基于纳米抗体（Nanobody/VHH）靶向CLL-1与CD33的CAR-T细胞有效杀伤抗原阳性急性髓系白血病细胞

《Cancer Research Communications》：Nanobody-based CLL-1 and CD33 CAR T cells effectively kill antigen-expressi... Open Access

　　

摘要：急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤，其特征为未分化髓系祖细胞快速增殖导致造血抑制及患者预后不良。尽管基于单链可变片段（single-chain variable fragment, scFv）的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞疗法已革新肿瘤免疫治疗，但由于正常造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs）共享抗原表达，AML的临床应用仍受限于靶上脱瘤毒性（on-target, off-tumor toxicities）。为解决此难题，研究人员开发了靶向C型凝集素样分子-1（C-type lectin-like molecule-1, CLL-1）的纳米抗体（nanobody/ single-domain antibody derived from heavy-chain-only antibodies of camelids, VHH）基CAR-T细胞平台；CLL-1是髓系限制性表面抗原，健康造血干细胞极少表达该分子，但在AML原始细胞及白血病干细胞（leukemic stem cells, LSCs）中持续高表达。利用源自羊驼（llama）单域重链可变区抗体（VHH）的高特异性、高溶解性及低免疫原性，研究人员构建了CLL-1与CD33纳米抗体CAR载体并系统比较其功能活性。功能验证包括：采用IncuCyte活细胞成像实时监测mKate2标记的AML细胞毒性、连续肿瘤再攻击（serial tumor rechallenge）实验评估持续杀伤能力，以及NOD/SCID/IL2Rγnull（NSG）异种移植模型在高肿瘤负荷下评估体内（in vivo）疗效。CLL-1与CD33 CAR-T细胞表现出快速且持久的杀伤作用，在低效靶比（effector-to-target ratio, E:T）0.33:1时仍具显著杀伤效率。与CD33 CAR-T细胞不同，CLL-1 CAR-T细胞豁免正常造血祖细胞，保留其集落形成能力。重要的是，CLL-1 CAR-T细胞维持良好的记忆表型及稳定增殖与活力，细胞因子释放检测证实其产生有效且抗原特异性的免疫激活。体内实验中，CLL-1 CAR-T细胞治疗使AML异种移植模型发生显著且持续的肿瘤消退，并伴有功能性CAR-T细胞持久存在。综上，这些发现确立CLL-1靶向纳米抗体基CAR-T细胞作为一种精确工程化免疫治疗手段，兼具强效抗白血病活性、降低脱靶毒性及增强转化潜力，为克服当前AML CAR-T开发障碍、改善患者预后提供了前景广阔的治疗途径。

论文解读：基于纳米抗体靶向CLL-1与CD33的CAR-T细胞治疗急性髓系白血病的临床前研究

本研究发表于《Cancer Research Communications》。急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是高度侵袭性血液恶性肿瘤，标准化疗缓解率有限且毒性大，异基因造血干细胞移植存在移植物抗宿主病（Graft-versus-Host Disease, GVHD）及复发风险。嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中成效显著，但AML缺乏理想靶点——常用靶点如CD33、CD123亦表达于正常造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs），导致靶上脱瘤毒性（on-target, off-tumor toxicity）即骨髓抑制。C型凝集素样分子-1（C-type lectin-like molecule-1, CLL-1/CLEC12A）在85%～92% AML原始细胞及白血病干细胞（leukemic stem cells, LSCs）高表达，而正常HSPCs基本不表达，是较理想的AML选择性靶点。传统CAR使用单链可变片段（single-chain variable fragment, scFv），本研究首次采用驼源纳米抗体（nanobody/ variable domain of heavy-chain-only antibody, VHH）构建CLL-1及CD33 CAR-T，比较二者体外（in vitro）/体内（in vivo）疗效与安全性。研究证明纳米抗体基CLL-1 CAR-T细胞可有效杀伤AML细胞且在集落形成实验中不损伤正常造血，优于CD33 CAR-T；同时在NSG小鼠异种移植模型中实现肿瘤完全消退与生存延长，为AML提供更具安全性的下一代CAR-T策略。

