植物提取物和分子对接方法在穆什克布吉水稻可持续控制稻瘟病中的应用评估

《Applied Biological Chemistry》：Evaluation of botanical extracts and molecular docking approaches for sustainable management of rice blast disease in Mushk Budji rice

　　摘要
本研究旨在探讨和解决由稻瘟病（Magnaporthe oryzae B. C. Couch.）所带来的挑战。考虑到该品种的独特品质和文化重要性，研究通过深入分析和田间试验，将植物提取物整合到病害管理实践中，提出了一种创新方法。评估了21种植物提取物中三种不同浓度的乙醇基提取物在体外对抗病原体的效果，并根据其有效性进一步选择6种有效植物进行田间试验。田间试验在易感品种Mushk Budji水稻上进行，共持续两年。结果表明，某些植物提取物，特别是Syzygium aromaticum和Podophyllum hexandrum的提取物，显著降低了病害发生率和严重程度，并提高了谷物和秸秆产量，其效果与化学药剂Tricyclazole相当。此外，还进行了分子对接分析以识别具有抗真菌活性的化合物。根据文献报道的抗真菌活性，选择了quercetin、podophyllotoxin和eugenol作为对接研究的配体。这些植物化学物质对M. oryzae的ToxB样效应蛋白表现出较强的结合亲和力（-5.5至-3.8 kcal/mol），表明它们可能干扰真菌的致病机制。其中，quercetin和podophyllotoxin是最具前景的配体。将实验室检测与计算机模拟分析相结合，进一步支持了在综合病害管理中利用这些生物活性植物提取物的可行性。研究结果提倡使用环保型、植物基杀菌剂作为控制稻瘟病的可行策略，促进有机农业发展和本土水稻品种的保护。研究发现强调了开发环保型、植物基替代品的重要性，这与可持续农业和有机农业的目标相一致。未来研究应重点开发这些植物提取物的稳定配方，评估其与生物防治剂的协同作用，并通过多地点田间试验验证其有效性。

引言
全球近三分之一的人口以水稻（Oryza sativa L.）为主要食物来源，使其成为重要的谷物作物。尤其是在亚洲，水稻具有重要的经济和文化意义，是该地区农业和经济的支柱。水稻对于满足近35亿人的日常饮食需求至关重要，预计到2025年这一数字将增加到39亿[1,2,3]。2013年全球水稻产量约为7.4亿吨，预计到2030年需增加40%以满足83亿人口的需求[4,5,6]。印度是全球第二大水稻生产国，种植面积达4382万公顷，年产 Rice 1.776亿吨，单产4057公斤/公顷，反映了水稻在该国粮食安全中的不可或缺作用[7,8,9]。值得注意的是，印度的粮食产量从1961年的8740万吨激增至2019年的3.243亿吨[7]。水稻不仅是超过70%印度人的主要食物来源，也是许多其他地区居民的粮食来源[10]。Mushk Budji水稻以其独特香气和风味在克什米尔的农业传统中占有重要地位[11]。然而，由于易受到稻瘟病（Magnaporthe oryzae B. C. Couch.）的侵袭，这一品种面临严重的经济损失[12]。稻瘟病对全球低地和高地水稻生产构成严重且反复的威胁，每年导致10%至30%的产量损失，全球损失量约为1.57亿吨[13,14,15]。在有利条件下，这种疾病可能在短时间内摧毁整个农作物，导致高达100%的产量损失[13]。芳香型水稻广泛种植的一个主要问题是其对稻瘟病的易感性。例如，尽管Mushk Budji水稻具有独特的香气和品质，但在印度喜马拉雅山区仍存在这一问题[12]。作为仅次于中国的第二大芳香型巴斯马蒂稻生产国和出口国，印度在Jammu和Kashmir等水稻种植区面临稻瘟病的挑战，这严重影响了产量[12, 16, 17, 18, 19, 20]。由Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病在全球范围内造成重大产量损失，在极端条件下甚至可能彻底摧毁整个作物[21, 22]。该病已在85个国家发生，导致约30%的水稻产量下降，对全球粮食安全构成严重威胁[15, 23, 24, 25]。由于病原体的变异性和毒力模式的变化，它还被报道会导致小麦等其他谷物的病害[26, 15]。有效管理稻瘟病需要仔细整合多种策略和技术，因为任何疏忽都可能导致作物失败[27]。稻瘟病菌可以在水稻生长的任何阶段感染植株。初期症状表现为叶片出现白色至灰色/棕色斑块或病斑，随后可能导致节部和颈部病变，最终导致坏死和穗状结构断裂[28]。虽然化学防治是一种选择，但高剂量使用时成本高昂且对环境有害，因此需要可持续的替代方案[29]。在有机农业中，人们更注重环保的病害控制方法，包括生物、文化和物理方法。尽管系统性和接触性杀菌剂已被使用，但在有机作物生产中仅允许特定配方[30]。天然植物产品因其抗菌特性而被研究作为稻瘟病管理的替代品，因为它们安全、可生物降解且环保[31,32,33,34,35,36]。除了培育抗病水稻品种外，应用植物提取物和生物防治剂也是现代可持续农业和综合病害管理的关键。植物提取物的抗菌特性扩展了其在控制植物病害方面的潜力[37, 38]。尽管化学处理可以有效降低植物病害，但过去几十年的研究显示，过量和不恰当地使用化学杀菌剂会对环境、动物和人类健康产生负面影响[39, 40]。植物来源的物质天然存在，容易转化为环境友好的有机成分，对植物生理过程影响较小[41]。作为生物杀菌剂，植物提取物、精油、树胶和树脂等已在体外和体内证明对植物真菌感染具有生物活性[42,43,44]。这些产品可作为植物病害的替代治疗方案，因为它们通常被认为更可接受且对生态系统危害较小[45, 46]。天然植物产品针对特定目标具有专一的作用机制和有限的靶标范围[47]，通常对有害微生物无害，保质期较短，且不会留下残留危害[48]。与传统合成农药相比，它们通常对人类和环境更安全，常用于综合害虫管理（IPM）计划。根据Nuzhat和Vidyasagar（2013）[49]的研究，历史上使用植物提取物治疗人类疾病的贫困国家农民更容易接受这些方法。在资源匮乏的国家，天然植物基农药价格实惠、易于获取，对农民来说比合成杀菌剂更具经济性[50, 51]。本研究旨在探讨乙醇基植物提取物在控制Mushk Budji水稻稻瘟病中的作用，该品种以其独特香气和烹饪品质闻名[52, 11]。通过评估多种植物提取物在体外和体内的抗菌效果，本研究旨在寻找安全、环保且对生产者经济可行的替代病害管理策略。

