《Biomaterials Science》：Bioinspired scaffold design using a custom Voronoi path generator for extrusion-based 3D printing
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这篇研究综述的核心在于，作者团队开发了一款名为PyVoroGen的自定义Python软件，专为熔融电流体直写（MEW）和熔融沉积建模（FDM）等基于挤出的3D打印技术生成连续的Voronoi结构路径。该研究成功制造了Voronoi图案支架，并将其与静电纺丝纳米纤维膜结合，构建了多尺度仿肺泡毛细血管屏障（ALI）体外模型，为制造更接近生理环境的生物仿生组织工程支架提供了一种融合数字化设计与混合制造的新策略。
引言
自然界中的系统常呈现出特定的空间排列模式，赋予组织和器官独特的生物学特性与功能。在组织工程领域，生物仿生已成为关键的设计原则，旨在通过复制目标组织的形态、拓扑和力学特征，构建能够精确支持细胞培养和组织特异性功能的工程化微环境。在众多自然空间组织中，Voronoi图案因其能够捕捉空间中相邻单元的不规则但优化的排布而脱颖而出，这种结构在多种生物系统中均有发现，包括肺实质、肝脏小叶和骨小梁，有助于实现高效的空间占据、平衡的表面积-体积比和有效的力学载荷分布。
尽管Voronoi图案在骨组织再生的支架设计中已有应用，但在体外肺泡组织模型的制造中仍是空白。肺泡组织具有高度的结构异质性与不规则的空间组织，以往的研究多依赖于对称几何图形（如规则六边形或球形腔体），未能完全反映其真实的生理结构。本文旨在利用二维Voronoi布局设计仿生的肺泡阵列，结合熔融电流体直写（MEW）和熔融沉积建模（FDM）这两种基于挤出的增材制造技术，以及静电纺丝技术，开发一种更接近生理相关性的体外肺泡模型。
方法
软件概述与架构
本研究开发了名为Voronoi Path Generator（PyVoroGen）的Python软件系统，旨在为挤出式技术生成可复制Voronoi图案的G代码路径，其源代码已在GitHub公开。该软件架构包含四个主要模块。第一模块是图形用户界面（GUI），用户在此设置关键参数，包括种子数量、图案直径、纤维厚度、中心位置、是否添加边框、打印技术（MEW和/或FDM）选择及输出文件格式（STL和/或G代码）。第二模块负责根据设定参数生成Voronoi图案，包括对生成种子的分布进行优化，并生成包含种子分布、图案及孔面积分析（结合设定的纤维厚度）的图形输出。第三模块处理图形转换，将生成的图案转化为图论中的图，并利用相关算法（如求解“中国邮递员问题”）找到连续路径。由于Voronoi图对应的图是非欧拉图，生成的路径会包含重叠线段，这对MEW技术无影响，但需为FDM打印进行后续处理，以避免喷头与已沉积材料碰撞。第四模块则根据用户选择，将生成的路径转换为STL或G代码文件，并生成汇总所有主要参数和可视化结果的PDF报告。
支架制造
使用前述软件生成的G代码制造支架，种子数设定为300，图案直径为13.4毫米。熔融电流体直写（MEW）使用Novaspider v5打印机和0.4毫米喷嘴，以聚己内酯（PCL, 42 kDa）为材料，打印条件为：材料温度90°C，流速10%，打印速度21毫米/秒，喷嘴高度5毫米，电压3.35千伏。熔融沉积建模（FDM）使用3D Bioplotter打印机和0.1毫米喷嘴，同样使用PCL（50 kDa）材料，打印温度为110°C，气压0.9巴，打印速度0.1毫米/秒。在打印出Voronoi图案骨架后，通过静电纺丝在骨架顶部沉积一层由PCL/明胶（80:20 w/w）混合溶液制成的纳米纤维膜，以模拟细胞外基质。软件预测的孔隙率与打印支架的实际测量值进行了对比验证。
细胞培养
将制造的支架安装在12孔Transwell小室上，在空气-液体界面（ALI）条件下进行共培养。在顶面（apical side）以14万细胞/平方厘米的密度接种人肺泡基底上皮细胞（A549细胞）。培养至第7天，在底面（basolateral side）以10万细胞/平方厘米的密度接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。培养至第10天，通过免疫荧光染色（使用VE-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白抗体分别标记内皮细胞和上皮细胞）和扫描电子显微镜（SEM）对细胞培养结果和支架形貌进行评估。
