从延迟采集的临床样本中估算原始细菌负荷：一项方法学建模与实证验证研究

《Journal of Microbiological Methods》：Estimating original bacterial loads from delayed clinical samples: A methodological Modeling and empirical validation study

　　艾哈迈德·达伍德·阿尔·马赫里齐 | 法蒂玛·莫索莱姆 | 雷纳尔德·布伦德尔
马耳他大学医学院与外科系，姆西达，马耳他

**摘要**
**目的**
临床样本（尿液、血液、脑脊液）处理过程中的延迟会导致细菌菌落形成单位（CFU）的失真，因为储存/运输条件的变化，从而导致初始菌量估计不准确和治疗延误。本研究提出并实证验证了阿尔·马赫里齐-莫索莱姆活力校正模型（MM-VCM），这是一种逆向逻辑生长-衰减框架，用于根据延迟观察结果（Nt）反推原始菌量（N?），同时考虑了温度依赖性生长、滞后阶段、衰减和承载能力。

**方法**
MM-VCM采用了一个基于高斯调制倍增时间（在37°C时最佳，标准差为5°C）的封闭形式方程，并将其整合到逻辑动力学中。参数（滞后0.3–0.6小时，衰减0.01–0.013小时?1，承载能力约为10? CFU/mL）来自文献，并应用于八种病原体-基质对（例如，尿液/血液中的大肠杆菌和脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌）。验证过程包括在R（v4.3.1）中进行4000次蒙特卡洛和贝叶斯模拟，模拟时间范围为0–24小时（平均温度25°C，标准差2°C），菌量Nt约为10? CFU/mL，同时进行了Sobol敏感性分析。模型预测结果与使用实际样本组接种物的多中心临床血液培养储存数据集进行了比较。

**结果**
模拟结果显示，N?从t=0时的约10? CFU/mL指数级下降到t=24时的1.3–2.0×10? CFU/mL，95%置信区间从t=2时的约10? CFU/mL扩大到t=24时的超过4×10? CFU/mL。对于≤6小时的延迟，显著菌量（>10? CFU/mL）的概率超过0.99，而脑脊液对表现出更大的稳定性（24小时时为0.89–0.90）。温度是主要的不确定性来源（Sobol指数>0.95），贝叶斯结果非常接近（差异<5%）。在25°C下对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的实证结果表明，模型预测与观察到的检测趋势基本一致，尤其是金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌，为模型的实际应用提供了初步支持。

**结论**
MM-VCM能够高效地进行细菌菌量的预分析校正，适用于重新采样不可行的情况（例如脑脊液、高容量实验室）。针对25°C下的多中心临床血液培养数据集的实证验证表明，模型预测与金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的检测结果基本一致，而大肠杆菌的变异性更大，这支持了该模型在进一步验证前的潜在实用性。

**1. 引言**
临床样本在分析前经常经历储存或运输延迟，这会改变活菌计数，从而增加误分类和延误治疗决策的风险（Begum等人，无日期）。在血液、尿液和组织等基质中，保留和处理过程存在差异，这些差异可能在接种前改变测得的菌落形成单位（CFU）（Wu等人，2017年）。运输和预分析处理过程中的温度控制不一致，导致CFU发生显著变化（Curran等人，2020年）。对于脑脊液，重新采集通常不可行，因此延迟和温度变化会显著扭曲相对于采集时的菌量（Tan等人，2022年；Benninger和Steiner，2018年）。这会大大影响某些不稳定生物参数（如葡萄糖、细胞或某些细胞因子）的检测结果（Tan等人，2022年）。冷链完整性在门诊和运输环境中的表现不一，导致延迟测量的CFU可解释性降低（Pambudi等人，2022年）。快速温度调节也有其自身的挑战和成本，因为它需要制药级设备，而并非所有门诊诊所或办公室都具备（Kartoglu和Ames，2022年）。当样本在没有这些温度控制的情况下运输时，也会出现问题（Benhamza等人，2023年；Kumar和Jha，2017年）。常规的分批处理、取样计划和从现场到实验室的运输时间引入了额外的延迟和温度暴露不确定性（Jefferson等人，1975年）。许多情况下，门诊实验室在周末关闭，样本每天只从临床站点收集一次，位于这些环境中的收集箱更容易经历温度波动（Pambudi等人，2022年）。非紧急样本经常出现处理延迟，进一步使观察到的CFU与初始菌量脱节。由于重复采集通常不切实际，特别是对于侵入性基质，从延迟观察结果校正到初始菌量在临床上非常有价值（Baranyi和Roberts，1994年）。一种能够根据延迟观察结果估计初始细菌菌量的方法，即使时间和温度不确定，也能解决这一关键临床问题。