材料与方法
**病原体分离**
使用PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基分离病原体。受感染的叶片经过一系列无菌处理，包括用无菌水清洗、用无菌手术刀切碎，然后用1%次氯酸钠溶液消毒30秒。消毒后的叶片片段放置在Whatman No.1滤纸上，并用无菌蒸馏水冲洗三次。随后用无菌镊子将叶片片段无菌转移到含有添加了链霉素（50 μg/ml）的PDA培养基的培养皿上。在25°C的B.O.D.培养箱中进行培养。当先前培养皿上出现生长迹象时，将一个孢子转移到含有15毫升无菌PDA培养基的新培养皿中。这种方法与Vanaraj等人的方法一致[53]。

**用于体外抑制Magnaporthe oryzae的植物提取物**
评估了21种植物提取物的乙醇基提取物，包括Artimisia annua、Acorus calamus、Capsicum annum、Bergenia ciliate、Datura stramonium、Syzygium aromaticum、Echinacea purpurea、Allium sativum、Geranium pratense、Heracleum candicans、Inula racemose、Juglans regia、Marrubium vulgare、Mentha arvensis、Mentha longifolia、Allium cepa、Picrorhiza kurroa、Podophyllum hexandrum、Rheum emodi、Sausurea costus和Zingiber officinale，采用毒性食物处理法在体外检测其对Magnaporthe oryzae的作用[54]。选择这21种植物提取物的方法如下：首先，许多提取物基于现有文献中的抗真菌活性被选中[35, 38]；其次，还加入了一些来自克什米尔喜马拉雅地区的较少研究的物种，以探索新的抗真菌活性来源。选择乙醇作为溶剂的原因是其极性使其能够有效提取植物中的极性和中等极性化合物[55]。这些植物大多原产于克什米尔喜马拉雅地区，但也有一些是从当地市场购买的。森林植物的选择受到了它们已知的抗菌特性的影响[35, 38, 56, 57, 58, 59]。表1提供了有关所使用植物的通用名称及其特定部位的更多详细信息。这些植物是从位于Sopore的Wadura的SKUAST-Kashmir农业学院的National Medicinal Plants Board (NMPB)的Northern Region-II区域促进中心 (RCFC, NR-II) 获取的。表1 列出了用于体外评估Pyricularia oryzae的植物/植物部位列表。

**乙醇植物提取物的制备**
乙醇植物提取物是通过首先将选定的整株植物或植物部位通过阴干或烘干方式干燥，然后使用电动搅拌机将其研磨成粉末来制备的。随后，将16克粉末状植物材料与100毫升无菌溶剂（70%体积比乙醇）混合在锥形烧瓶中以形成悬浮液。紧密封口的烧瓶在25°C下置于摇床培养箱中4天，以促进植物化学物质的最佳提取。使用Whatman No. 1滤纸过滤所得悬浮液，然后将过滤后的提取物在60°C的热风烤箱中干燥，直到溶剂完全蒸发[60, 61]。

**提取物的复溶**
为了复溶提取物，称取1克干燥后的提取物并溶解在5毫升温热的无菌蒸馏水中，制备出200,000 ppm的储备浓度[62, 63]。该储备溶液储存在塑料管中，并在4°C的冰箱中保存以供后续研究使用。从该储备溶液中制备三个不同浓度（2000 ppm、3000 ppm和4000 ppm），以评估其对Magnaporthe oryzae病原体的抑制作用。

