冷冻荧光扫描电子显微镜：一种针对冷冻断裂植物样品的荧光与电子显微成像新方法

《Journal of Microscopy》：CryoFluorSEM – A new approach for fluorescence and EM imaging of cryofractured plant samples

　　

冷冻扫描电子显微镜（CryoSEM）允许在保持样品水合状态的同时，对大块样品进行制备和详细成像。对于植物生物学而言，冷冻断裂技术能在远超细胞层面的整体器官或生物体的大背景下，提供有关细胞超微结构和组织构造的信息。迄今为止，尚未有方法能够在冷冻断裂面上定位荧光报告基因。研究人员开发的方法是使用一台配备80毫米工作距离和高变焦比的体视荧光显微镜，在样品仍处于冷冻和真空状态时，通过冷冻制备舱的观察窗对断裂面进行成像。研究人员已将此方法应用于观察植物芽尖和幼苗中生长素运输与信号传导的荧光报告基因、年轻花梗中一个表征不清的基因的表达，以及根瘤中表达绿色荧光蛋白（GFP）的固氮根瘤菌。该方法适用于任何具有荧光输出的冷冻保存大块样品，并为基于CryoSEM的成像开展相关性光学-电子显微术（CLEM）奠定了基础。

研究人员开发并验证了一种名为CryoFluorSEM的新技术，该技术将体视荧光显微镜与冷冻扫描电子显微镜（CryoSEM）相结合，实现了对冷冻断裂植物样品进行原位荧光成像与高分辨率电子显微成像的融合。该方法解决了当前相关性显微技术在处理大块冷冻样品时存在的成本高昂或无法兼容等问题，为植物生物学研究提供了在组织、器官乃至整体生物体层面关联基因功能与超微结构的新工具。

植物生物学研究常依赖于荧光标记报告基因来解析植物的生长、环境互作及微生物相互作用。研究人员已经掌握了在模式植物中稳定表达特定波长输出（如绿色荧光蛋白GFP）的遗传工具。然而，一个理想的需求是将感兴趣的荧光输出叠加到冷冻断裂样品的电子显微镜（EM）图像上。现有的关联荧光与EM的技术要么无法容纳大块样品和样本座（如适配光学显微镜的冷冻台），要么成本过高（如用于冷冻透射电镜（CryoTEM）聚焦离子束（FIB）铣削装置的腔内荧光工具）。为解决此问题，研究人员将光学显微镜与CryoSEM集成，在样品进入SEM成像之前，首先通过体视荧光显微镜获取冷冻断裂面的荧光图像。实现此目标的关键要求是显微镜需具备高变焦比和工作距离大于60毫米的物镜，以便透过冷冻制备设备的真空腔室进行观察。断裂碎屑、器官轮廓和平面断裂变化均可用作配准荧光与SEM图像的基准标记。

该研究将CryoFluorSEM方法应用于植物生物学的不同尺度，获得了新的见解。具体应用包括：（i）研究暗处生长幼苗顶端钩中生长素信号传导的荧光读数与超微结构的关联；（ii）利用多色荧光对芽尖深处的细胞进行成像；（iii）定位表征不清的基因（如GALT31A）的表达区域；（iv）对含有荧光标记细菌的根瘤进行荧光成像。

在讨论部分，研究人员指出CryoFluorSEM方法提供了一种利用荧光输出导航冷冻断裂面的新途径，荧光信号可指引后续的SEM成像，或用于筛选在期望位置发生断裂的样品。对于顶端钩，该方法为比较生长素阳性与阴性细胞间的超微结构差异（如细胞壁的精确厚度和结构）提供了可能，并为操控生长素水平、观察其对细胞形态的影响铺平了道路。对于芽尖和根瘤，研究人员能够观察通常难以触及的组织深层区域的细胞和荧光信号。在生物体尺度上，CryoFluorSEM可将成像引导至特定基因的表达位点，以确定其在植物发育中的潜在作用。

目前，荧光与电镜图像的详细叠加仍是一个手动且在成像后进行的过程，耗时可能长达1小时。对于需要快速生成叠加图以指导后续SEM成像的应用，研究人员利用常见的AI工具，通过旋转、缩放和平移等几何变换，实现了相对快速（5-10分钟）且效果良好的图像配准。

该方法具有成本相对较低、易于实施的优点，但也存在局限性：（i）投射在断裂面上的离焦光可能难以确定特征在Z轴上的位置；（ii）不均匀的断裂会导致SEM和荧光图像中均出现离焦区域。研究人员建议，对于前者，可为荧光显微镜增加共聚焦功能（如转盘共聚焦单元）或采集Z轴序列后进行宽场去卷积，以分离断裂平面的信号；对于后者，先进的SEM设备通常具备用于不平整表面的景深扩展模式，而光学显微镜有时也提供景深扩展（EDoF）工具来生成单一的对焦图像。

研究表明，基于冷冻断裂的CryoSEM是一种用于大块材料冷冻超微结构分析的高通量方法。CryoFluorSEM技术保留了这一特性，并提供了额外的荧光信息，用于导航和记录植物亚区域及细胞的生理状态。在植物中，这对于叶片、花朵和木质茎等大型或厚组织器官尤其有用。在生物医学领域，该方法可扩展应用于类器官和组织模型，例如研究标记细胞混合群体与水凝胶的相互作用。