针对重组腺相关病毒（rAAV）衣壳蛋白翻译后修饰（PTM）谱分析的挑战，特别是针对非纯化工艺中间体的分析难题，研究人员开发了一种结合优化样品制备、基于质谱（MS）的肽图谱分析和PTM分析的稳健工作流程。该研究以纯化的rAAV8样品作为参考标准，实现了超过80%的MS/MS病毒蛋白（VP）序列覆盖率，并对多种PTMs进行了定量分析，包括N端乙酰化、脱酰胺、氧化和磷酸化。该方法表现出高度的重复性和再现性，其批内和批间变异系数分别在5.5%和25.1%的预期范围内。重要的是，研究人员成功将该工作流程应用于不同纯化阶段收集的中试rAAV8样品，揭示了PTM流行率的动态变化，这可能反映了工艺相关效应对衣壳特性的影响。将该方法的适用性扩展到rAAV5样品，证明了其在不同血清型间的稳健性。胁迫研究进一步强调了该方法检测PTM变化的灵敏度，而易于产生人工修饰的消化方案则凸显了优化条件以最小化人为修饰的重要性。总之，这项工作展示了一个多功能分析平台，能够对纯化和中试rAAV样品进行可靠的PTM监测，支持其在基因治疗制造中的产品表征、工艺监测和开发中的应用。

《Journal of Biotechnology》：MS-based workflow for PTM profiling of rAAV capsid proteins to support bioprocess monitoring and development

　　

由于重组腺相关病毒（rAAV）衣壳的翻译后修饰（PTM）因其对载体结构、稳定性和功能的潜在作用而成为关注焦点，然而，rAAV衣壳蛋白的一致且全面的PTM谱分析仍然具有挑战性，特别是对于非纯化的工艺中间体。在此，研究人员报告了一种稳健工作流程的开发和应用，该流程结合了优化的样品制备、基于质谱（MS）的肽图谱分析和针对rAAV分析的PTM谱分析。通过使用纯化的rAAV8样品作为参考标准，研究人员实现了超过80%的MS/MS病毒蛋白（VP）序列覆盖率，并对多种PTMs进行了定量分析，包括N端乙酰化、脱酰胺、氧化和磷酸化。该方法显示出高度的重复性和再现性，无标记位点特异性PTM相对定量的批内和批间变异性分别在预期范围内（分别为5.5%和25.1%）。重要的是，研究人员展示了该工作流程在不同纯化阶段收集的中试rAAV8样品上的成功应用，揭示了PTM流行率的动态变化，这可能反映了工艺相关效应对衣壳特性的影响。将该方法的适用性扩展到rAAV5样品，证明了其在不同血清型间的稳健性。胁迫研究进一步强调了该方法检测PTM变化的灵敏度，而易于产生人工修饰的消化方案则凸显了优化条件以最小化人为修饰的重要性。总之，这项工作展示了一个多功能分析平台，能够对纯化和中试rAAV样品进行可靠的PTM监测，支持其在基因治疗制造中的产品表征、工艺监测和开发中的应用。

论文解读：基于质谱的rAAV衣壳蛋白翻译后修饰谱分析工作流的开发与验证

研究背景、问题与目的

重组腺相关病毒（rAAV）已成为体内基因治疗的主导平台。其二十面体衣壳由VP1、VP2和VP3三种病毒蛋白组成，这些蛋白对于介导细胞进入至关重要。与单克隆抗体（mAbs）类似，rAAV产品的关键质量属性（CQAs）必须符合预定标准以确保安全性和有效性，而监管机构鼓励对生物治疗药物进行扩展表征以识别可能影响产品性能的新属性。翻译后修饰（PTM）作为一种化学修饰，可能发生在生产、纯化或储存过程中，其对rAAV产品性能的影响虽日益受到关注，但尚未被完全阐明。尽管液相色谱-质谱联用（LC-MS）肽图谱已被证明是一种强大的分析方法，但由于rAAV结构和复杂性，其成功实施依赖于稳健的样品制备流程。现有报道多集中于高度纯化的rAAV制剂，而在工艺中间体（in-process）样品中的应用仍然有限，这限制了评估生物工艺步骤如何影响产品质量的能力。因此，本研究旨在开发一种适用于下游工艺不同阶段rAAV中间体的LC-MS肽图谱多属性方法（MAM），以实现对VP序列的高覆盖率鉴定、详细的PTM谱分析以及宿主细胞蛋白（HCP）的检测。

关键技术方法概述

研究人员利用来自iBET内部项目的rAAV样品，在人胚肾（HEK293）细胞中生产，涵盖rAAV8和rAAV5两种血清型及不同下游工艺阶段的样本。核心技术方法包括：优化的样品前处理与酶切消化方案，引入了初始热变性步骤并优化了蛋白与酶的比例；采用数据依赖采集（DDA）模式的LC-MS肽图谱分析，使用ZenoTOF7600质谱仪结合AcQUITY UPLC M-Class系统，分别采用碰撞诱导解离（CID）和电子激活解离（EAD）两种碎裂模式进行互补分析；数据分析使用SCIEX Biologics Explorer软件进行肽段鉴定和PTM相对定量，并利用MSFragger结合人类蛋白质组数据库进行宿主细胞蛋白（HCP）鉴定；此外，还采用了PhyTip柱对高杂质含量的中间体进行小规模亲和纯化，以及通过强制降解实验评估方法的稳定性指示能力。