**通过毒食技术测定菌丝生长抑制作用**
使用毒食技术，基于菌丝抑制百分比在体外评估了植物提取物对Magnaporthe oryzae的有效性[64]。从储备溶液中取特定体积的提取物加入已灭菌的PDA培养基中，最终浓度分别为2000 ppm、3000 ppm和4000 ppm。培养皿中加入20毫升含有植物提取物的PDA培养基，并在无菌条件下使其固化。每个处理组合的中心接种5毫米的7天龄Magnaporthe oryzae菌丝盘。同时也保留了不含植物提取物的对照培养皿。实验采用完全随机设计（CRD），每个处理重复三次。Tricyclazole（600 ppm）作为阳性对照。接种后的培养皿在25 ± 1°C下培养，分别在接种后7天和14天记录菌落直径。使用Vincent（1947）的公式确定提取物的杀菌性/抑制百分比[65]：
$$\:抑制百分比\:\left(\%\right)=\frac{C-T}{C}x\:100$$
其中，I= 对照组菌落直径；T= 处理组菌落直径。

**在田间条件下评估有效药用植物对稻瘟病病原体的效果**
此外，在SKUAST-Kashmir的Khudwani山区作物研究中心，还进行了在田间条件下评估有效植物对稻瘟病病原体效果的研究。田间实验使用了六种在体外研究中鉴定出的高效乙醇提取物：Podophyllum hexandrum、Inula racemosa、Syzygium aromaticum、Heracleum candicans、Allium sativum和Allium cepa。田间应用特别针对4000 ppm的剂量，该剂量在体外研究中被证明最有效。这项研究在2022年和2023年连续两年进行。对照处理包括由Indofil Industries Ltd.生产的化学杀菌剂Tricyclazole 75WP，施用浓度为0.06%。此外，还使用纯水作为对照。植物提取物在三个关键生长阶段以4000 ppm的浓度施用：分蘖期、穗形成期和抽穗期。大约一个月大、高度为20厘米的健康幼苗以每穴2株的密度在六月初移植，每个处理区的面积为2米×2米。采用15 × 15厘米的方形种植间距，并在整个作物期间遵循推荐的农艺措施。在分蘖期、穗形成期和抽穗期施用标准提取物溶液的叶面喷洒，每个处理重复三次。通过评估植物生长、健康状况和产量参数来监测田间试验中的植物毒性；未观察到任何不良的植物毒性效应，表明其适合进一步农业生产。最后一次喷洒后一周，使用SES（0–9）评分标准（表2）收集叶瘟病发生率和严重程度的数据[66]。疾病的发病率和严重程度的计算遵循Chiang等人（2017）[67]和Bock等人（2020）[68]的公式。收获后还测量了谷物和秸秆产量（q/ha）：
$$\begin{aligned}&\:\text{疾病发生率}\:\left(\%\right)\:\\&=\frac{\text{N}_{\text{发病株数}}{\text{总株数}}\times\:100\end{aligned}$$
$$\begin{aligned}&\:\text{疾病严重程度}\:\left(\%\right)\:\\&=\frac{\text{病株总分数}}{\text{总株数}}\times\:100\end{aligned}$$
表2 用于确定疾病严重程度的评分标准（SES，2013）

** research design and statistical analysis （研究设计和统计分析）**
体外测试采用完全随机设计（CRD）进行，而田间实验采用随机完全区组设计（RCBD）以减少变异性。植物提取物的体外评估也采用完全随机设计（CRD）。为了便于比较不同处理组的结果，使用R-Studio软件创建了弦图。对于这些植物的田间评估，采用了随机完全区组设计（RCBD）以减少结果的变异性。使用方差分析（ANOVA）对实验数据进行了统计分析，以评估处理的显著效果。实验设计中，处理组作为固定因素，重复次数作为随机因素（如果适用）。在进行ANOVA之前，使用Shapiro-Wilk检验检查残差的正态性，以确认假设得到满足。主要效应的显著性通过F检验在5%的显著性水平（p < 0.05）确定。使用最小显著差异（LSD）检验来区分哪些特定处理组的平均值有显著差异。表中具有不同上标字母的处理组表示基于LSD检验存在统计学上的显著差异。所有分析均使用R软件完成[69]。

**配体选择与制备**
基于已报道的抗真菌和抗菌活性，共选择了六种生物活性植物化合物——丁香酚、大蒜素、Germacrene D、Isoalantolactone、Podophyllotoxin和槲皮素。这些配体的选择基于全面的文献挖掘，重点关注它们对植物病原体的抗真菌和抗菌活性。所选化合物的2D化学结构从PubChem数据库中以SDF格式检索[70, 71]。然后将这些结构转换为3D构象，并使用Universal Force Field（UFF）进行能量最小化，以确保最佳的几何结构。最小化的结构随后使用Open Babel在PyRx 0.8中转换为PDBQT格式，为分子对接分析做准备[72]（表3）。

**目标蛋白质的建模与获取**
从UniProt中检索了Magnaporthe oryzae的ToxB样（MAX）效应蛋白的氨基酸序列[73]。选择该效应蛋白是因为它在调节真菌致病性和毒力方面具有已知作用，尤其是在Magnaporthe oryzae中。由于没有可用的实验3D结构，因此通过SWISS-MODEL使用同源建模技术预测了其三级结构[74]。生成的 结构通过SAVES v6.0服务器进行了验证，包括Ramachandran图分析（PROCHECK）、ERRAT和VERIFY3D以确认结构的可靠性[75]（表4）。使用Swiss-PDB Viewer对验证后的结构进行了进一步精炼以实现能量最小化[76]。准备好的结构保存为PDB格式，并使用AutoDock Tools转换为PDBQT格式，移除了水分子和非必需的配体，并添加了极性氢原子和Kollman电荷（图4）[77]。

