IGFBP1：m6A表观遗传靶点揭示葛根治疗非小细胞肺癌的新机制

《PLOS Computational Biology》：Multi-omics and network pharmacology identify IGFBP1 as an m6A-Epigenetic target of pueraria in NSCLC therapy

本综述通过多组学与网络药理学整合分析，揭示了RNA m6A（N6-甲基腺苷）修饰驱动非小细胞肺癌（NSCLC）进展的新视角。研究构建了基于m6A调控因子的预后分型与风险模型，并将其与传统中药葛根（Pueraria）的药理靶点网络相交，最终锁定IGFBP1为核心治疗枢纽。分子对接与动力学模拟证实葛根异黄酮成分可稳定结合IGFBP1。该工作为基于RNA表观遗传修饰的精准肿瘤治疗及中药现代化提供了创新策略。

　　

引言

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占病例的80%–85%。尽管分子和靶向治疗取得了进展，NSCLC的五年生存率仍低于20%，改善预后和预测免疫治疗结果仍是迫切需求。N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是一种普遍存在的RNA化学修饰，影响RNA的加工过程，其失调是驱动NSCLC进展的关键因素。然而，m⁶A修饰与传统医学衍生疗法（如中药）之间的相互作用在很大程度上仍未得到探索。本研究旨在整合基于m⁶A的预后亚型与葛根药理学，以识别与m⁶A调控因子相关的预后标志物和治疗靶点。

m⁶A相关预后基因的亚型识别与模型构建

研究通过对1,661个NSCLC样本（包括肺腺癌LUAD和肺鳞癌LUSC）的多组学数据进行分析，基于23个m⁶A调控因子的表达谱，将样本分为三个不同的m⁶A修饰模式簇（A、B、C）。生存分析显示，簇B的患者预后优于簇A和簇C。差异表达分析确定了985个在m⁶A簇间差异表达的基因。功能富集分析表明，这些差异基因在腺体和表皮发育等生物学过程中显著富集，KEGG通路分析则显示其在吞噬体通路中富集。

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通过对57个与预后显著相关的m⁶A簇差异基因进行多变量Cox回归分析，最终构建了一个包含19个基因的稳健预后特征模型。风险评分的计算公式为：生存风险评分 = 0.1543 * S100A10 + 0.0926 * IGFBP1 - 0.1585 * SLC52A1 + 0.0512 * KREMEN2 + 0.0787 * SCPEP1 + 0.1195 * COL4A3 + 0.0915 * GSTM2 + 0.1032 * STRAP + 0.0693 * PCDH7 + 0.1389 * PAK2 + 0.0437 * CYP4B1 + 0.0950 * MTUS1 + 0.1204 * ESPL1 + 0.0690 * PRRX2 - 0.1307 * TTK + 0.1181 * COL4A4 + 0.0965 * CCR7 + 0.0891 * NPC2 + 0.0806 * SKA1。该模型在独立数据集GSE31210中得到了验证，高风险组患者显示出明显更差的预后。

m⁶A调控因子的突变/拷贝数变异景观与免疫景观

对23个m⁶A调控因子的分析揭示了其在NSCLC中的拷贝数变异（CNV）和突变情况。生存分析表明，FMR1、HNRNPC、IGFBP1、IGFBP3、LRPPRC、RBM15、WTAP、ZC3H13和HNRNPA2B1的高表达与NSCLC患者不良预后相关，而IGFBP2、METTL3、YTHDC2和YTHDF2的高表达则提示较好的预后。基因集变异分析（GSVA）显示，不同的m⁶A簇富集了不同的KEGG信号通路，例如簇C在赖氨酸降解和刺猬（Hedgehog）信号通路中表达较高。此外，通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估了三个m⁶A簇的免疫细胞浸润情况，发现21种免疫细胞类型的分布在簇间存在显著差异，这突出了m⁶A修饰模式与肿瘤免疫微环境（TME）之间的密切关联。

基于预后基因的基因分型、肿瘤突变负荷与免疫特征

基于19个预后基因的表达谱，研究进一步将患者分为三个基因簇（A、B、C）。生存分析显示，基因簇C的临床结局显著优于簇B和簇A。研究还探讨了肿瘤突变负荷（TMB）与风险评分的关系，发现高风险评分与较高的TMB相关。有趣的是，高TMB且低风险评分的患者拥有最佳的临床结局。免疫表型评分（IPS）分析表明，在CTLA-4和/或PD-1表达不同的各种情况下，低风险组患者对免疫治疗的应答均优于高风险组，提示该风险模型具有预测免疫治疗疗效的潜力。

m⁶A预后基因与抗癌药物敏感性的关联

通过CellMiner数据库分析，揭示了部分m⁶A预后基因的表达与特定抗癌药物的敏感性存在关联。例如，CCR7的表达与Nelarabine、Fluphenazine等药物的敏感性呈正相关；S100A10的表达与Kahalide F和Irofulven的敏感性正相关；而SLC52A1的表达与Fulvestrant敏感性正相关，但与Vinblastine和Depsipeptide的敏感性负相关。这些发现为针对特定基因表达模式的个性化用药提供了线索。

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肿瘤免疫微环境、基因表达与临床结局

分析显示，多个预后基因在LUAD和LUSC的肿瘤组织中表达上调，并且它们的表达与免疫亚型、干细胞特性评分（RNAss, DNAss）以及肿瘤微环境评分（免疫评分、基质评分、ESTIMATE评分）存在显著相关性。此外，这些基因的表达水平与患者的病理分期（T、N、M分期）和总生存期密切相关。例如，在LUAD患者中，ESPL1、IGFBP1、KREMEN2等高表达与不良预后相关，而CCR7、CYP4B1、SLC52A1等高表达则与较好预后相关。