结果与讨论
软件功能
开发的图形用户界面（GUI）允许用户输入自定义参数并选择所需输出。软件在生成图案后，能提供一系列可视化结果，包括优化后的种子分布与对应的Voronoi图案布局、基于颜色的孔面积分布图及其直方图、图案的图论转换与连续路径可视化，以及针对不同打印技术（MEW和FDM）的交互式三维路径预览。该平台克服了现有针对规则几何结构优化的增材制造软件的局限，成功为复杂、不重复的Voronoi图案生成了连续挤出路径。
Voronoi支架制造与表征
通过MEW和FDM两种技术均成功打印了基于Voronoi的图案，证实了软件的有效性。FDM支架在少数节点连接处存在微小缺陷，导致少数细胞融合，但整体骨架结构得以保持。MEW支架成功保持了工艺的连续纤维特性，但在较短的线段上形态保真度有所损失。FDM的平均纤维直径为140.96 ± 11.01微米，MEW为92.01 ± 11.93微米。MEW的纤维直径略大于文献报道值，这主要是由于Voronoi图案的几何约束（短线段、频繁转向）限制了实现稳定喷射和最小化射流延迟的条件。软件预测的孔隙率与实验测量值吻合良好，FDM支架的平均孔隙率偏差为2.2%，MEW为1.7%。FDM支架的平均孔面积为0.213 mm2，MEW为0.270 mm2，这与MEW纤维更细、材料占用面积更小有关。该软件也展示了针对不同参数（种子数、直径）生成和打印支架的通用性。
通过对完整支架的SEM成像分析，证实了纳米纤维在打印的Voronoi骨架上的均匀分布。纳米纤维沿着微纤维的轮廓排布，但在Voronoi孔隙内，它们延伸到微纤维厚度所定义的平面之下，部分桥接了空隙，并与微纤维形成了多个锚定点。这种集成将支架的仿生宏观结构与细胞外基质（ECM）的纳米纤维特征相结合。截面分析显示，整合的静电纺丝膜平均厚度约为3微米，是一种超薄膜。
体外细胞培养表征
所开发的支架成功支持了两种细胞在结构两侧的粘附和增殖，形成了功能性屏障。免疫荧光染色证实了两种细胞在各自区域的定植：A549上皮细胞在膜顶侧高增殖，HUVEC内皮细胞在第7天接种后成功粘附和铺展在底侧。电纺膜的薄度使得在共聚焦成像时可以同时观察到两侧的细胞层，这表明膜可能增强了跨膜细胞交流。共聚焦图像还突出了微纤维结构对顶面细胞三维组织的影响：在微纤维位置对应区域观察到较暗区域，这是因为粘附在纤维上的细胞与生长在更大面积Voronoi孔膜上的细胞处于不同焦平面。在底侧，HUVEC细胞在电纺膜和MEW微纤维上均显示出铺展形态，但在FDM长丝上则呈现更聚集的形态，表明纤维尺寸和拓扑结构可能影响内皮细胞的空间适应。
这项工作引入的肺泡-毛细血管屏障模型提供了更仿生的细胞限制环境（与使用Transwell小室平坦膜的模型相比），并采用了更接近肺泡隔不规则几何形状的复杂Voronoi图案（与依赖规则孔排列的方法相比）。该策略具有技术通用性，可成功应用于MEW和FDM支架。但需指出，本研究中获得的孔尺寸尚未达到生理肺泡尺度，该模型是迈向更精细仿生结构的第一步。
结论
本研究提出了一种结合生物启发设计、定制化制造工具和混合制造方法来开发体外肺泡模型的新策略。利用二维Voronoi图案生成仿生支架布局，复制了原生肺泡组织不规则但优化的几何形状。通过开发基于Python的自定义软件，实现了为熔融电流体直写（MEW）和熔融沉积建模（FDM）生成连续挤出路径，并引入了孔隙率预测工具，减少了支架优化中的试错过程。打印的Voronoi骨架与静电纺丝纳米纤维膜集成，提供了结合增材制造形态保真度与静电纺丝类细胞外基质（ECM）特征的多尺度结构。生物学评估证明该支架支持上皮细胞和内皮细胞在膜两侧的共培养，成功再现了分隔的屏障结构。尽管本研究主要证明了可行性和生物相容性，但代表了探索如何通过提高结构仿生性来增强组织功能性的初步尝试。总体而言，该策略通过结合专门生成的软件来复现Voronoi样生理结构，以及多材料、多工艺技术方法，为组织建模的复杂生物仿生系统设计与制造提供了有前景的进展。