**结合位点预测**
使用PrankWeb预测了ToxB样蛋白的活性结合口袋，该工具利用机器学习来识别配体可进入的残基[78]。选择最有可能且得分最高的口袋用于对接研究中的网格盒生成。

**分子对接**
对接模拟在PyRx中的AutoDock Vina内进行[79]。网格盒以M. oryzae的ToxB样蛋白的预测结合位点为中心。选择ToxB样效应蛋白是因为它在调节真菌致病性和毒力方面具有已知作用[73, 80]。针对这种蛋白的对接研究提供了有关选定植物化合物如何抑制宿主感染关键机制的分子信息。每种配体分别进行对接，并记录了每种化合物的最佳结合亲和力（单位为kcal/mol）。使用PyMOL可视化对接复合物，以评估配体-蛋白质相互作用[81]。

**结果**
体外评估各种植物提取物对Magnaporthe oryzae的效果显示了显著的菌丝抑制作用。研究表明，提取物浓度的增加导致菌丝生长显著减少（表3，图1）。大多数植物在接种后7天（DAI）和14天（DAI）时，在4000 ppm浓度下表现出较高的菌丝抑制百分比。其中，Syzygium aromaticum（丁香）的乙醇提取物在所有浓度下的平均抑制百分比最高，其次是Inula racemosa、Geranium pratense、Heracleum candicans、Podophyllum hexandrum、Allium cepa、Bergenia ciliata和Allium sativum。Picrorhiza kurroa在接种后7天（DAI）的抑制效果最低，其次是Mentha longifolia和Juglans regia（表5）。在接种后14天（DAI），Syzygium aromaticum再次显示出最高的菌丝抑制百分比，其次是Inula racemosa、Allium cepa、Allium sativum和Capsicum annum（表5）。虽然所有提取物在接种后7天（DAI）在4000 ppm浓度下显示出最大抑制效果，但在接种后14天（DAI），3000 ppm浓度的提取物也显示出显著的有效性。随着浓度的增加，使用Syzygium aromaticum、Inula racemosa等提取物时，M. oryzae的径向生长抑制也相应增加。基于这些提取物的效果，选定了六种有效的植物提取物与Tricyclazole 75WP和对照处理一起用于田间条件。此外，体外研究的结果在图2中以弦图的形式进行了图形化表示，其中提取物位于圆周上，浓度组以弧线表示。连接提取物与其相应浓度弧线的带宽度对应于菌丝生长的抑制百分比。

**图1**
图1显示了在使用毒食技术评估的不同乙醇基植物提取物时，7天（DAI）和14天（DAI）培养后Pyricularia oryzae的菌丝生长情况。三个浓度分别为：C1（2000 ppm）、C2（3000 ppm）和C3（4000 ppm）。
P. oryzae的宿主植物包括：a. Acorus calamus b. Artimisia annua c. Bergenia ciliate d. Capsicum annum e. Syzygium aromaticum f. Datura stramonium g. Echinacea purpurea h. Allium sativum i. Geranium pratense j. Heracleum candicans k. Inula racemosa l. Juglans regia m. Marrubium vulgare n. Mentha arvensis o. Mentha longifolia p. Allium cepa q. Picrorhiza kurroa r. Podophyllum hexandrum s. Rheum emodi t. Saussurea costus u. Zingiber officinale v. Tricyclazole 75 WP。

**图2**
弦图表示使用不同植物提取物处理时稻瘟病菌Pyricularia oryzae的菌丝生长抑制百分比（%。提取物沿圆周排列，三个浓度组以弧线表示。连接提取物与浓度弧线的带宽度与菌丝生长的抑制百分比成正比。每种提取物用缩写表示，分别是Inula racemosa（IR）、Rheum emodi（RE）、Heracleum candicans（Al. C）、Allium cepa（Al. C）、Allium sativum（AS）、Capsicum annum（CA）、Syzygium aromaticum（SA）、Mentha arvensis（MA）、Echinacea purpurae（EP）、Marrubium vulgare、Saussurea costus（SC）、Acorus calamus（Ac.C）、Juglans regia（JR）、Geranium pratense（GP）、Bergenia ciliate（BC）、Picrorhiza kurroa（PK）、Zingiber officinale（ZO）、Datura stramonium（DS）、Allium cepa（Al. C）、Podophyllum hexandrum（PH）。

