玉米种子中大斑病菌的分子检测：特异性引物的验证及PCR/qPCR检测方法的建立

《Journal of Phytopathology》：Molecular Detection of Exserohilum turcicum in Maize Seeds: Validation of Specific Primers and Development of PCR/qPCR Protocols

　　

研究人员验证了特异性引物并建立了用于常规检测玉米种子中大斑病菌（Exserohilum turcicum）的cPCR/qPCR检测方案。种子与真菌菌落接触不同时间：36、72、108和144小时。随后，将接种的种子与健康种子混合，在400粒玉米种子样本中达到0.25%、0.5%、1%、10%和100%的发病率。引物扩增出大斑病菌的170 bp产物，且不扩增任何其他真菌的DNA。两种技术均能有效检测种子中的真菌。最高的灵敏度是使用cPCR和qPCR技术在种子与真菌菌落接触36小时后发病率为0.5%时。这对应于使用qPCR技术的0.0000147 ng/μL。因此，引物对在cPCR和qPCR检测玉米种子中大斑病菌的方案中是有效的，可用于常规种子健康分析。

玉米大斑病（Northern corn leaf blight, NCLB），也称为 turcicum leaf blight (TLB)，是由子囊菌大斑病菌（Exserohilum turcicum (Pass.) K.J. Leonard & E.G. Suggs，有性阶段为 Setosphaeria turcica）引起的全球性玉米毁灭性病害。该病原菌广泛分布于世界各地玉米种植区，可导致叶片出现长椭圆形灰褐色病斑，严重影响作物产量和品质。种子携带病原菌是作物种植中的重大威胁，因为种子是病原菌存活和传播的重要载体，可能导致病害在田间定殖和扩散。传统形态学鉴定方法因表型特征变异和相似性而不可靠，而基于DNA的分子检测技术如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）能提供更准确、可靠的病原体鉴定。尽管已开发出针对大斑病菌的特异性引物用于叶片检测，但尚未应用于种子检测。因此，研究人员开展了本研究，旨在验证引物特异性并建立cPCR/qPCR检测方案，以实现对玉米种子中大斑病菌的快速、准确检测，为种子健康分析和病害防控提供技术支持。该研究发表于《Journal of Phytopathology》。

研究人员为开展研究使用了以下主要关键技术方法：大斑病菌菌株CMLAPS 805来源于巴西圣保罗生物研究所（Biological Institute of S?o Paulo）；玉米杂交种RB9006PRO由Riber KWS公司提供，对NCLB易感。种子采用水调质法（hydric conditioning method）接种，通过将种子与真菌菌落接触不同时间（36、72、108、144小时）获得不同发病率水平（0.25%、0.5%、1%、10%、100%），样本量为400粒种子。DNA提取使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Wizard Genomic DNA Purification Kit）。检测采用Chung等人（2010）设计的特异性引物对（5′-TCTTTTGCGCACTTGTTGTT和5′-CGATGCCAGAACCAAGAGAT），进行cPCR和qPCR分析。cPCR在Multigene热循环仪上进行，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳评估；qPCR在Rotor-Gene 6500热循环仪上进行，使用SYBR Green染料。

在研究结果部分，首先，研究人员通过cPCR验证了引物的特异性和灵敏度。引物特异性扩增出大斑病菌的170 bp DNA片段，与其他常见玉米种子真菌如Stenocarpella maydis、Fusarium verticillioides、Rhizoctonia solani和Colletotrichum graminicola无交叉反应，证实了引物的特异性。灵敏度测试显示，引物可检测到从14.7 fg/μL到147 ng/μL的DNA浓度。在种子检测中，当接种时间为36小时时，检测限为0.5%发病率；而在72、108和144小时时，可检测到0.25%的发病率，表明cPCR方案能有效检测不同水平的感染。其次，通过qPCR进一步评估引物性能。标准曲线线性良好（r² = 0.99），扩增效率为1.03。qPCR能够检测所有发病率水平的大斑病菌DNA，除了接种36小时时0.25%发病率样本。最低检测DNA浓度为3.42E-07 pg/μL，对应0.5%发病率（36小时）。这证实了cPCR和qPCR方案在种子健康检测中的高效性和灵敏度，可用于定量分析。

讨论部分，研究人员指出cPCR和qPCR使用验证的引物对表现出高特异性和灵敏度，能够有效检测玉米种子中的人工接种大斑病菌，发病率低至0.5%（36小时接触时间）。然而，对于接种36小时后0.25%发病率的样本，两种技术均无法检测，这可能通过生物富集（Bio-PCR）方法解决，即先在种子上培养病原体再进行DNA提取和扩增，以提高检测灵敏度。分子检测技术已广泛应用于多种作物种子病原体检测，如Rhynchosporium secalis在大麦、Stenocarpella sp.在玉米等，因其精确、快速且特异性高。结合生物和分子方法可能是种子健康分析的最佳策略。该研究建立的cPCR/qPCR方案为玉米种子大斑病菌的常规检测提供了可靠工具，有助于加强植物检疫控制，预防病害传播，保障玉米产量和品质。研究结论部分：验证的引物对在cPCR和qPCR协议中有效检测玉米种子中的大斑病菌，可用于常规种子健康分析。