开发适用于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的稳健多轮杂交链式反应荧光原位杂交(Hybridization Chain Reaction Fluorescence In Situ Hybridization, HCR-FISH)改良方法

《Genes to Cells》：Developing a Robust Multiround HCR-FISH Method Modified for Caenorhabditis elegans

　　

在细胞分辨率下可视化多重基因表达模式是理解复杂生物系统的基础。迭代式协议如连续荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）已被广泛用于包括动物脑在内的复杂器官的基因表达谱分析。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是神经科学与遗传学中广泛研究的模式生物，本应极大受益于连续FISH协议，但目前尚未建立适用于全虫体样本的此类迭代协议。本研究开发了针对秀丽隐杆线虫优化的多轮杂交链式反应荧光原位杂交（Hybridization Chain Reaction Fluorescence In Situ Hybridization, HCR-FISH）方法。初期单纯水凝胶包埋不足以防止多次探针循环中的＞60%样本丢失，研究人员通过化学将水凝胶固定于盖玻片上解决了此限制，该简便步骤使多轮探测中的样本保留率显著提高至＞99%。此优化协议保持了高信号保真度，检测效率＞86%，轮间光斑匹配重现性＞80%。作为概念验证，该方法成功应用于全脑神经元活动测量后的同一只成虫以分析多个基因。此易行协议为在同一秀丽隐杆线虫个体中将多重分子数据与先前功能测量结果在细胞分辨率下关联提供了前景框架。

论文解读：适用于秀丽隐杆线虫的多轮HCR-FISH方法开发与应用

研究背景与立项依据：

荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）及其衍生技术如杂交链式反应荧光原位杂交（Hybridization Chain Reaction FISH, HCR-FISH）是细胞分辨率下可视化基因表达的重要工具。多轮FISH可突破报告基因荧光蛋白颜色数限制，适用于脑等复杂器官的基因表达谱绘制。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称C. elegans）所有体细胞已被鉴定且具备细胞分辨率基因表达图谱，是关联基因表达与细胞身份的理想模型。全脑钙成像表明线虫个体间神经元群体活动存在显著差异，推测这种个体差异源于分子状态（如基因表达）及神经环路的个体变异。为探究神经活动个体差异与分子状态的关联，需对同一已完成功能成像（如全脑成像）的个体进行基因表达分析。然而，目前尚无已发表的应用于C. elegans全虫体的多轮FISH协议，既有单轮FISH协议多针对批量处理而非个体特异性信息保留。虽已有研究利用水凝胶（hydrogel）包埋保存样本进行FISH，但单纯包埋是否足以应对C. elegans多轮杂交-洗脱（probing-stripping）循环尚不清楚。因此，研究人员旨在建立一种基于水凝胶包埋、保留个体信息、适用于C. elegans全虫体的稳健多轮HCR-FISH方法。本文发表于《Genes to Cells》。

主要关键技术方法：

研究人员以野生型N2及表达核定位tdTomato和GCaMP6f的TOY21株系C. elegans第一天成虫为样本。关键实验流程包括：4%多聚甲醛固定并液氮冻融破角质层；Poly-L-lysine（PLL）处理盖玻片；Proteinase K（2.5 U/mL, 30 min）通透化处理；LabelX（Acryloyl-X SE与label-IT amine偶联物）结合AcX（6-([Acryloyl]amino) hexanoic acid）将RNA及蛋白共价锚定于聚丙烯酰胺水凝胶网络（4% acrylamide/bis-acrylamide 19:1, 0.15% APS, 0.1% TEMED）；将聚合中的水凝胶通过PLL涂层盖玻片化学固定；设计特异性探针进行多轮HCR杂交、共聚焦体积成像及甲酰胺洗脱（stripping）；DAPI染核用于轮间图像配准；采用基于Jaccard指数的多分辨率刚性平移配准算法进行三维点云匹配，Capture-recapture模型估算检测效率。

研究结果：

2.1 Designing the Embedding Method for Iterative HCR-FISH for C. elegans

研究人员基于seq-FISH及ExCel技术建立了简化聚丙烯酰胺水凝胶包埋的多轮HCR-FISH流程：固定、RNA锚定、包埋、探针杂交、体积成像、洗脱循环。初步测试eat-4基因在第一二轮中信号强度、光斑点数量及阳性细胞数保持稳定，证明方法基本可行。

