用于禽类田间样本新城疫病毒通用检测与毒力分型的高灵敏度多重实时RT-PCR技术

《Poultry Science》：High-Sensitivity Multiplex Real-Time RT-PCR for Universal Detection and Virulence Typing of Newcastle Disease Virus in Poultry Field Samples

　　

新城病病毒（NDV）尽管疫苗接种广泛，但由于遗传多样且强毒的Class II毒株的出现，仍然是全球家禽生产的主要威胁。研究人员开发并验证了一种一步法多重实时RT-PCR检测方法，能在单个反应中同时实现所有Class II NDV基因型的通用检测以及强毒（速发型/中发型）与非强毒（缓发型/无症状型）致病型之间的区分。该检测方法显示出高分析灵敏度，对血凝素-神经氨酸酶（HN）靶标的检测下限为10^1.0 EID₅₀/0.1 mL，对融合（F）蛋白靶标的检测下限为10^2.0 EID₅₀/0.1 mL；使用质粒标准品时，检测限分别为10拷贝数/管和100拷贝数/管，并且与非靶标禽病毒无交叉反应。当对从多个大洲、跨越75年（1946-2021年）收集的97个田间分离株和7个参考毒株进行评估时，该检测方法与四种已建立的分子检测方法结果100%一致。所有80个具有多碱性F蛋白裂解位点基序（112RRQKRF117， 112RRRKRF117， 112KRRKRF117和112RRQRRF117）的分离株在两个靶标上均呈阳性，而那些具有单碱性基序（112GKQGRL117和112GRQGRL117）的分离株仅被通用HN检测法检出，这与非强毒表型相符。该检测方法检测了跨越超过75年病毒进化的NDV谱系，从历史毒株（Herts 33/56， Kr-KJW/49）到近期分离株（UPM/1051/2018， UPM111），捕捉了完整HN基因中高达23.7%的核苷酸差异和F基因中13.4%的差异。该平台将广谱检测与精确的毒力区分相结合，为Class II NDV的监测、疫情应对和疫苗株监控提供了一个快速、灵敏且可靠的工具。

**新城疫病毒通用检测与毒力分型多重实时RT-PCR技术的开发与验证**

**研究背景与意义**
新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV，又称禽副粘病毒I型，APMV-1）引起的一种严重跨境禽类疫病，对家禽和野鸟均造成高发病率与死亡率，给家禽业带来重大经济损失。NDV根据其遗传多样性主要分为Class I和Class II两大类，其中引起家禽严重疾病的主要是Class II毒株，其包含21个基因型和5种致病型（内脏速发型、神经速发型、中发型、缓发型和无症状型）。世界动物卫生组织（WOAH）和欧盟（EU）仅将速发型和中发型致病型列为须通报疾病，因其能导致严重疾病和重大经济损失。传统的毒力判定依赖于一日龄雏鸡脑内致病指数（ICPI）测定（>0.7）或F蛋白裂解位点是否存在多碱性氨基酸基序（112(R/K)-R-Q-(R/K)-R↓F117）。然而，ICPI检测耗时费力，需要活病毒分离并在生物安全条件下对雏鸡进行脑内接种。因此，分子诊断，特别是逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时RT-PCR，已成为快速NDV检测的重要工具。尽管已有多种实时RT-PCR方法被开发用于NDV检测和致病型分型，但面对不断进化的Class II分离株的显著遗传多样性，仍需能够广泛覆盖且可靠区分毒力的优化检测方法。特别是在韩国等将ND列为法定管控疫病的国家，快速确诊对动物植物检疫局（APQA）至关重要。因此，本研究旨在开发并验证一种能够在单一检测平台上同时检测所有Class II NDV基因型并区分强毒与非强毒致病型的多重实时RT-PCR方法。

**关键技术方法**
研究人员首先通过生物信息学分析，从NCBI GenBank数据库获取代表Class II所有基因型的HN和F基因全长序列进行比对，设计了针对HN基因的通用引物/探针和针对F基因多碱性裂解位点的毒力特异性引物/探针。随后，优化了包含这两种靶标的一步法多重实时RT-PCR反应体系，在QuantStudio 5实时PCR系统上进行扩增。为评估方法性能，研究人员构建了包含Kr005（强毒）和LaSota/46（缓毒）毒株HN和F基因片段的pGEM-HN和pGEM-F标准质粒用于灵敏度与标准曲线分析。特异性测试使用了包括APMV-1（强毒和缓毒）、其他APMV血清型（2-9型）以及多种非靶标禽病毒（如禽流感病毒H9N2、传染性支气管炎病毒等）的RNA面板。此外，为了全面验证检测方法的适用性，研究人员收集并测试了一个包含97个田间分离株和7个参考毒株、跨越75年（1946-2021）、来自多个大洲的NDV样本面板，以及2023年从越南自然感染禽类采集的14份临床组织样本。所有分离株均通过鸡胚接种增殖，并通过血凝试验确认病毒存在。该多重检测方法的诊断性能通过与四种已建立的参考分子检测方法（两种RT-LAMP法和两种常规RT-PCR法）进行比较来验证，并通过测序分析F蛋白裂解位点基序和构建基于HN及F基因全长序列的系统发育树来确认毒力分类和评估遗传覆盖范围。