主要关键技术方法：

研究人员用重组人CLL-1与CD33蛋白免疫羊驼（Lama glama），构建噬菌体展示文库筛选高亲和力VHH序列，将其克隆入第三代慢病毒载体pCDH-EF1α构建含CD8α铰链/跨膜域及CD3ζ-4-1BB（CD137）共刺激域的CAR。从健康供者白细胞单采物（leukopaks）磁珠分选CD3⁺T细胞经CD3/CD28活化后慢病毒感染制备CAR-T。用AML细胞系（U937、HL-60、EOL-1等）及原代AML外周血样本流式检测CLL-1/CD33表达；用IncuCyte活细胞成像进行效靶比梯度（E:T=10:1～0.33:1）细胞毒性与连续再攻击杀伤实验；用NFAT-GFP报告系统（Jurkat NFAT-GFP, JNG）评估CAR特异性激活与强直信号（tonic signaling）；用ELISA检测IFNγ细胞因子释放；用正常人骨髓CD34⁺HSPCs与CAR-T共培养行甲基纤维素集落形成单位（Colony-Forming Unit, CFU）实验（BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM）评估造血毒性；建立NOD/SCID/IL2Rγ^null（NSG）小鼠尾静脉注射U937-mKate2-Luc AML异种移植模型，治疗后活体生物发光成像（Bioluminescence Imaging, BLI）监测肿瘤负荷并行Kaplan–Meier生存分析，第45天取血流式检测循环CAR-T细胞。

研究结果：

CLL-1 and CD33 expression in AML cell lines and primary AML samples： 流式细胞术检测显示U937、HL-60、THP-1高表达CLL-1与CD33，EOL-1、MOLM-13等CLL-1低表达，Raji细胞均阴性；3例原代AML样本确认CLL-1与CD33共表达。结论：AML细胞系与原代样本差异表达CLL-1/CD33，为后续选用高表达U937/HL-60作靶细胞提供依据。

Development and screening of CLL-1 and CD33 CAR constructs： 经羊驼免疫、噬菌体展示筛选获CLL-1 VHH（X1为代表）与CD33 VHH（W2为代表），构建第二代CAR（VHH-CD8α hinge/TM-CD3ζ-4-1BB）。JNG报告细胞及原代T细胞验证：CAR表面表达成功，无强直信号（CD137/4-1BB不自发上调），与抗原阳性AML细胞共孵育后特异性激活（NFAT-GFP⁺）而Raji细胞不激活。结论：纳米抗体CAR构建正确，具抗原特异性激活且无配体非依赖性自激活。

CLL-1 and CD33 CAR T cells demonstrate strong in vitro activation upon engagement with CLL-1⁺and CD33⁺target cells： 原代CAR-T细胞表面CAR经抗原胞外域（ECD）蛋白染色确认表达；CD4/CD8比例、扩增曲线、活率与未转导T细胞无差异；表型分析显示中央记忆（T_CM）、干细胞样记忆（T_SCM）、效应记忆（T_EM）、终末效应（T_EMRA）比例无改变；CD137（4-1BB）检测无强直信号。结论：纳米抗体CAR转导不影响原代T细胞基本生物学特性与记忆亚群分布，无自发激活。

CLL-1 CAR induces an antigen-specific cytokine response upon target recognition： CLL-1与CD33 CAR-T与U937/HL-60共培养24 h分泌高水平IFNγ，与抗原阴性Raji共培养及未转导T细胞对照极低。CLL-1 CAR-T IFNγ略高于CD33 CAR-T。结论：纳米抗体CAR-T产生抗原依赖性强效Th1型细胞因子应答，具靶点特异性。