**已建立的正向模型（如逻辑模型、Baranyi–Roberts模型、Monod模型；温度定律如Arrhenius模型和平方根模型）需要已知的N?和受控条件，并且无法在临床处理不确定性下反推N?（Dey等人，2025年；Kalman，2023年）。标准逻辑模型通过“S”形曲线估计微生物种群增长，已使用多年；然而，它未能考虑快速生长前的滞后阶段（Kalman，2023年）。这个基本模型假设生长速率受到承载能力的限制，因此需要研究者知道所研究样本的初始微生物数量，当这些因素未知时，该模型适用性较差（Kalman，2023年）。然而，Baranyi–Roberts模型考虑了滞后阶段，是一个更灵活的模型，可以准确预测生长（Baranyi和Roberts，1994年；《预测微生物学中的种群增长》[互联网]，2026年）。另一种用于量化细菌生长的模型是标准动力学模型（Monod方程），它基于营养物质的可用性描述了生物体生长速率的限制，并假设底物可用性较低（Monod，1949年）。在这个模型中，通常不包含滞后和衰减阶段。其他模型，如Baranyi–Roberts模型，通常用于研究系统中的滞后和衰减（Rolfe等人，2012年；Koseki和Nonaka，2012年）。该模型准确反映了微生物生长，用于食品安全测试（Dey等人，2025年）。Arrhenius模型和平方根模型是温度依赖模型，与Baranyi–Roberts模型结合使用，以准确预测不同温度条件下的微生物生长（Dey等人，2020年）。Arrhenius模型描述了不同温度下的反应速率；然而，其主要局限性在于它假设速率随温度单调增加（Ratkowsky等人，1982年）。因此，它只适用于生长最佳温度以下的狭窄温度范围（Ratkowsky等人，1982年）。平方根模型旨在通过考虑细菌生长为零的温度来解决这个问题（Dey等人，2020年）。这些模型并非互斥，通常一起使用以确定细菌菌量和这些培养物的生长（Baranyi和Roberts，1994年）。

在病情迅速恶化的患者或最近去世的患者中，能够使用先前收集的样本来确定疾病和感染的治疗或病理生理学将是一个巨大的进步。鉴于这些限制，需要新的工具来扩展或预测原始病理样本的细菌菌量。这将节省患者的费用，在无法重新采集样本的情况下帮助临床医生，并允许患者避免重复的侵入性活检（Schneider等人，2020年）。人工智能和机器学习模型已经开始开发，以解决医学中这一日益重要的问题（B?nisch等人，2025年）。该框架在重新采样不可行时补充了标准诊断方法；假设、验证和局限性在下面详细说明。正向生长模型根据N?预测轨迹，但临床团队通常在延迟t后观察到Nt，并缺乏在滞后、衰减和温度实际不确定性下反推N?的封闭形式方法。

**2. 方法**
**2.1. 模型开发和方程推导**
在诊断微生物学中，临床样本（如尿液、血液或脑脊液）在实验室分析前经常经历储存或运输延迟，这可能导致细菌生长或死亡，从而导致CFU计数不准确，无法准确反映采集时的初始细菌菌量。为了解决这个问题，我们开发了一种新的逆向数学框架，旨在根据后期观察到的CFU计数（Nt）反推初始细菌菌量（N?）。该模型整合了关键生物因素：温度依赖的生长速率、细菌增殖前的初始滞后阶段、由于细胞死亡导致的衰减，以及由于营养限制或废物积累而限制的最大种群大小的基质特异性承载能力。

该模型的基础是逻辑生长框架，常用于描述微生物种群动态，其中生长最初呈指数级加速，但随着种群接近饱和而减缓。我们将其扩展到包括衰减和温度效应，从一个正向微分方程开始，预测细菌种群N随时间的变化：
(1)
dN/dt = rT·N
(1)中的r(T)是温度依赖的内在生长速率（单位：小时?1，表示细菌在理想条件下的分裂速度），K是承载能力（基质可以支持的最大CFU），k是衰减速率（单位：小时?1，表示储存期间的自然细胞死亡）。项(1 - N/K)捕捉了生长速度的密度依赖性减缓。

然而，在临床场景中，我们通常知道Nt（来自实验室接种），需要求解N?，因此需要采用逆向方法。通过解析求解并重新排列这个方程，加入初始滞后阶段λ（在此期间没有净生长，因此有效生长时间dt = max(0, t - λ)），我们得到了核心逆向方程：
(2)
N? = K·Nt·e^k·dt
(2)这个封闭形式方程允许直接计算N?，而无需迭代数值方法，这是相对于仅使用正向模型的标准逻辑模型或Baranyi–Roberts模型的一个关键创新。它优雅地处理了极端情况：如果dt = 0（没有开始生长），N?简化为Nt；如果r(T)接近零（例如在低温下生长极少），则简化为N? = Nt · e^(-k · t)，仅校正衰减（Daughtry等人，1997年；Sharaby等人，2017年）。

温度依赖性嵌入在r(T) = ln(2)/G(T)中，其中G(T)是在温度T（°C）下的倍增时间（每小时分裂次数）。基于实证研究表明，中温病原体在大约37°C时细菌生长达到峰值，并在相对较高或较低温度下对称下降，我们通过高斯函数对G(T)进行了建模（Dey等人，2020年；Mairet等人，2021年）：
(3)
G_T = G_base·exp^(-T/37)
(3)中的G_base是37°C时的最佳倍增时间（人类病原体的峰值），指数产生一个标准差为5°C的钟形曲线，反映了温度变化的典型敏感性。为了确保生物学真实性，G(T)被限制在0.25小时（快速分裂极限）和12小时（极端条件下的缓慢生长）之间。选择高斯模型而不是Arrhenius模型或平方根模型，是因为其简单性以及适用于中温病原体的动力学数据，其中生长在最佳温度附近大致对称。尽管某些生物体的真实温度-生长曲线在最佳温度以上和以下不对称，但这种对称性是一种建模近似。然而，鉴于模拟的临床运输温度（平均25°C，标准差2°C）位于37°C以下的狭窄次优范围内，高斯模型产生的生长速率估计与基本温度模型和平方根模型在该范围内的一致。

