的毒马草中马桑毒素定量方法，并将其成功应用于266个野外样品的纵向研究，揭示了组织类型和地理因素对马桑毒素积累的影响。该研究发表在《Journal of Chromatography Open》。