《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：In vitro propagation of Fritillaria pontica Wahlenb.
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本研究旨在建立黑海贝母（Fritillaria pontica）的离体快繁体系，该物种为自然分布于东南欧及土耳其西北部的球根类植物。研究通过测试不同温度处理方案及外源植物生长调节剂（plant growth regulator, PGR）处理，以
本研究旨在建立黑海贝母（Fritillaria pontica）的离体快繁体系，该物种为自然分布于东南欧及土耳其西北部的球根类植物。研究通过测试不同温度处理方案及外源植物生长调节剂（plant growth regulator, PGR）处理，以噻苯隆（thidiazuron, TDZ）2.0 mg·L?1配合重复短期冷处理（repeated short-term cold treatment, RSCT）获得了最高的种子萌发率（60%）及出苗数（0.6株/粒种子）。无论采用何种温度培养方案，PGR处理下的根系形成均极少。6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine, BAP）2.0 mg·L?1配合长期冷处理（prolonged-term cold treatment, PCT）获得了最高的籽球产量（0.26个/粒种子）及最长的芽体（1.46 cm/粒种子）。幼苗周围的愈伤组织接种于添加激动素（kinetin, KIN）的相同培养基中进行器官诱导，分别培养2个月和6个月，对照培养基在两个时期均获得了最高的芽器官发生（caulogenesis）响应。籽球同样以TDZ、吲哚-3-丁酸（indole-3-butyric acid, IBA）及1-萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid, NAA）处理相同时间，对照培养基在2个月后获得了最高的出苗及生根数；培养6个月后，0.5 mg·L?1 TDZ和0.5 mg·L?1 NAA分别获得了最高的出苗及生根数。通过间接器官发生获得的茎段仅在6个月培养期间对IBA处理产生响应，其中IBA 2.0 mg·L?1获得了最高的根原基形成响应（3.13条根/株，根长1.51 cm）。本研究建立的方法将有助于贝母属（Fritillaria）物种的保育研究。
黑海贝母（
Fritillaria pontica）是百合科（Liliaceae）贝母属的一种多年生草本球根类植物（球根植物，geophyte），自然分布于巴尔干半岛及土耳其北部地区，其栖息地包括林地、路边、林中空地和灌丛。该物种具有观赏价值，其钟形花朵具有美学吸引力，同时其鳞茎在传统医学中具有止痛、化痰、退热、止咳及解毒等药用价值，含有吸引制药工业关注的特定生物碱。此外，研究表明该物种果实乙醇提取物具有高抗氧化活性，并检出少量芦丁和金丝桃苷成分，其提取物对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌等表现出中等抗肿瘤活性。然而，由于栖息地丧失、人为采挖以及 Bulgaria 地区害虫 Lilioceris faldermanni 的侵害，该物种面临野外灭绝风险，尽管目前被国际自然保护联盟（International Union for Conservation of Nature, IUCN）评估为无危（Least Concern, LC）等级。
贝母属种子的有性繁殖面临严峻挑战，其种子具有强烈的休眠相关性顽拗性（recalcitrancy），种皮虽不足以限制水分吸收，但其休眠机制主要由表观遗传和/或激素机制而非机械因素调控。传统方法从种子培育成熟鳞茎需5至6年时间，繁殖周期极长。因此，开展离体培养研究对于打破种子休眠、实现快速繁殖并支持该物种的保育工作具有重要意义。
研究人员以2022年夏季采自土耳其科贾埃利省 ??narl?dere 休闲区野生种群的黑海贝母成熟种子为材料，经2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTZ）活力检测确认种子活力后，采用70%乙醇及1%次氯酸钠进行表面消毒，接种于添加不同PGR（TDZ、KIN、BAP、IBA、吲哚-3-乙酸即indole-3-acetic acid, IAA、NAA，浓度均为0.25、0.5、1.0、2.0 mg·L
?1）的MS（Murashige and Skoog）培养基上，设置对照（无PGR）。同时设置四种温度处理方案以模拟自然低温打破休眠的过程：短期冷处理（short-term cold treatment, SCT，4°C培养1个月后转23°C培养2个月）、重复短期冷处理（repeated short-term cold treatment, RSCT，4°C、16°C、23°C各培养1个月，循环两次）、中等冷处理（intermediate-term cold treatment, ICT，4°C培养1个月后转23°C培养2个月）及长期冷处理（prolonged-term cold treatment, PCT，4°C培养3个月后转23°C培养）。低温培养期间置于暗处，23°C培养条件下给予60 μmol·m