方程中的其他保护措施包括将指数上限设为40，以避免极端情况下的计算溢出，并将N?限制在检测限（LOD）10 CFU（低于此值计数不可靠）和K之间，防止非物理结果。对于低菌量样本，当Nt接近LOD（例如≤102 CFU/mL）时，由于参数变异性的累积，反演不确定性自然增加，表现为更宽的可信区间，但分析界限通过将N?限制在10 CFU来确保稳定性，防止负值或零值。

方程(2)的封闭形式特性在随机输入下得以保持，因为Nt被视为来自对数正态分布的随机变量（第2.2节），所有输出都在分析上受到限制。指数上限为40以防止溢出，N?被限制在LOD和K之间，以防止非物理解。这意味着反演稳定性不依赖于迭代收敛，无论输入如何变化。参数化和数据来源
所有参数都是特定于生物体和基质的，并从关于临床样本中细菌动力学的同行评审文献中选取，以确保真实性。我们将该模型应用于八种常见的微生物-基质对，这些对与感染相关：尿液和血液中的大肠杆菌（Escherichia coli）、尿液中的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、脑脊液（CSF）中的脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae），以及血液中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（Sharaby等人，2017年；De Silvestri等人，2018年）。

为了考虑自然变异性，参数来自截断的正态分布：
- 滞后阶段（λ）：0.30–0.60小时，标准差0.08–0.12小时（在环境温度下的适应时间）（Sharaby等人，2017年）
- 基本倍增时间（G_base）：0.28–0.40小时，标准差0.06–0.08小时（最佳分裂速率）（Daughtry等人，1997年）
- 衰减率（k）：0.010–0.013小时^-1，标准差0.004–0.005小时（储存样本中的存活率损失）（De Silvestri等人，2018年）
- 承载能力（K）：8.5×10^8–9×10^8 CFU，标准差5×10^7–6×10^7 CFU（在尿液或脑脊液等基质中的饱和度）（Sharaby等人，2017年）
- 温度（T）：正态分布，平均温度25°C，标准差2°C，截断在10–35°C（环境传输条件）（Dey等人，2020年）
- 观测到的Nt：以10^8 CFU为中心的对数正态分布，变异系数（CV）为15%，模拟实验室计数误差（De Silvestri等人，2018年）

这些分布将现实世界的不确定性转化为N?的估计值，使模型对临床变异性具有鲁棒性。

2.3. 不确定性传播和模拟方法
为了量化参数不确定性如何影响N?的估计值，我们使用了蒙特卡洛模拟（Monte Carlo simulations），这是一种从输入分布中重复抽样的统计技术，以生成输出分布。对于每对微生物-基质，我们进行了4000次迭代：在每次迭代中，抽取参数，通过高斯函数计算G(T)，推导出r(T)，计算dt，并通过逆方程在0到24小时的时间内评估N?，时间间隔为1小时。

为了验证，我们进行了并行贝叶斯模拟（也是4000次抽样），这些模拟使用概率抽样来估计后验分布，并确认与蒙特卡洛结果的平均绝对百分比差异小于0.5%。先验分布是根据文献中提取的（第2.2节），并未使用实验性血液培养数据集进行更新；这种设计选择将实验数据保留为独立的验证集，以防止模型拟合和性能评估之间的循环推理。模拟是在R语言中实现的，高斯函数直接在抽样循环中编码，以计算每个抽取的T的G(T)，然后是r(T)，最后将其代入逆方程。输出包括中位数、95%置信区间（CIs，表示不确定性范围）以及关键延迟（2小时、6小时、12小时、24小时）的总结。为了进一步评估鲁棒性，还在主要模拟范围之外的参数组合下评估了模型，包括接近LOD的Nt值、长达48小时的延迟以及极端温度；封闭形式解在所有测试组合中都保持数值稳定，边界处的可信区间宽度增加反映了复合的生物不确定性，而不是反演失败。完整的R脚本可以在补充附件S1中查看。

2.4. 全局敏感性分析
为了确定哪些参数最影响N?的方差，我们通过Sobol指数进行了全局敏感性分析，这是一种基于方差的方法，可以将输出不确定性分解为每个输入的贡献。我们在2小时、6小时和24小时的延迟下应用了Saltelli抽样（2000次迭代），并在稳定性不足时使用soboljansen作为备用方法。结果表明，温度（通过其对G(T)和r(T)的影响）占主导地位，一阶指数大于0.95，突显了其在模型输出中的关键作用。

2.5. 使用血液培养存储数据的实证验证
公开可用的血液培养存储数据来自Shoklo疟疾研究单位，Mahidol-Oxford热带医学研究单位（Oxford Research Archive，ORA，2019年）（Ling等人，2019年）。该数据集包括在泰国-缅甸边境进行的多中心临床血液培养实验，涵盖了各种病原体，并提供了详细的存储时间和温度元数据。

为了模型基准测试，我们选择了所有包含大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）或肺炎链球菌（S. pneumoniae）的样本组，这些样本在25°C下存储。数据集中的每个组由独特的病原体组合、平均初始接种量（N?）和存储延迟（以小时计）定义。对于每个组，计算了阳性培养物的比例（即在临床时间框架内显示生长的样本），作为实证终点。少于两个重复样本的组被排除在比较分析之外。