**表5**
接种后7天和14天，各种植物提取物对稻瘟病病原体的菌丝生长抑制百分比

**评估有效植物提取物对稻瘟病的效果**
研究发现，2022年的稻瘟病发病率显著高于2023年，在所有处理组和对照组中均如此。两年的详细结果总结在表6和补充图1中。在六种植物处理方法中，Syzygium aromaticum提取物显示出最高的效力，使疾病发病率降至最低，仅为40.92%。其次是Podophyllum hexandrum（48.06%）、Heracleum candicans（54.79%）、Inula racemosa（54.38%）、Allium sativum（75.77%）和Allium cepa（83.03%）。合成杀菌剂Tricyclazole 75WP作为阳性对照，显示出最低的发病率，为33.36%。2023年，Syzygium aromaticum再次表现出最低的发病率（34.12%），其次是Heracleum candicans（41.25%），而未经处理的对照组的发病率为81.63%。综合结果显示，Syzygium aromaticum（37.52%）和Tricyclazole 75 WP（31.75%）在减少疾病发病率方面具有统计学上的相似性，其临界差异（CD）为0.58，p值小于0.05，表明它们在降低疾病发病率方面有效。相反，Allium cepa效果不佳，发病率为82.07%，与未经处理的对照组84.07%相当。Allium sativum的发病率为73.13%，也低于Allium cepa。Podophyllum hexandrum（44.55%）和Heracleum candicans（48.02%）显示出中等效果，后者与Inula racemosa（54.38%）在统计上相似（表6和补充图1）。方差分析（ANOVA）表明，在两年中，处理方法对疾病发病率有显著影响。使用最小显著差异（LSD）测试在5%的显著性水平上进行均值分离。具有不同上标字母的处理方法在统计上存在差异。

在疾病严重性方面，Tricyclazole 75WP始终优于其他处理方法，记录的严重性为20.60%。2022年，Syzygium aromaticum（24.12%）和Podophyllum hexandrum（23.43%）与Tricyclazole 75WP（22.14%）表现出相当的效果（表6和补充图1）。田间观察到的疾病症状范围显示在图3中。其他植物处理方法的严重性水平相对较高，顺序如下：Inula racemosa（35.50%）、Allium sativum（44.00%）、Heracleum candicans（47.63%）和Allium cepa（47.37%）。未经处理的对照组显示出53.13%的严重性。2023年，Tricyclazole 75WP再次显示出最低的疾病严重性，为17.21%，其次是Syzygium aromaticum（17.44%）和Podophyllum hexandrum（18.82%）。综合分析显示，Tricyclazole 75 WP（18.90%）、Syzygium aromaticum（20.78%）和Podophyllum hexandrum（21.13%）在严重性方面具有统计学上的相似性，其临界差异（CD）为0.75，p值小于0.05，表明它们在控制疾病严重性方面有效。总体而言，Tricyclazole 75 WP、Syzygium aromaticum和Podophyllum hexandrum被认为是对抗稻瘟病最有效的治疗方法，而Heracleum candicans和Allium cepa的效果较低，Inula racemosa和Allium sativum等其他处理方法的效果也有所不同（表6和补充图1）。

方差分析（ANOVA）结果显示，处理方法对疾病严重性有显著影响（F = 19.44，p < 0.001），且数据符合正态分布（Shapiro-Wilk W = 0.968，p = 0.623）。LSD测试用于均值分离，在5%的水平上识别出显著不同的处理均值。Tricyclazole 75WP、Syzygium aromaticum和Podophyllum hexandrum的严重性值最低，且在统计上相似，表明它们在减少疾病严重性方面有效。具有不同字母的均值表示存在显著差异。

在作物产量方面，Syzygium aromaticum处理方法从2022年的41.91 qha^-1显著增加到2023年的42.13 qha^-1，突显了其提高作物生产力的潜力。2022年的产量如下：Syzygium aromaticum（41.91 qha^-1）、Podophyllum hexandrum（41.14 qha^-1）、Inula racemosa（36.69 qha^-1）、Allium sativum（31.75 qha^-1）、Allium cepa（30.40 qha^-1）和Heracleum candicans（29.82 qha^-1）。对照处理的产量显著较低，为26.02 qha^-1。2023年，各处理的产量有所不同，Tricyclazole 75WP的产量最高，为44.94 qha^-1。其他处理的产量包括Syzygium aromaticum（42.13 qha^-1）和Podophyllum hexandrum（41.78 qha^-1），两者在统计上与Tricyclazole相似，临界差异为4.86，p值小于0.05（表7和补充图2）。其他产量如下：Inula racemosa（38.48 qha^-1）、Allium sativum（36.04 qha^-1）、Heracleum candicans（34.63 qha^-1）和Allium cepa（32.10 qha^-1）。未经处理的对照组的产量最低，为30.16 qha^-1。综合数据的统计分析显示，Tricyclazole 75WP的产量始终优于其他处理方法，为43.64 qha^-1，其次是Syzygium aromaticum（42.02 qha^-1）和Podophyllum hexandrum（41.46 qha^-1）。未经处理的对照组的产量最低，为28.09 qha^-1（表7和补充图2）。基于ANOVA（F = 6.70，p = 0.0004），处理方法对作物产量的影响在统计上显著。LSD测试用于均值比较，显示Syzygium aromaticum、Podophyllum hexandrum和Tricyclazole 75WP的产量显著高于对照组和其他效果较低的处理方法。未经处理的对照组的产量最低，LSD临界差异为2.02，p值小于0.05。