通过RT-qPCR和单细胞RNA测序验证m⁶A预后基因

通过RT-qPCR在NSCLC细胞系（A549、H1299、H1975、H1703、H520、H226）和正常肺上皮细胞（Beas-2B）中验证了19个预后基因的表达模式，结果与生物信息学分析一致。此外，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集GSE119911（包含20个NSCLC样本的5,406个细胞）进一步在单细胞水平验证了这些基因的表达。UMAP聚类鉴定出7种主要细胞类型：单核细胞、B细胞、T细胞、上皮细胞、诱导多能干细胞（iPS细胞）、巨噬细胞和组织干细胞。分析显示，SCPEP1、STRAP、PAK2、NPC2等基因在多种细胞类型中高表达，而其他基因则表现出细胞类型特异性表达模式，这为了解这些基因在肿瘤微环境不同细胞组分中的功能提供了精细视角。

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网络药理学揭示IGFBP1是葛根作用于NSCLC的m⁶A靶点

研究通过网络药理学方法，整合了来自GeneCards、CTD、TTD和OMIM数据库的7,333个NSCLC相关基因，并从草药数据库Herb 2.0中筛选出葛根的活性成分（如7,8,4’-三羟基异黄酮和染料木素），经SwissADME药代动力学筛选和SwissTargetPrediction靶点预测，得到366个葛根作用靶点。将葛根靶点与NSCLC相关基因取交集，得到249个枢纽基因。

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GO富集分析显示，这些交集基因主要富集在蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性和MAPK级联的正调控等过程。KEGG通路分析表明，它们显著富集于PI3K-AKT信号通路。进一步，研究构建了“葛根有效成分-靶基因-KEGG通路-NSCLC”的调控网络。最后，将葛根靶点、NSCLC相关基因与之前筛选出的m⁶A预后差异基因取交集，最终锁定胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP1）为核心治疗靶点，它成为连接m⁶A相关肿瘤生物学与葛根药理学的关键枢纽。

免疫组化验证IGFBP1在NSCLC组织中的表达

通过免疫组化（IHC）实验，在LUAD和LUSC患者组织样本中验证了IGFBP1的蛋白表达。结果显示，IGFBP1在LUAD和LUSC肿瘤组织中均有阳性表达，这与TCGA数据库中IGFBP1的表达模式一致，从蛋白水平证实了IGFBP1作为潜在治疗靶点在NSCLC中的相关性。

分子对接和分子动力学模拟验证葛根成分与IGFBP1的稳定结合

通过CB-dock2在线平台进行分子对接分析，结果显示葛根的两个活性成分——7,8,4’-三羟基异黄酮和染料木素（Genistein）与IGFBP1蛋白能够稳定结合，结合能分别为-8.3 kcal/mol和-7.4 kcal/mol。

为进一步验证结合稳定性，研究进行了为期100纳秒的分子动力学（MD）模拟。对7,8,4’-三羟基异黄酮-IGFBP1和染料木素-IGFBP1两个复合物的分析显示，它们的均方根偏差（RMSD）在模拟后期均达到稳定平台期（约1.2-1.25 nm），表明系统达到平衡。回转半径（Rg）分析显示复合物结构紧凑性增加。溶剂可及表面积（SASA）值在模拟过程中下降并趋于稳定，表明结合导致蛋白质表面更紧密。此外，两个复合物在整个模拟过程中均保持了稳定的氢键数量，这表明葛根成分与IGFBP1之间形成了强而持久的相互作用，为IGFBP1作为葛根抗NSCLC作用的关键靶点提供了计算层面的有力证据。

讨论

m⁶A RNA甲基化在肿瘤免疫治疗中至关重要，其结合蛋白影响恶性肿瘤的进展。本研究显示，m⁶A调控因子可以识别肿瘤微环境的特征，而基于其差异基因构建的框架可能揭示NSCLC免疫治疗的生物标志物。研究构建的预后网络将IGFBP1和HNRNPC等识别为风险因素。将NSCLC分为三个m⁶A簇，揭示了JAK-STAT和Hedgehog等通路的激活。m⁶A基因簇与免疫细胞组成的差异相关，低风险组且免疫表型评分高的患者对免疫治疗反应更好。

通过整合网络药理学，本研究将传统草药化合物与现代肿瘤学联系起来。通过汇集大量NSCLC相关基因和葛根活性靶点，并锁定IGFBP1为核心靶点，将m⁶A调控、肿瘤微环境、药物敏感性和免疫浸润联系起来。分子对接验证了葛根异黄酮，特别是7,8,4’-三羟基异黄酮和染料木素，与IGFBP1的高亲和力结合。这些相互作用将m⁶A失调与草药药理学联系起来，使IGFBP1成为表观遗传学引导的NSCLC治疗的连接点。

结论

本研究揭示了一种新的RNA表观遗传机制，阐明了葛根在NSCLC中抗肿瘤作用的基础，并确定IGFBP1为一个关键治疗靶点。多组学与网络药理学的整合为中药现代化提供了一种有前景的策略，并表明m⁶A相关基因可作为重要的生物标志物，用于指导NSCLC的免疫治疗反应和个性化治疗策略。