通过MM-VCM模型预测了每个组在每个延迟下的存活负荷，模型输入参数（N?、存储时间和温度）与数据集中的实验条件完全匹配。然后将模型预测值缩放到每个病原体组内的最大值，以便与二进制实证终点直接比较。对于每个时间点和病原体，通过皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient）和斯皮尔曼相关系数（Spearman correlation coefficient，分别用于线性和等级关联）以及均方根误差（RMSE）定量评估了模型预测的存活负荷与观察到的阳性比例之间的对应关系。生成了视觉叠加图和表格摘要以说明一致性。所有计算和分析的代码都提供在补充附件S4中。

2.6. 实施、验证和注意事项
完整的MM-VCM建模和验证流程实现为一个可复制的R脚本（种子：20251002，以确保一致性），无缝集成了参数抽样、基于高斯的G(T)计算、逆/逻辑模型评估、模拟程序、实证数据处理和输出生成。对于理论验证，将输出与已知的生物学和文献趋势进行了比较，例如脑脊液（CSF）中预测的衰减率较慢，初步测试显示与正向模拟的准确性在0.1%以内。

实证验证涉及将MM-VCM模型预测与多中心临床血液培养数据（第2.5节）进行基准测试，包括直接的点对点比较、总结拟合指标（皮尔逊相关系数和斯皮尔曼相关系数、RMSE）以及按病原体和延迟组划分的图形叠加图。模型参数N?、延迟和存储温度与每个实验组完全匹配，以确保公平评估。

作为用户的注意事项，报告≥12小时的延迟的95%置信区间需要谨慎解释，因为模型不确定性由于临床和模拟领域中的温度变异性和存储效应而增加。MM-VCM工具适合集成到典型的微生物学工作流程中：用户可以提供观察到的存活计数（Nt）、从样本到分析的延迟（t）、估计的温度（T）以及相关的生长/衰减参数，然后通过模型方程在任何支持的统计环境中计算估计的N?值。

2.7. 软件和可重复性细节
所有模拟都是在R（版本4.3.1）中通过tidyverse、data.table、sensitivity、scales、ggplot2和glue包进行的，用于数据操作、分析和可视化（Wickham，2023年；Barrett等人，2025年；Iooss等人，2025年；Wickham等人，2025a；Wickham等人，2025b；Hester等人，2024年）。实证数据集处理和验证计算同样在R中进行。所有分析都在标准计算环境（MacBook Air，Apple M3芯片，8 GB RAM）中进行，以确保可重复性并最小化硬件依赖性。

3. 结果
蒙特卡洛和贝叶斯模拟各进行了4000次迭代，用于从延迟观察（Nt = 10^8 CFU/mL）估计初始微生物负荷（N?），涉及七种生物体（尿液和血液中的大肠杆菌、尿液中的粪肠球菌、尿液中的肺炎克雷伯菌、脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌、血液中的铜绿假单胞菌、血液中的金黄色葡萄球菌和脑脊液中的肺炎链球菌），并结合了由温度G(T)、滞后阶段（λ）、衰减率（k）和承载能力（K）调节的生长率不确定性。Sobol敏感性分析进一步量化了各种参数对关键延迟（2小时、6小时、12小时和24小时）的N?方差的影响。蒙特卡洛和贝叶斯模拟的完整结果分别可以在补充附件S2和S3中找到。

3.1. 蒙特卡洛模拟结果
蒙特卡洛方法显示，随着延迟的增加，估计的N?呈一致的指数下降趋势，从零小时的近10^8 CFU/mL下降到24小时的约1.3×10^7至2.0×10^7 CFU/mL。这种模式反映了微生物生长和参数不确定性随时间的复合效应，特别是在较长的延迟下可信区间显著扩大。例如，浓度范围从2小时的约8×10^7 CFU/mL增加到24小时的超过4×10^7 CFU/mL。临床显著负荷（N? > 10^5 CFU/mL）的概率保持较高，在2–6小时时平均超过0.99，到24小时时下降到0.80–0.90，其中基于脑脊液的生物体（如脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌）的保留率略高于尿液或血液基质（0.80–0.87）。这些趋势强调了方程在短延迟下的可靠性，但突出了超过12小时后的不确定性增加，可能是因为在液体基质中对生长参数的敏感性增强。（图1；表3。）（见表1，表2。）（见表2。）

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图1. 蒙特卡洛模拟显示了估计的初始存活细菌负荷（N0，CFU/mL，y轴）作为存储延迟（小时，x轴）的函数，4000次运行包含了所有模型参数的不确定性。绘制了中位数和95%可信区间，结果说明了随着延迟增加可检测负荷的下降。

表3. 蒙特卡洛模拟总结。
延迟（小时）
平均N?（CFU/mL）
最小下限CI
最大上限CI
平均概率（N? > 105）
28.04e+07
2.81e+07
1.20e+08
1.00
65.27e+07
1.68e+06
1.04e+08
0.99
8
12
3.26e+07
2.27e+04
8.16e+07
0.97
2
24
1.56e+07
6.96e+00
5.32e+07
0.84
8

表4. 贝叶斯模拟总结。
延迟（小时）
平均N?（CFU/mL）
最小下限CI
最大上限CI
平均概率（N? > 105）
28.05e+07
2.93e+07
1.20e+08
1.00
65.28e+07
1.90e+06
1.03e+08
0.99
9
12
3.25e+07
3.09e+04
8.10e+07
0.97
2
24
1.56e+07
2.30e+00
5.33e+07
0.85
5