研究结果

3.1 使用rAAV8纯化样品（标准品）的方法实施

研究人员首先评估了原有用于mAbs的方案，发现其应用于rAAV时MS/MS VP序列覆盖率仅为约73%，且变异性大。通过引入初始热变性步骤、减少总样品体积和优化酶比，优化后的方案使VP1序列的平均MS/MS覆盖率提升至约82%（最高达89%），且复现性提高（标准差SD=4.35%）。利用EAD碎裂技术，研究人员成功鉴定了两个缺乏胰蛋白酶切割位点的长肽段（170–238和333–391），将序列覆盖率进一步提升至约97%。结果表明，Trypsin/Lys-C联合CID碎裂是支持rAAV衣壳蛋白PTM谱分析的最佳组合。

3.2 rAAV8纯化样品的PTM谱分析及方法与精密度评估

通过对纯化样品（Sample P）的四次独立消化分析，评估了方法的精密度。批内（Intra-assay）变异系数（RSD）为0.3%，批间（Inter-assay）RSD为5.6%。PTM分析揭示了多种修饰，包括100%流行的N端乙酰化、脱酰胺（如N56、N262、N513）、低水平氧化（M404、M525、M636 <0.5%）以及磷酸化（S148约为46%）。精密度评估显示，批内平均RSD为5.5%，批间平均RSD为25.1%，这与无标记位点特异性PTM相对定量的预期范围一致。通过与易产生人工修饰的应激消化方案对比，证实了优化方案能有效最小化人为产生的脱酰胺和氧化。此外，对样品进行热应激处理（40°C，0、2、6天）后，该方法能灵敏地检测到随应激时间延长而增加的脱酰胺和氧化水平，证实了其用于稳定性研究的适用性。

3.3 方法在rAAV8工艺中间体样品中的应用

研究人员将优化流程应用于三个代表下游工艺不同阶段的rAAV8中间体样品（A：切向流过滤后；B：捕获层析后；C：阴离子交换层析后）。对于杂质最多的样品A，直接分析仅获得约55%的序列覆盖率，且鉴定出538种HCP。经PhyTip亲和纯化去除HCP后，样品A的HCP降至2种，序列覆盖率恢复至约80%。跨样品PTM谱分析显示，随着纯化进程，脱酰胺水平呈上升趋势，而氧化水平保持稳定。值得注意的是，在阴离子交换层析步骤（Sample C）获得的样品中，S148磷酸化水平显著升高（从~48%升至~62%），这可能与该步骤富集了含基因组颗粒（full particles）有关，因为磷酸化会增加衣壳的负电荷，从而增强其与阴离子交换介质的亲和力。

3.4 方法在rAAV5样品中的跨血清型评估应用

为了评估工作流的广泛适用性，研究人员将其应用于rAAV5工艺样品。结果显示，该方案同样实现了约80%的VP1序列覆盖率。PTM谱分析鉴定出N端乙酰化（VP1和VP3）、脱酰胺（如N55、Q447/N449）、氧化（M623、M634、M670）和甲基化（K393、R436、R482）。其中，R436和R482的甲基化流行率较高（分别为56%和61%）。这一结果证明了该工作流程在不同rAAV血清型间进行PTM谱分析的多功能性和稳健性。

结论与讨论

综上所述，随着rAAV载体在基因治疗中受关注度的提升，建立稳健且全面的生物分析方法对于确保产品质量、安全性和有效性至关重要。本研究表明，rAAV衣壳蛋白中的PTMs会影响载体的稳定性、转导效率和免疫原性，因此在其开发和制造过程中的详细表征是关键步骤。研究人员开发的这一工作流程能够实现对rAAV衣壳蛋白的高重复性、高再现性的肽图谱分析和PTM谱分析。该工作不仅在两种血清型（AAV8和AAV5）的纯化和工艺中间体样品中检测到了包括N端乙酰化、脱酰胺、氧化、磷酸化和甲基化在内的多种新型及已知位点特异性修饰，还能同步鉴定宿主细胞蛋白（HCP），为工艺相关杂质提供了额外的洞察。这项工作凸显了先进生物分析工具的价值，展示了如何深入探究位点特异性PTMs的作用，这对于推动基因治疗领域的发展至关重要。总体而言，该工作流允许直接监测位点特异性PTMs，可应用于下游加工的不同阶段及稳定性研究，从而为指导生物工艺开发的优化（从细胞系开发到下游策略）提供宝贵信息，最终支持生产更安全、更有效的基于rAAV的疗法。该研究成果已发表于《Journal of Biotechnology》。