在秸秆产量方面，Tricyclazole 75WP再次成为优越的处理方法，在2022年和2023年的秸秆产量分别为71.01 qha^-1和70.52 qha^-1（表7和补充图2）。相比之下，对照处理的秸秆产量分别为52.57 qha^-1和52.48 qha^-1。统计分析表明，两年间处理方法之间存在显著差异，Syzygium aromaticum的产量分别为66.31 qha^-1和66.42 qha^-1，Podophyllum hexandrum的产量分别为66.54 qha^-1和66.55 qha^-1，Inula racemosa的产量分别为61.86 qha^-1和61.63 qha^-1，所有方法均显示出相当的有效性。综合分析显示，Tricyclazole 75WP的秸秆产量最高，其次是Podophyllum hexandrum（66.54 qha^-1）和Syzygium aromaticum（66.37 qha^-1）。其他处理方法如Allium cepa（64.12 qha^-1）、Inula racemosa（61.74 qha^-1）、Allium sativum（60.30 qha^-1）和Heracleum candicans（61.99 qha^-1）的产量中等，而未经处理的对照组秸秆产量最低，为52.53 qha^-1（表7和补充图2）。方差分析显示，处理方法对秸秆产量有显著影响（F = 6.70，p = 0.001）。LSD在5%的显著性水平上的均值分离显示Tricyclazole 75WP优于其他处理方法，其次是Podophyllum hexandrum和Syzygium aromaticum，两者在统计上相似。Allium cepa、Inula racemosa和Allium sativum等处理的产量中等。未经处理的对照组秸秆产量最低，LSD临界差异为2.02，p值小于0.05。

模型验证和对接分析显示，Ramachandran图分析表明，在最受欢迎的区域中有86.5%的残留物，在额外允许的区域中有13.5%的残留物，没有在禁止的区域中有残留物，表明了良好的立体化学质量（图5）。总共分析了74个残留物，包括甘氨酸和脯氨酸残留物。MolProbity分析进一步确认了结构的有效性，没有出现空间冲突或异常值（图4和图5；表8）。PrankWeb预测的结合位点在图6中提到。对接结果显示，所有六种植物化学物质都与Magnaporthe oryzae的ToxB类似效应器结合，结合亲和力各不相同。槲皮素显示出最强的结合力，结合能为-5.5 kcal/mol，其次是Podophyllotoxin（-5.3 kcal/mol）。Allicin的结合力最弱，为-2.8 kcal/mol（图7）。

本文研究了来自印度克什米尔喜马拉雅地区广泛使用和较少为人知的草本植物的各种提取物的抗真菌特性，这些提取物针对的是Magnaporthe oryzae。体外评估显示，丁香（Syzygium aromaticum）花蕾在2000、3000和4000 ppm浓度下表现出最明显的抗真菌活性，显著抑制了菌丝生长。其他植物，包括Inula racemosa、Allium cepa、Allium sativum、Heracleum candicans和Podophyllum hexandrum，也表现出不同程度的效果。在植物提取物中，丁香花蕾在抑制真菌菌丝生长方面显示出巨大潜力，这可能是由于其中含有活性酚类化合物丁香酚，该化合物通过破坏真菌的细胞膜导致细胞内容物泄漏和最终细胞死亡[82,83,84,85]。观察到的浓度依赖性效应表明，接种后7天（DAI），较高浓度通常会产生更大的抑制率；而在14 DAI时，3000 ppm浓度下也观察到类似的趋势。这表明活性化合物的浓度及其固有的抗真菌活性在其效果中起着关键作用[86, 87]。当活性化合物含量较高时，即使在较低浓度下也能维持强烈的抗真菌效果。相反，如果这些化合物含量较少但效力很高，那么随着浓度的增加，其抗真菌效果会更加显著[86, 87]。

来自不太为人知的喜马拉雅物种如Inula racemosa、Heracleum candicans和Podophyllum hexandrum的提取物的抗真菌效力为领域带来了新的贡献。尽管这些物种已被公认具有治疗人类疾病的药用特性，包括癌症[88,89,90]，但它们在管理植物疾病方面的潜力尚未得到广泛研究。这项研究是首次证明它们对Magnaporthe oryzae的有效性，表明这些植物中的生物活性化合物可能由于含有萜类、黄酮类和其他具有抗菌特性的次级代谢物而干扰真菌病原体的关键细胞过程[89, 90]。在Allium cepa和Allium sativum的提取物中观察到了中等的抗真菌活性，这归因于特定的有机硫化合物，如二烯丙基二硫化物和Allicin[91,92,93]。这些含硫化合物已知会破坏真菌细胞膜的完整性，并通过产生活性氧物种来抑制参与细胞壁生物合成的酶[93,94,95]。

本文探讨了来自印度克什米尔喜马拉雅地区广泛使用和较少为人知的草本植物的各种提取物的抗真菌特性，这些提取物针对的是Magnaporthe oryzae。体外评估显示，丁香（Syzygium aromaticum）花蕾在2000、3000和4000 ppm的浓度下表现出最明显的抗真菌活性，显著抑制了菌丝生长。其他植物，包括Inula racemosa、Allium cepa、Allium sativum、Heracleum candicans和Podophyllum hexandrum，也显示出不同程度的效果。在植物提取物中，丁香花蕾在抑制真菌菌丝生长方面具有巨大潜力，这可能是由于其中含有活性酚类化合物丁香酚，该化合物已被广泛报道可以通过破坏真菌的细胞膜来抑制各种植物病原体的生长[82,83,84,85]。观察到的浓度依赖性效应表明，较高的浓度通常会在接种后7天（DAI）产生更大的抑制率，而在14 DAI时，3000 ppm浓度下也观察到了类似的趋势。这表明活性化合物的浓度及其固有的抗真菌活性在它们的效果中起着关键作用[86, 87]。当活性化合物含量较高时，即使在较低浓度下也能保持强大的抗真菌效果。相反，如果这些化合物含量较少但效力很高，那么随着浓度的增加，它们的抗真菌效果会更加显著[86, 87]。