表5. 血液培养验证的模型与实证拟合指标总结（25°C）。
病原体
延迟组数量
皮尔逊相关系数
斯皮尔曼相关系数
RMSE
E. coli
13
–0.08
–0.21
0.46
S. aureus
9
0.35
0.47
0.44
S. pneumoniae
7
0.27
0.39
0.31

表1. 变量定义。
变量
符号
描述
单位
来源/注释
初始微生物负荷
N?
时间零点的微生物估计起始浓度
CFU/mL
使用MM-VCM方程从Nt反计算得出
观察到的微生物负荷
Nt
延迟时间t的测量浓度
CFU/mL
在模拟中固定为108 CFU/mL
延迟时间
样本收集和观察之间的时间
小时
从0到24小时模拟
生长率
G(T)
温度调节的生长率
1/h
高斯函数：G(T) = G_base · exp(?(T ? 37)2 / (2 · 52)；先验来自文献
滞后阶段
λ
指数生长开始前的时间
小时
均匀分布（小时）
衰减率
k
微生物衰减率
1/h
正态分布，平均值0.01
承载能力
K
基质支持的最大微生物负荷
CFU/mL
对数正态分布，平均值10^9
温度
T
存储温度
°C
正态分布，大约4°C（冷藏）

表2. 关键假设。
假设
理由
潜在影响
滞后阶段后的指数生长
基于标准微生物动力学模型（例如，Baranyi模型的改编）
如果实际基质中的生长是非指数的，可能会高估N?
参数不确定性遵循指定的分布（例如，G(T)的高斯分布）
来自关于生物体-基质对的实证数据和文献
影响可信区间；敏感性分析确认了鲁棒性
参数（λ、k、K、T）被视为独立的；没有建模协方差结构
简化模型以提高计算效率
如果存在实际世界的相关性（例如，较高温度可能会缩短滞后阶段），可能会低估方差；λ、k和K的低Sobol指数（Si < 0.05）表明在环境条件下，与文献值的适度偏差不太可能显著改变N?估计
在所有模拟中固定Nt = 108
代表常见的临床阳性阈值
限制了对其他观察负荷的普遍性
对每个生物体-基质对进行独立模拟
考虑了生物变异性，没有交叉污染
假设没有共享的环境因素，这在混合感染中可能不成立

表2. 代表性模型与延迟组的实证结果（选定的行）。
病原体
延迟（小时）
平均接种量（N0）
模型Nt
组大小
检测概率
E. coli
6
2.3
4.0
1
0.6
E. coli
12
2.3
1
0.9
9
S. aureus
24
5
2.6
6
3
0
2.4
1
0.5
S. pneumoniae
6
6.5
4
1
0.4
1
3
0.6
9
S. pneumoniae
24
6
5
4
7
1
3

3.2. 贝叶斯模拟结果
贝叶斯模拟利用参数的先验分布，产生的N?估计值与蒙特卡洛结果非常接近，平均差异小于5%，并且在早期延迟时可信区间略微狭窄，表明后验收敛稳健。同样，平均N?值从最初的近10^8 CFU/mL下降到24小时的1.3×10^7至1.9×10^7 CFU/mL，而N? > 105的概率在2–6小时时平均为0.999，在24小时时为0.83–0.90，其中基于脑脊液的生物体（如脑膜炎奈瑟菌）显示出略高的保留率（大约0.89–0.90），而尿液或血液基质为0.80–0.87）。这种一致性表明方程对方法变化具有抵抗力，尽管贝叶斯在较短延迟时（例如，10–15%比蒙特卡洛更紧密）的区间缩小意味着在结合知情先验时精度提高。（图2；表4。）

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图2. 后验贝叶斯分布显示了选定的延迟下的N0（初始负荷），突出了随着延迟增加的不确定性和校正值的分布，使用与图1相同的病原体和参数。