2.2 Anchoring RNA Into Hydrogel Network

研究人员使用LabelX将RNA的鸟嘌呤N7位烷基化并与丙烯酰胺基团偶联，使mRNA共价固定于水凝胶网络以实现迭代检测。尝试用Methacrolein（甲基丙烯醛）作为双功能固定-聚合单体因需高浓度APS/TEMED致凝胶孔径过小、通透性差而未获理想结果。

2.3 Sample Loss During Iterative HCR-FISH

对约200条成虫进行三轮循环测试发现未固定水凝胶在洗脱时易变形导致虫体脱落，第三轮后仅约40%样本留存。洗脱步骤引起的水凝胶形变是样本丢失主因，据此推测将凝胶固定于刚性基底可抑制形变防止丢失。

2.4 Attaching the Gel to a Coverglass Improved the Sample Retention While Keeping the Performance

使用PLL涂层盖玻片固定水凝胶后，三轮循环后样本保留率＞99%。针对成虫角质层较厚影响探针渗透的问题，优化Proteinase K条件（2.5 U/mL, 30 min）获得最高阳性细胞数（46.55±4.23）及信噪比，确定为最终条件。

2.5 Multiround HCR-FISH Robustly Detects the Expression of Target Genes

以eat-4为靶标，将两轮检测到的mRNA光斑转为三维二值张量，经多分辨率金字塔粗到精配准（最大化Jaccard index）后进行空间邻近匹配。结果显示轮间＞80%光斑可匹配对应坐标，表明凝胶无显著胀缩，高空间重现性得益于盖玻片固定。Capture-recapture模型估算eat-4与glr-1检测效率均＞86%（95% CI），证实优化条件下信号检测具一致性及高效性。

2.6 Application to Single-Animal Multi-Gene Analysis

研究人员对已完成全脑钙成像（记录75个神经元活动）的TOY21株系单只成虫实施优化多轮HCR-FISH，成功在同一个体检测到VGLUT编码基因eat-4、AMPA受体亚基glr-1、Islet cell Diabetes Autoantigen同源基因ida-1及热休克蛋白hsp-110的表达。阳性细胞数低于CeNGEN数据集（L4期线虫）预期，归因于发育阶段差异（本研究用成虫）及固定/凝胶化致头部神经节局部变形影响核检测。

讨论与结论总结（翻译研究结论部分）：

研究人员开发并验证了适用于秀丽隐杆线虫的稳健多轮HCR-FISH方法。研究发现单纯水凝胶包埋不足以在多轮处理中保留样本，而将水凝胶附着于处理过的盖玻片可显著改善样本保留率且不损害检测效率。该方法证明可应用于已完成全脑成像的个体动物。此方法的优势在于：(1) 保持位置关系便于轮间图像配准；(2) 兼容标准HCR-FISH协议且不需特殊设备；(3) 允许与个体动物行为或生理记录整合，桥接分子与功能分析。该方法可用于基于基因表达谱的神经元细胞身份鉴定，克服荧光蛋白标记的颜色限制、表达竞争及转基因难度（尤其他线虫模式生物）。需注意PFA固定与水凝胶包埋可致组织非均匀变形（尤头部神经节）影响神经元配准，未来可通过优化固定/凝胶条件或利用固定后存留的标记蛋白荧光解决。检测细胞数少于CeNGEN数据库可能源于发育阶段（成虫vs L4）基因表达差异。DAPI信号在超过4轮后减弱限制循环数。此经济、可重复的方法有望推动高内涵基因表达研究、神经环路作图及完整动物内基因表达与行为的关联分析。

（注：原文中提及HCR spot平均数量低于smFISH可能因HCR链放大致多点融合为单斑；In situ sequencing (ISS)在线虫中尚处探索阶段，本多轮FISH技术可为其提供基础；NeuroPAL结合RNA FISH可进一步提高细胞分类准确性——均为讨论中补充说明，已浓缩纳入上述总结。）