CLL-1 CAR T cells exhibit robust cytolytic activity against AML cells expressing target antigens： IncuCyte实时监测显示CLL-1与CD33 CAR-T对U937/HL-60在E:T=0.33:1仍有显著杀伤，呈剂量依赖性；对Raji无杀伤；对CLL-1低表达EOL-1仅高E:T比有杀伤。连续三次再攻击实验CAR-T仍保持杀伤能力。与scFv基CLL-1 CAR-T比，纳米抗体基在低抗原密度（EOL-1）及低E:T下展现更优敏感性。结论：纳米抗体CLL-1 CAR-T具高效、抗原特异性及可持续杀伤AML细胞能力，低抗原条件下敏感性可能优于scFv-CAR。

Nanobody-based CAR T-cell therapy exhibits strong antileukemic activity and prolonged survival in animal models： NSG小鼠注射U937-Luc后第7天予1×10⁷CLL-1/CD33 CAR-T、未转导T或PBS。BLI示CAR-T组1周内肿瘤信号显著下降甚至消除，对照组迅速进展死亡（中位生存约day 20）；CAR-T组生存显著延长（P<0.0001），体重无显著下降；第45天外周血可检出CAR⁺T细胞且CLL-1组频率高于CD33组，CD69低表达提示静息态但可再激活。1只CLL-1 CAR-T鼠出现GVHD被人道终点安乐死（异种移植模型已知现象）。结论：纳米抗体CLL-1/CD33 CAR-T在体内高效清除系统性AML、延长生存且全身耐受良好，CLL-1 CAR-T在血中存续更久。

Nanobody-based CLL-1 CAR T cells demonstrate selective targeting without affecting hematopoietic stem cells： CD34⁺HSPCs与CAR-T（E:T=10:1）共培养后甲基纤维素培养14天。CD33 CAR-T组红系爆式集落（Burst-Forming Unit-Erythroid, BFU-E）显著少于未转导对照及CLL-1 CAR-T组（P<0.0025），CFU-GM与CFU-GEMM各组成及总CFU无组间差异；CLL-1 CAR-T组各系集落数与未转导T无差异。结论：CD33 CAR-T损害红系祖细胞集落形成提示潜在造血毒性，而CLL-1 CAR-T豁免正常HSPCs造血重建能力，安全性优势明显。

讨论与结论翻译：

研究人员开发了新型纳米抗体基CLL-1 CAR-T疗法，旨在靶向AML原始细胞及LSCs同时最小化正常HSPCs耗竭。CLL-1在AML（尤其LSCs）高表达且正常造血祖细胞基本不表达，是理想选择性免疫靶点。数据表明CLL-1 CAR-T有效靶向AML细胞且不损害正常HSC功能；人HSPCs与CLL-1 CAR-T共培养的集落形成实验未见HSC活力或分化潜能显著下降，支持CLL-1相较CD33 CAR-T具更低脱靶毒性。纳米抗体CAR体积小、抗原结合空间位阻小、潜在免疫原性低；CLL-1 CAR-T对抗原阳性AML细胞具特异性激活与细胞因子应答，细胞毒性实验在E:T低至0.33:1仍有效且连续再攻击保持杀伤。体内AML异种移植模型证实快速肿瘤消退与生存延长，CAR-T细胞持久存在且处于静息可再激活状态。本研究确立了纳米抗体基CLL-1 CAR-T细胞作为具强效抗白血病活性、保留正常造血及降低脱靶毒性的精准工程化免疫治疗策略，为AML CAR-T临床转化奠定基础。

结论：本研究提出一种基于纳米抗体靶向CLL-1的CAR-T细胞策略，通过高特异性CLL-1抗原识别驱动强效选择性T细胞激活并增强细胞毒性，同时最小化脱靶效应。结果支持该策略治疗潜力，有望为AML患者提供更安全有效的CAR-T疗法并推动临床转化。