3.3. 敏感性分析结果
Sobol指数表明，温度（T）极大地驱动了N?的方差，一阶敏感性（Si）在所有延迟下超过0.98，总阶指数（Ti）从2小时的0.94增加到24小时的超过0.99，表明随着不确定性的增加而几乎完全主导。相比之下，其他参数的贡献最小：滞后阶段（λ）和基础生长率（G_base）的Si值约为0.05–0.06，而衰减率（k）和承载能力（K）的Ti值小于0.02，对于非温度因素。这突显了温度作为主要的不确定性来源，特别是在延迟时间较长时，其影响会加剧，表明精确的温度控制可以显著减少实际应用中的估计误差。（图3；图4；图5）。下载：下载高分辨率图像（100KB）下载：下载全尺寸图像图3. 在2小时延迟下，关键模型参数（温度、延迟时间、生长/衰减率、承载能力）的Sobol敏感性指数，显示了2000次模拟中N0的方差有多少可归因于每个参数。下载：下载高分辨率图像（100KB）下载：下载全尺寸图像图4. 与图3类似，但针对6小时延迟，显示储存温度对校正后N0值的不确定性影响进一步增加。下载：下载高分辨率图像（100KB）下载：下载全尺寸图像图5. 在24小时储存延迟下，全局敏感性指数（一阶和总指数），表明在延迟时间较长后，温度几乎完全决定了N0估计的不确定性。3.4. 经验验证结果针对25°C下的多中心血液培养储存数据的验证表明，MM-VCM模型的预测结果与观察到的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的检测率基本一致（图6）。尽管实验数据在组间存在显著差异（这是临床数据集的常见特征），但模型成功捕捉到了总体趋势，即所有研究病原体的检测概率随延迟时间的增加而下降。性能指标显示了中等的定量一致性（RMSE 0.31–0.46；Spearman相关性高达0.47；见表5），并与之前的模拟实验结果相当（见表6）。值得注意的是，该模型与金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的数据最为吻合，而大肠杆菌的数据由于检测率的变化较大而显示出更大的散布。下载：下载高分辨率图像（250KB）下载：下载全尺寸图像图6. 经验验证图，比较了25°C下MM-VCM模型的预测结果（蓝色三角形，归一化到组最大值）与观察到的临床阳性血液培养比例（红色圆圈），针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌在连续延迟时间的情况。每个面板代表一种病原体；金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的一致性最强，而大肠杆菌的散布较大，这与该病原体已知的临床变异性一致。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）这些结果为MM-VCM模型在模拟和真实临床场景中的有效性提供了初步的实证支持，建议进一步验证其他病原体和基质。完整的验证输出、详细的表格比较和基础数据文件见补充附件S5和S6。4. 讨论本研究的目的是开发一个模型，即使在环境参数（如时间或温度）波动的情况下也能估计样本的原始细菌负荷。新颖的MM-VCM框架旨在从储存的临床样本中反计算原始细菌负荷（N?）。由于某些样本和细菌可能受到温度和时间波动的影响，导致它们不再适用，因此该模型通过控制这些参数来估计样本的原始细菌负荷。除了模拟研究的结果外，我们还通过25°C下的多中心血液培养储存数据集对MM-VCM进行了经验验证，涉及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。模型对活菌计数和检测概率的预测与多个延迟时间间隔内的实际临床检测率进行了定量比较。虽然在临床环境中，样本采集与分析之间的时间延迟从来都不是理想的，但在患者数量较多的时期这种情况尤为常见（Cherie等人，2024年）。这些时间延迟会导致样本中的细菌负荷与最初采集时发生巨大变化，而MM-VCM模型的一个主要参数就是能够控制时间并在任何延迟之前确定原始细菌浓度。多项模拟实验，包括蒙特卡洛和贝叶斯方法，证实MM-VCM能够可靠地预测活菌负荷随延迟时间的减少，从零小时的约10^8 CFU/mL下降到24小时的约10^7 CFU/mL。当与临床数据进行对比时，这些预测趋势也是可观察到的：在临床相关的延迟时间范围内，实际检测率与模型预测的概率大致匹配，尽管实际数据表现出更大的散布和非均匀性，这是预期之中的。基于脑脊液的病原体（如脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌）在24小时后的保留率略高（约0.89–0.90），而尿液或血液基质则为0.80–0.87。这种方法观察到的趋势表明，当延迟时间较短（即小于12小时）时，我们的模型是可靠的；然而，超过这个时间点后不确定性会增加，这可能是由于多种因素造成的。最重要的是，在这些延迟期间，液体基质中的生长参数被放大。重要的是，实验观察到的检测概率与模型预测有适度的相关性（Spearman相关性高达0.47；RMSE低至0.31），表明MM-VCM能够捕捉到临床相关的方向性趋势，尽管观察到的变异性，特别是对于大肠杆菌，强调了需要在更多临床数据集中进行进一步的实证验证。这些结果为MM-VCM模型在模拟和真实世界临床场景中的有效性提供了初步的实证支持，建议进一步验证其他病原体和基质。完整的验证输出、详细的表格比较和基础数据文件见补充附件S5和S6。4. 讨论本研究的目的是开发一个模型，即使在环境参数（如时间或温度）波动的情况下也能估计样本的原始细菌负荷。新颖的MM-VCM框架旨在从储存的临床样本中反计算原始细菌负荷（N?）。由于一些样本和细菌可能受到温度和时间波动的影响，导致它们不再适用，因此该模型旨在通过控制这些参数来估计样本的原始细菌负荷。除了模拟研究的结果外，我们还通过25°C下的多中心血液培养储存数据集对MM-VCM进行了经验验证，涉及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。模型对活菌计数和检测概率的预测与多个延迟时间间隔内的实际临床检测率进行了定量比较。虽然在临床环境中，样本采集与分析之间的时间延迟从来都不是理想的，但在患者数量较多的时期这种情况尤为常见（Cherie等人，2024年）。这些时间延迟会导致样本中的细菌负荷与最初采集时发生巨大变化，而MM-VCM模型的一个主要参数就是能够控制时间并在任何延迟之前确定原始细菌浓度。多项模拟实验，包括蒙特卡洛和贝叶斯方法，证实MM-VCM能够可靠地预测活菌负荷随延迟时间的减少，从零小时的约10^8 CFU/mL下降到24小时的约10^7 CFU/mL。当与临床数据进行对比时，这些预测趋势也是可观察到的：在临床相关的延迟时间范围内，实际检测率与模型预测的概率大致匹配，尽管实际数据表现出更大的散布和非均匀性，这是预期之中的。基于脑脊液的病原体（如脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌）在24小时后的保留率略高（约0.89–0.90），而尿液或血液基质则为0.80–0.87。这种方法观察到的趋势表明，当延迟时间较短（即小于12小时）时，我们的模型是可靠的；然而，超过这个时间点后不确定性会增加，这可能是由于多种因素造成的。最重要的是，在这些延迟期间，液体基质中的生长参数被放大。重要的是，实验观察到的检测概率与模型预测有适度的相关性（Spearman相关性高达0.47；RMSE低至0.31），表明MM-VCM能够捕捉到临床相关的方向性趋势，尽管观察到的变异性，特别是对于大肠杆菌，强调了需要在更多临床数据集中进行进一步的实证验证。MM-VCM能够有效地从延迟观察中反计算初始负荷，适用于各种条件。