基于离子液体双水相系统(IL-ABS)预处理解锁血清乳酸脱氢酶(LDH)的色谱定量分析方法

《Journal of Ionic Liquids》：Unlocking Chromatographic Quantification of Serum Lactate Dehydrogenase via Ionic-Liquid-Based Aqueous Biphasic System Pretreatment

　　

乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)是多种疾病的关键生物标志物，但其常规比色分析法常因酶活性变异而面临可靠性问题。此外，血清中LDH浓度相对较低而高丰度蛋白含量高，基质效应会干扰准确量化。本研究首次将膦基类离子液体(Ionic Liquid, IL)组成的双水相系统(Aqueous Biphasic System, ABS, IL?ABS)作为样品前处理步骤，用于人血清中LDH的色谱定量分析。由膦基类IL与柠檬酸盐缓冲液(K3C6H5O7/C6H8O7, pH 7)构成的ABS使LDH可基于浓度而非比色法测定的酶活性进行定量。通过合理设计聚焦于IL阴离子及混合物组成，IL?ABS可在单一步骤中完全去除高丰度蛋白，同时将LDH从人血清中提取至IL?富集相且损失极小。在最适条件下，可使用二极管阵列检测器(Detector, DAD)的尺寸排阻高效液相色谱(Size?Exclusion High?Performance Liquid Chromatography, SE?HPLC?DAD)测定LDH水平，相对误差为8%。值得注意的是，IL?ABS克服了高丰度血清蛋白的干扰效应，开启了LDH的色谱分析途径，并可能在准确性和实用性上优于比色法。该分析策略有望提升LDH作为生物标志物的临床意义，辅助诊断、预后评估及医疗决策。

基于离子液体双水相系统(IL-ABS)预处理的人血清乳酸脱氢酶(LDH)色谱定量新方法研究——论文解读

乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)是临床上广泛用于诊断、预后监测及疗效评估的重要生物标志物，其血清正常参考范围通常为100–225 U·L^?1，升高常见于溶血、感染、心梗、肝病及恶性肿瘤等。目前临床主流检测方法为基于乳酸?丙酮酸可逆反应的紫外比色酶活性测定法，但该方法存在明显局限：需在加样后数秒内读取初速度，还原型辅酶Ⅰ(NADH)消耗过快易导致读值偏差；血清中高丰度蛋白如人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G, IgG)产生强基质干扰；测定结果受酶抑制剂、辅因子状态及反应条件影响大，重现性和可靠性受限。此外，LDH在血清中含量极低（低丰度蛋白），常规色谱或电泳技术受其检测限限制无法直接分析未经处理的血清。因此，开发能去除高丰度蛋白干扰、基于蛋白质量浓度而非酶活性的LDH定量新方法具有重要临床意义。研究人员提出利用离子液体双水相系统(Ionic?Liquid?based Aqueous Biphasic System, IL?ABS)对人血清进行单步预处理——将高丰度蛋白沉淀去除于界面，同时将LDH选择性萃取至IL?富集相，继而在尺寸排阻高效液相色谱?二极管阵列检测(Size?Exclusion High?Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection, SE?HPLC?DAD)上实现基于浓度的准确定量。研究证明该系统在最优组成下可实现LDH提取效率近100%、高丰度蛋白去除率100%，定量相对误差约8%，成功克服基质干扰，为LDH的临床生化分析提供了新思路。本文发表于《Journal of Ionic Liquids》。

主要关键技术方法： 研究人员采用AB型混合人血清（男性，Sigma?Aldrich池化血清）及牛心肌LDH标准品，以磷酸盐缓冲液(PBS)稀释并经BCA法标定蛋白浓度制作SE?HPLC?DAD校准曲线。构建由四丁基鏻盐（[P₄₄₄₄]Br或[P₄₄₄₄]Cl，>96%）与pH 7柠檬酸钾/柠檬酸缓冲液(K₃C₆H₅O₇/C₆H₈O₇)组成的不同质量分数IL?ABS，加入10倍稀释血清或含LDH水溶液混匀、离心分相。上相（IL?富集相）、下相（盐?富集相）及界面沉淀分别收集，采用Shodex Protein KW?802.5柱的SE?HPLC?DAD（检测波长280 nm，流动相为含0.3 M NaCl的100 mM磷酸盐缓冲液pH 7）定量LDH、HSA和IgG；界面沉淀蛋白另做SDS?PAGE（4%积层胶/20%分离胶，考马斯亮蓝G?250染色）验证。通过计算LDH提取效率(Extraction Efficiency, EE_LDH%)、高丰度蛋白耗竭效率(Depletion Efficiency, DE_Prot%)、LDH回收率(Recovery Yield, RY_LDH%)及相对误差(Relative Error, RE%)评价预处理性能。