来自不太为人知的喜马拉雅物种如Inula racemosa、Heracleum candicans和Podophyllum hexandrum的提取物的抗真菌效力为领域带来了新的贡献。虽然这些物种因其对抗人类疾病的药用特性而受到认可[88,89,90]，但它们在管理植物疾病方面的潜力尚未得到广泛研究。这项研究是首次证明它们对Magnaporthe oryzae的有效性，表明这些植物中的生物活性化合物可能通过含有萜类、黄酮类和其他具有抗菌特性的次级代谢物来干扰真菌病原体的关键细胞过程[89, 90]。在Allium cepa和Allium sativum的提取物中观察到了中等的抗真菌活性，这归因于特定的有机硫化合物，如二烯丙基二硫化物和Allicin[91,92,93]。这些含硫化合物已知会破坏真菌细胞膜的完整性，并通过产生活性氧物种来抑制参与细胞壁生物合成的酶[93,94,95]。在所有体外评估的植物提取物中，有一些提取物在较高剂量下表现出较低的菌丝抑制作用，这可能是由于这些提取物中含有某些化合物，在高浓度下会干扰养分的吸收或利用，从而使真菌能够绕过这一限制或利用其他营养来源，从而导致生长抑制作用减弱[97]。对选定的植物醇制剂的田间评估显示，它们对由菌核菌（M. oryzae）引起的经济上重要的水稻叶枯病具有不同的效果。我们的研究发现，丁香芽（Syzygium aromaticum）提取物在减少疾病严重程度方面表现出最佳潜力，其次是Podophyllum hexandrum、Heracleum candicans、洋葱、大蒜和Inula racemosa提取物，按效果递减的顺序排列。这些提取物在2022年和2023年显著降低了疾病 intensity，其中丁香和Podophyllum提取物的效果可与商业杀菌剂Tricyclazole相媲美。丁香芽提取物的优异表现与先前的研究结果一致，这些研究强调了Eugenol和其他存在于S. aromaticum中的酚类成分的抗真菌特性[98, 99]。虽然已经证明了丁香提取物对多种真菌病原体的抗真菌作用，但其抗真菌机制尚未明确。其他真菌物种的研究表明，像Eugenol这样的化合物可以诱导真菌细胞膜的结构变化，破坏细胞器的完整性，并干扰重要的酶促过程[100]。然而，这些机制在水稻叶枯病中的抗真菌作用程度仍不清楚。同样，Podophyllum hexandrum和H. candicans提取物的抗真菌活性可能归因于其中含有的生物活性成分，如podophyllotoxins[101]和furanocoumarins[102, 103]，这些成分已被发现可以抑制真菌的生长和发育。我们研究中观察到的疾病严重程度减轻可能与这些提取物具有破坏菌核菌生命周期的能力有关，无论是通过直接抑制菌丝生长，还是通过干扰孢子萌发[104]，或者破坏细胞氧化还原平衡[105]并引发氧化应激[105]和穿透过程。尽管许多研究已经证明了大蒜和洋葱等植物提取物的抗真菌和抗菌特性[106, 107]，但仍有许多关于这些植物如何具体抑制真菌和细菌生长的详细研究尚未进行。此外，某些植物提取物在田间条件下效果不佳或效果减弱，可能是由于这些植物制剂中活性化合物的稳定性问题[108]。丁香和大蒜提取物的优异表现体现在更高的谷物和秸秆产量上，表明它们能有效减轻病原体的危害。