在模拟和真实世界样本验证中，模型预测的活菌计数和检测率下降与观察到的临床数据大致相符，考虑到多中心临床数据集的异质性，某些病原体存在一定的变异性是合理的。在蒙特卡洛和贝叶斯模拟中，N?估计值随延迟时间（t）呈指数级下降，从t=0时的近10^8 CFU/mL下降到t=24小时时的1.3–2.0 × 10^7 CFU/mL，95%置信区间从短延迟（t=2小时）时的约10^7 CFU/mL扩大到长延迟时的超过4 × 10^7 CFU/mL，反映了临床运输场景（如环境温度25°C，标准差2°C）中的累积不确定性（Ghosh等人，2014年）。温度波动是对病理样本完整性最大的威胁之一（Obermeyer和Pope，2021年）。这些问题在整个患者治疗过程中都会出现，甚至在样本受到非理想储存条件的影响时也会出现（Kartoglu和Ames，2022年）。在不同温度下，高斯调节的生长率r(T) = ln(2)/G(T) = G_base · exp(?(T ? 37)^2 / (2 · 5^2))会根据偏离37°C的情况（如冷藏（4–10°C）使N?降低多达50%，从而减缓生长，或在室温（20–30°C）下加速生长，这与实际储存情况（如未冷藏的运输箱）相符。Sobol敏感性分析证实了温度的主导作用，一阶指数（Si）>0.95，总指数（Ti）在t=24小时时接近1.00，突显了其关键作用。小的温度波动（±2°C）可能会使N?估计值改变20–30%，强调了在门诊或周末采集时精确记录的必要性。尽管在环境运输条件下（25°C，Sobol Si >0.95），温度主导了N?的方差，但模型中保留的延迟（λ）、衰减（k）和承载能力（K）是故意设置的，并且在生物学上是合理的。在冷藏温度（4–10°C）下，生长率接近零，衰减成为CFU变化的主要驱动因素，提高了k对N?估计的相对贡献。同样，对于具有较长延迟阶段的病原体（如脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌），λ显著延迟了有效生长的开始时间，从而在短延迟时保持了较高的N?估计值，因为在这些情况下仅考虑温度敏感性会导致衰减的高估。承载能力K防止了高接种量样本在接近饱和时的非物理性超调（Nt接近10^9 CFU/mL）。因此，如果仅将模型简化为仅针对温度的校正，则在冷藏运输、高负荷样本和脑脊液基质中会引入系统误差，而这正是该框架所针对的临床关键场景。从生物学角度来看，延迟阶段（λ，0.3–0.6小时）延迟了有效生长时间（dt = max(0, t - λ)），在短延迟时保持了较高的N?（Bertrand，2019年）。衰减率（k，0.010–0.013 h^-1）抵消了活力损失，减少了在压力样本（例如，在环境温度下的血液）中N?的高估，其较低的敏感性（Si <0.05）表明除非估计错误，否则稳定性是可靠的。另一个需要考虑的因素是文献中的参数与实际临床样本中遇到的参数之间的潜在差异。这里使用的延迟阶段、衰减率和承载能力值来自受控的实验室动力学研究，其中条件是标准化的，且没有宿主因素的影响。在临床基质中，由于免疫成分、抗生素残留、pH变化或竞争性菌群的存在，细菌动力学可能会有所不同，这些因素在当前的参数化中没有考虑。λ、k和K的低Sobol指数（Si <0.05）表明，在环境运输条件下，从文献中得出的值的适度偏差不太可能显著改变N?估计值；然而，建议在临床环境中应用MM-VCM的用户在有基于培养的动力学数据时验证本地参数估计值，因为系统偏差（特别是对于生长曲线不典型的病原体）可能会降低校正的准确性。在实际场景中，这些参数使得基于场景的校正成为可能，例如在未冷藏的尿液中，6小时的延迟可能导致N?从10^8 CFU/mL调整到5.3 × 10^7 CFU/mL（概率>10^5：0.998），有助于在没有重新采样的情况下判断细菌尿症的阈值（Baranyi和Roberts，1994年；Hindman等人，1976年）。为了具体说明临床实用性，考虑以下场景：从疑似尿路感染的患者那里采集了一个尿液样本，该样本在运输过程中被储存于约25°C的环境中，8小时后到达实验室。标准接种方法得到的Nt = 1.2 × 10^5 CFU/mL，略高于广泛使用的10^5 CFU/mL的诊断阈值，这通常会提示阳性结果并可能需要开具抗生素处方。应用MM-VCM模型（大肠杆菌参数：λ = 0.5小时，k = 0.011 h^-1，K = 9 × 10^8 CFU/mL，T = 25°C），反计算得到的采集时的N?约为5.4 × 10^4 CFU/mL，低于诊断阈值。在这种情况下，未经校正的延迟结果代表了运输过程中的细菌增殖，而不是采集时的真正显著细菌尿症，可能会导致不必要的抗生素治疗。这个例子表明，MM-VCM校正可以显著改变临床决策，特别是在处理延迟样本时的临界情况。在临床实践中，MM-VCM可以通过提供延迟校正的N?来优化样本处理，从而为抗生素阈值或感染严重程度提供信息，减少在高容量实验室中由于周末延迟而导致的20–30%的样本召回（Lee等人，2022年）。对于研究人员来说，它有助于回顾性分析储存的生物库，使得在败血症或脑膜炎的纵向研究中能够进行真实负荷的荟萃分析，而当前的模型（如Baranyi–Roberts模型）忽略了反向校正。实验室可能会将其整合到非紧急情况的协议中（例如，通过低成本传感器跟踪T），通过避免重新采样可能节省15–25%的成本，特别是对于难以获取的脑脊液样本（Sempionatto等人，2022年）。将经验验证整合进来，使MM-VCM从一个纯粹的理论框架转变为基于真实临床样本性能的工具，使得能够对延迟病例进行回顾性校正，并且随着验证范围的扩大到更多病原体和临床场景，其预测准确性有望提高。MM-VCM模型假设逻辑生长，具有固定的承载能力（K ≈ 9 × 10^8 CFU/mL），单一物种主导，以及均匀的基质（例如，营养丰富的尿液/血液/脑脊液），简化了动态，但可能低估了真实生物膜中的振荡。它补充了而不是替代了标准诊断方法，如立即接种或qPCR，在重新采样不可行的情况下（例如，在病情恶化的患者中）作为回顾性工具。4.1. 局限性虽然MM-VCM模型已经通过25°C下的多中心血液培养数据对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌进行了经验验证，但仍需考虑几个限制。高斯温度模型假设在37°C附近生长动力学大致对称；这一假设对于在次优运输温度范围（20–30°C）内的中性菌株来说是合理的，但对于具有明显不对称热响应的病原体或储存温度高于37°C的样本可能不太适用。当前的验证仅限于单一温度，并依赖于样本量较小和二进制检测端点的数据集，导致拟合指标中等且预测值与观察值之间存在明显散布。模型的假设，如单一物种主导、均匀基质属性和稳定的环境条件，可能会降低其在涉及混合微生物群落、不寻常体液或非标准应力条件下的准确性。MM-VCM旨在作为回顾性校正工具，而不是立即接种或分子计数的替代品，并不解决生物膜形成、多物种相互作用或极端储存波动的所有复杂性。尽管如此，MM-VCM为直接重新采样不可行的场景提供了一种重要的校正策略。在接近 LOD 时，由于测量不精确性和参数传播导致的固有较高不确定性，应谨慎解释校正后的N?估计值。4.2. 未来方向MM-VCM的进一步改进和测试应包括更多样本类型、临床病原体和温度，以扩展其在当前验证设置之外的适用性。在受控的实验室实验中，通过明确设定延迟时间和温度跟踪，对于将模型精度与直接的细菌负荷测量结果进行对比至关重要。扩展到混合感染情况、整合环境传感器数据（例如利用物联网技术进行温度和时间跟踪），以及调整模型中的其他复杂因素，也是重要的研究方向。需要开展定量和前瞻性研究，特别是针对更广泛的样本类型和环境条件，以推广和优化模型的预测能力。在真实世界的诊断实验室中进行的大规模前瞻性研究将有助于验证MM-VCM作为常规校正工具的价值，而自动化校正工作流程的开发将促进其在医疗领域的广泛应用。