?2·s
?1冷白光荧光灯照射，光周期16/8 h。
种子萌发及幼苗发育结果显示，所有TTZ检测均为活种子。SCT处理萌发率极低；RSCT处理无论何种PGR处理，萌发率均显著升高，为所有处理中最高；PCT处理萌发率高于SCT和ICT。TDZ 2.0 mg·L
?1配合RSCT获得了最高萌发率（60%）和最高出苗数（0.6株/粒种子），与IBA 1.0和2.0 mg·L
?1效果相当。PCT条件下，BAP 2.0 mg·L
?1获得了最高萌发率（26.7%）。对照组除RSCT外均未萌发。
在幼苗发育方面，RSCT处理获得了最高的幼苗发育水平。TDZ 2.0 mg·L
?1和IBA 0.5-1.0 mg·L
?1获得了最长的芽体。ICT条件下，NAA 2.0 mg·L
?1出苗最多、芽体最长。PCT条件下，BAP 2.0 mg·L
?1出苗最多且芽体最长（1.46 cm）。根系发育在所有处理中均极弱，仅RSCT和ICT条件下的部分处理诱导出微弱根系。籽球形成方面，PCT配合BAP 2.0 mg·L
?1获得了最高产量（0.26个/粒种子）。
对于 organogenesis 研究，研究人员将无根籽球及萌发过程中自发形成的愈伤组织分别进行培养。籽球培养于含TDZ、IBA、NAA（0.5和1.0 mg·L
?1）的MS培养基上，愈伤组织则培养于含KIN（2.0和4.0 mg·L
?1）的MS培养基上，分别培养2个月和6个月。结果显示，对照培养基在2个月后从籽球培养中获得了最高的出苗和生根数；6个月后，0.5 mg·L
?1 TDZ获得了最高出苗数（虽无根系发育），而对照仍保持较高的根系发育。愈伤组织培养中，对照培养基在两个时期均获得了最高的器官形成率和出苗、生根数；6个月后，2.0 mg·L
?1 KIN获得了最高器官形成率，但出苗和生根数显著低于对照。愈伤组织呈白色和黄色，质地疏松。
对于生根研究，研究人员将愈伤组织来源的茎段培养于含IBA（0.5、1.0、2.0 mg·L
?1）的MS培养基中。培养45天后，部分茎段顶端出现叶状结构，基部形成愈伤组织，但2个月后未检测到器官形成。6个月后，2.0 mg·L
?1 IBA获得了最高的根和芽生长（3.13条根/株，根长1.51 cm），而1.0 mg·L
?1 IBA的器官发育最低。0.5 mg·L
?1 IBA获得了最高的籽球产量。
研究人员还进行了炼苗及遗传稳定性分析。所有具有完整器官的无菌苗经透气盖适应1周后，移入无菌椰糠和珍珠岩混合基质（3:1，v:v）中，覆盖塑料袋保湿1个月，在25°C、80 μmol·m
?2·s
?1全光谱LED光照下培养，100%的试管苗成功存活2个月，但部分植株叶片后期失活，鳞茎保持活力。采用ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记对母株及2株随机选取的组培苗进行遗传稳定性检测，UBC-859、866、899三个引物扩增出清晰条带，共获得12条可 scored 条带，片段大小300-1700 bp，所有样品间条带模式一致，表明无遗传变异。
层次聚类分析（hierarchical cluster analysis, HCA）显示，处理方案基于PGR效应和培养时间分为两大聚类。2.0 mg·L
?1 BAP因高萌发率、籽球形成和芽体发育而单独形成主聚类；NAA和TDZ 2.0 mg·L
?1分别因ICT和RSCT期间的高萌发及根芽发育而单独形成亚聚类；低浓度NAA（0.25和0.5 mg·L
?1）聚为最低表现组；IBA 0.5和1.0 mg·L
?1聚为同一亚聚类，对照单独成簇。
在讨论部分，研究人员强调了球根类植物需要长期低温 incubation 以模拟自然环境、打破休眠并启动萌发的特性。RSCT获得更高萌发率的结果表明，黑海贝母需要逐渐升温和长期低温以完成其生活周期，这与前人关于 F. persica 和 F. imperialis 的研究结果一致。TDZ和特定浓度IBA对萌发最有效，而BAP在特定浓度下对籽球形成和芽体伸长的促进作用与其他贝母属物种的报道相符。值得注意的是，对照培养基在愈伤组织和籽球培养中表现出优异的器官发生能力，这可能与MS培养基中内源激素平衡有关，暗示外源细胞分裂素处理对该物种此类外植体并非必要。
研究结论指出，各种PGR及其组合在不同温度培养方案下对黑海贝母种子离体萌发的效果表明，冷处理能有效促进种子萌发，尤其是RSCT（4°C、16°C、23°C各1个月循环两次）方案。最高萌发率通常出现在含2.0 mg·L
?1 TDZ的培养基中。该研究还利用黑海贝母鳞茎外植体自发形成的愈伤组织，证实通过愈伤组织培养可实现该物种的离体繁殖和器官生产。鉴于该物种含有具有重要药用价值的抗氧化化合物，由离体培养鳞茎外植体诱导愈伤组织形成可代表一种既能保育又能生产次生代谢物的有效途径。最后，再生植株应进一步通过冷处理和逐渐升温的方式驯化至土壤条件，这将提高植物在自然环境中的存活率，增加其在自然界中的存在，并支持其长期保育。该论文发表于《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》。