在这项研究中，我们使用分子对接方法研究了六种天然存在的植物化学物质——Eugenol、Allicin、Germacrene D、Isoalantolactone、Podophyllotoxin和Quercetin与菌核菌（M. oryzae）的ToxB类效应蛋白（MAX家族）之间的相互作用。这些化合物是从植物提取物中选出的主要生物活性成分，在我们的湿实验室实验中显示出对菌核菌的强烈抗真菌活性。在测试的配体中，Quercetin和Podophyllotoxin表现出最高的结合亲和力（分别为-5.5 kcal/mol和-5.3 kcal/mol），表明它们与真菌效应蛋白有很强的相互作用潜力。Quercetin是一种广泛存在于洋葱（Allium cepa）、辣椒（Capsicum annuum）和茶（Camellia sinensis）等植物中的黄酮类化合物，以其实质性的抗菌和抗氧化特性而闻名。其与ToxB类效应蛋白的强烈相互作用表明它可以干扰真菌的毒力机制，可能抑制宿主的入侵和定植。其已记录的抗真菌活性进一步支持了这一假设[109]。Podophyllotoxin是一种主要来自Podophyllum hexandrum的木脂素，以其细胞毒性和抗菌特性而闻名。在我们的对接研究中，它显示出最高的结合亲和力之一。Anand等人（2022年）的先前工作强调了其作为治疗剂的潜在活性[110]。计算机模拟中的强烈结合进一步表明Podophyllotoxin可能是我们在湿实验室实验中观察到的Podophyllum hexandrum提取物抗真菌活性的关键成分。Isoalantolactone是一种从Inula racemosa中分离出来的倍半萜内酯，其结合亲和力为-4.7 kcal/mol，已被证明具有显著的抗菌和抗真菌特性[111]。这项研究中观察到的中等结合亲和力与其生物活性特征相符，支持其在抑制真菌效应子中的潜在作用。Germacrene D是一种存在于Heracleum candicans和其他芳香植物中的倍半萜烃，其对接亲和力为-4.1 kcal/mol。Chauhan等人（2018年）报道了具有抗菌特性的精油中Germacrene D的丰富含量[112]。尽管其结合能低于Quercetin或Podophyllotoxin，但作为复杂植物提取物的一部分使用时，它可能会产生协同效应[113, 114]。Eugenol是丁香油（Syzygium aromaticum）的主要成分，具有众所周知的抗真菌特性，在与ToxB类蛋白的对接研究中显示出-3.8 kcal/mol的结合亲和力。根据Atif等人（2024年）的研究，Eugenol对Fusarium oxysporum表现出显著的抑制作用，表明其具有广谱抗真菌潜力[85]。尽管其结合能相对较低，但其破坏真菌膜和信号通路的能力使其成为生物控制的一个可行候选者[115,116,117]。Allicin是一种来自大蒜（Allium sativum）的含硫化合物，在我们的研究中显示出最低的结合亲和力（-2.8 kcal/mol）。然而，正如El-Saber Batiha等人（2020年）报道的那样，其抗真菌潜力包括氧化微生物酶中的巯基团，从而导致细胞死亡[118, 119]。虽然其与ToxB的直接结合可能较弱，但在自然环境中，Allicin可能通过互补机制发挥作用[120, 121]。因此，使用天然来源的植物提取物可能有助于减轻合成杀菌剂的不利影响，如环境污染、病原体抗性的产生以及对非目标生物的潜在危害。我们的研究未发现这些植物处理对有益土壤微生物或植物相关微生物产生任何负面影响。虽然主要评估集中在疾病控制和作物表现上，但根据已发表的报告和传统用途，所选的植物提取物被认为是环境安全的。需要注意的是，观察到的抗真菌活性是用粗提物获得的，这意味着纯化和分离活性化合物可能会提高其效果。这些发现具有更广泛的应用潜力。几种测试过的植物和植物化合物已知对多种植物病原真菌具有活性。由于其作用机制涉及抑制真菌生长和致病性，这些提取物可以在经过针对性的有效性测试后用于其他作物。需要更多研究来解决这些化合物的稳定性、配方问题以及与其他生物控制剂或综合害虫管理策略的潜在协同效应，以将这些发现转化为实际应用。

Mushk Budji大米以其独特的香气和风味在克什米尔的农业遗产中占据重要地位。研究结果突显了不同处理方法对疾病发生率、疾病严重程度、谷物和秸秆产量的多样化影响，为优化农业实践提供了有价值的见解。年际间的变化强调了在农业研究中考虑时间动态的重要性。作为Tricyclazole等化学杀菌剂替代品的植物提取物显示出了相当的效果。在某些情况下，例如2022年的丁香和Podophyllum，它们的疾病严重程度百分比与Tricyclazole非常接近。此外，在随后的一年中，除了丁香和Podophyllum外，Heracleum和其他植物也显示出接近Tricyclazole的疾病严重程度百分比，表明这些植物可以作为化学杀菌剂的有效替代品。深入分析和田间实验的结果表明，在遵循有机农业原则的同时，植物干预措施在减轻疾病影响方面具有潜在效果。在我们之前的湿实验室测试中，这些六种植物来源的粗提物显示了对菌核菌的强烈抗真菌作用。考虑到所测试的植物化合物是这些提取物的主要成分，我们推测这些分子在抑制真菌生长方面起着核心作用。与ToxB类效应蛋白的对接相互作用表明，这些化合物可能干扰效应子介导的宿主-病原体相互作用，这是疾病发展的关键步骤。这种计算验证补充了我们的实验结果，并提供了这些生物分子可能作用机制的分子级见解。未来的研究方向应包括分子动力学模拟、效应基因的表达分析以及植物试验，以更明确地确定其效果和机制。因此，需要更多的研究来解决这些化合物的稳定性、配方问题以及与其他生物控制剂或综合害虫管理策略的潜在协同效应，以便将这些发现转化为实际应用。使用天然来源的生物控制剂可能有助于减轻合成杀菌剂的不利影响，如环境污染、病原体抗性的产生以及对非目标生物的潜在危害。这突显了在农业实践中考虑替代治疗方法的重要性。因此，为了生产更安全的农业产品，未来需要投入更多精力开发更多市售的植物杀菌剂。所研究的植物特别适合小农户使用，因为它们在当地容易获得、价格实惠且环保。大多数提取物可以在本地配制，减少对昂贵商业杀菌剂的依赖。虽然大规模农场可能需要开发稳定的商业级制剂和更严格的安全评估，但小农户可以轻松将这些植物纳入综合有机管理系统中。