**5. 结论**
MM-VCM模型为校正由于储存延迟和温度波动导致的细菌负荷估计偏差提供了一个结构框架。通过对模拟场景和实际血液培养数据集的验证，获得了初步的实证支持：金黄色葡萄球菌（S. aureus）和肺炎链球菌（S. pneumoniae）的数据一致性较好，而大肠杆菌（E. coli）的数据则表现出更大的变异性，这反映了多中心临床数据的固有异质性。MM-VCM在回顾性分析以及重复采样不切实际的临床病例中具有明显优势，能够补充现有的检测方案，并在资源有限的条件下提升结果解读的准确性。随着该模型与实验室工作流程的进一步整合以及在更广泛条件下的验证，其作为精准微生物学领域可靠校正工具的地位将得到进一步加强。

**临床试验注册**
不适用；本研究属于方法学建模和数据分析研究。

**作者贡献声明**
Ahmed Dawood Al Mahrizi：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿撰写、数据可视化、模型验证、软件开发、项目管理工作、方法论设计、概念构建。
Fatima Mossolem：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿撰写、模型验证。
Renald Blundell：撰写 – 审稿与编辑、研究监督、资源协调、方法论指导。

**参与同意**
不适用；本研究未招募新的前瞻性人类受试者。

**出版同意**
不适用；研究中未包含可识别的个人数据。

**伦理审批**
本研究仅限于分析模拟结果和已发布的匿名临床数据集，未对人类受试者、动物或组织进行新的实验，因此无需机构伦理审批。

**代码可用性**
用于模型实现、模拟和统计分析的所有R脚本均包含在补充材料中，可由相应作者提供。

**资金情况**
本研究未获得任何资助。