**研究结果**
1. **多重实时RT-PCR检测方法的建立**：研究人员成功开发了一种一步法多重实时RT-PCR检测方法。该方法使用FAM标记的探针靶向HN基因实现NDV通用检测，使用HEX标记的探针靶向F基因多碱性裂解位点实现毒力特异性扩增。在优化条件下，无引物二聚体或非特异性扩增，并能准确检测和区分代表性强毒（Kr005）和缓毒（LaSota/46）APMV-1毒株。
2. **检测方法的特异性**：使用13种非靶标禽病毒（包括APMV-2至-9、AIV H9N2等）的RNA进行测试，未观察到任何交叉反应，表明该方法对NDV RNA具有高度特异性。
3. **检测方法的灵敏度与重现性**：使用病毒RNA测试时，对HN靶标的检测下限为10^1.0 EID₅₀/0.1 mL，对F靶标为10^2.0 EID₅₀/0.1 mL。使用质粒标准品时，HN和F基因的检测限分别约为10拷贝数/管和100拷贝数/管。标准曲线在八个数量级范围内呈现优秀线性（R2 = 0.998），PCR效率分别为100.2%（HN）和104.7%（F）。批内和批间变异系数（CV）均低于1%，表明方法具有高精密度和重现性。
4. **NDV样本面板的遗传特征**：对97个田间分离株的F蛋白裂解位点（第112-117位残基）测序揭示了六种不同的基序：RRQKRF、RRRKRF、KRRKRF、RRQRRF（均为多碱性，与强毒相关）以及GKQGRL和GRQGRL（均为单碱性，与非强毒相关）。基于HN和F基因全长的系统发育分析将分离株分别归类到不同的类群（A、B、D、E、F）和Class II基因型（I、II、V、VII、IX、XI、XX）中，其中基因VII型进一步分为亚基因型VII.1.1、VII.1.2和VII.2。成对核苷酸距离分析显示，所有田间分离株间完整HN基因序列的最小一致性为76.3%，强毒分离株间完整F基因序列的最小一致性为86.6%，体现了流行NDV谱系间显著的遗传多样性。
5. **对遗传和地理多样性NDV面板的验证**：使用新开发的多重检测方法测试104个NDV分离株（97个田间株+7个参考株）面板，所有80个携带任一种多碱性基序的分离株在HN和F靶标上均呈阳性，而24个携带单碱性基序的分离株仅HN靶标呈阳性。这些结果与四种参考分子检测方法（RT-HN-LAMP、RT-F-LAMP、NDV-HN-PCR、NDV-F-PCR）的结果100%一致。此外，对14份越南临床样本的分析显示，12份样本在HN和F靶标上均呈阳性（鉴定为强毒亚基因型VIIh毒株），2份样本仅HN靶标呈阳性（鉴定为基因II型疫苗株），证明了该方法在田间实际样本中的应用能力。

**讨论与结论**
新城疫病毒在全球持续流行，反复发生的疫情凸显了对快速、准确诊断工具的迫切需求。尽管已有多种分子诊断工具，但它们在面对当代毒株遗传多样性、检测通量或操作流程整合方面存在局限。本研究开发的一步法多重实时RT-PCR检测方法成功解决了这些挑战，实现了在单一反应中同步进行NDV通用检测和毒力分型。该方法具有高灵敏度、高特异性，并能有效检测跨越超过75年进化历史、具有高达23.7%（HN基因）和13.4%（F基因）核苷酸差异的广泛NDV遗传谱系。重要的是，该方法在针对包含来自全球不同地区（如尼日利亚、意大利、波兰等）毒株的国际能力验证（PT）项目中表现出100%的一致性，证明了其对全球流行毒株的广泛适用性。对越南临床样本的成功检测进一步证实了其在真实疫情场景下的现场应用价值。

**研究结论**：研究人员开发并验证了一种高灵敏度、高特异性的多重实时RT-PCR检测方法。该方法能够在一个反应中同时实现所有Class II新城疫病毒基因型的通用检测以及强毒与非强毒致病型的可靠区分。该平台整合了广谱检测与精确的毒力鉴别，为Class II NDV的监测、疫情快速响应和疫苗株监控提供了一个快速、灵敏且可靠的实用工具。