3.1. IL?ABS for LDH extraction and protein depletion（IL?ABS对LDH的萃取与血清蛋白耗竭）

研究人员比较了阴离子分别为Br^?和Cl^?的四丁基鏻盐([P₄₄₄₄]Br与[P₄₄₄₄]Cl)在含60 wt%柠檬酸盐缓冲液、30 wt% IL、10 wt% LDH水溶液或10倍稀释血清体系中的表现。结果显示两种IL?ABS均能将LDH完全萃取至上相（EE_LDH= 100%），但仅[P₄₄₄₄]Br?ABS可使HSA和IgG等高丰度蛋白100%沉淀于两相界面（DE_Prot= 100%），上下两相均未检出高丰度蛋白；而[P₄₄₄₄]Cl?ABS的上相中可检出HSA峰。SE?HPLC?DAD色谱图证实[P₄₄₄₄]Br体系中LDH保留时间约16.2 min且无高丰度蛋白共洗脱。研究人员认为该差异源于Br^?较Cl^?氢键碱性(β)更低，对高丰度蛋白稳定作用弱，加之柠檬酸盐的盐析效应及高丰度蛋白本身高浓度易聚集沉淀，促使HSA/IgG选择性界面沉淀，而低浓度的LDH保留于IL?相不被沉淀。由此选定[P₄₄₄₄]Br + K₃C₆H₅O₇/C₆H₈O₇（pH 7）体系进一步考察组成影响。不同[P₄₄₄₄]Br（15–45 wt%）与缓冲盐（20–60 wt%）配比实验表明，所有测试组成均可实现LDH完全萃取与高丰度蛋白完全耗竭；但在总质量1 g的小体积体系中，IL或盐过低导致IL?相体积过小难与界面分离，故推荐适用组成为30 wt% [P₄₄₄₄]Br + 40 wt%或60 wt%缓冲盐，或45 wt% [P₄₄₄₄]Br + 40 wt%缓冲盐。

3.2. LDH quantitative recovery and detection after IL?ABS pretreatment（IL?ABS预处理后LDH的定量回收与检测）

研究人员考察不同ABS组成下LDH的回收率与相对误差，发现45 wt% [P₄₄₄₄]Br + 40 wt% K₃C₆H₅O₇/C₆H₈O₇缓冲盐体系获得最高回收率（RY_LDH= 92%）及最低相对误差（RE% = 8%），与常规临床生化检验允许误差范围相当，且该体系界面沉淀紧实、IL?相体积适中便于操作。向商品化人血清中添加100 U·L^?1LDH（临床适用下限）并经该ABS预处理后，SE?HPLC?DAD图谱显示未处理血清因高丰度蛋白掩盖无法检出LDH峰，而预处理后IL?富集相仅在~16.2 min出现与LDH标准品一致的单一峰，盐?相及上相均无HSA、IgG或碎片峰，证实无基质共洗脱干扰。SDS?PAGE进一步确认界面沉淀含HSA、IgG及其他中高分子量血清蛋白（~17–150 kDa），说明[P₄₄₄₄]Br?ABS可有效广谱耗竭高丰度组分。LDH在IL?相中保留其色谱行为（符合预期分子量洗脱位置），提示酶在温和IL?ABS条件下结构未被破坏。

3.3. Analytical performance of the IL?ABS/SE?HPLC?DAD method（IL?ABS/SE?HPLC?DAD方法的分析性能）

研究人员将所建方法与常规比色法和酶联免疫吸附测定(Enzyme?Linked Immunosorbent Assay, ELISA)比对：比色法测酶活性快但受酶变异性及基质效应影响大（CV ~5–11%）；ELISA特异性高但步骤繁琐、耗时（2–4 h）、抗体试剂昂贵。本方法基于尺寸分离后的蛋白质量浓度定量，相对误差~8%，经预处理后特异性高、基质干扰可忽略，单次预处理+色谱运行约40 min余，操作仅需单步ABS分离及常规HPLC，耗材成本低，适合标准分析实验室开展。研究中验证的检测下限为100 U·L^?1（临床低限），并指出ABS作用机制依赖于普遍的盐析效应及IL?蛋白差异化相互作用，不依赖疾病特异血清特征，预期适用于一般生物学变异的血清样本。

讨论与结论翻译总结：

研究人员得出结论，以膦基类IL与pH 7柠檬酸盐缓冲液构成的双水相系统可作为人血清中LDH色谱分析的有效单步预处理手段。[P₄₄₄₄]Br（而非[P₄₄₄₄]Cl）可实现高丰度蛋白完全界面沉淀耗竭与LDH完全萃取至IL?富集相，该选择性取决于IL阴离子氢键碱性及盐析效应。优化后体系（45 wt% [P₄₄₄₄]Br + 40 wt% K₃C₆H₅O₇/C₆H₈O₇缓冲盐）经SE?HPLC?DAD测定LDH的相对误差仅为8%，成功消除HSA与IgG干扰，使基于浓度的LDH色谱定量成为可能。将IL?ABS用于血清预处理后再行色谱检测，有望提高LDH作为生物标志物的量化准确性与实用性，对疾病风险分层、诊断、预后判断及临床决策具有潜在增益价值。