《Results in Chemistry》：Impact of the extraction methods on quality of oils and extracts from
Zanthoxylum armatum DC. seeds as natural therapeutics against oral pathogens
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本研究探讨了常规与超临界流体萃取(supercritical fluid extraction, SFE)方法对竹叶花椒(Zanthoxylum armatum DC.)种子精油(essential oil, EO)、超临界流体萃取油(supercritica
本研究探讨了常规与超临界流体萃取(supercritical fluid extraction, SFE)方法对竹叶花椒(Zanthoxylum armatum DC.)种子精油(essential oil, EO)、超临界流体萃取油(supercritical fluid extracted oil, SCFE)、水甲醇提取物(hydromethanolic extract, HME)及己烷提取物(hexane extract, HE)得率、化学组分及抗微生物活性的影响。为优化油脂和提取物中的植物代谢物，研究人员建立并验证了可靠的GC–MS/MS方法。GC–MS/MS结果显示，EO含最多挥发性成分，以单萜烃、倍半萜烃、单萜类及苯丙素类化合物为主；而SCFE油中脂肪酸含量显著更高(50.64%，w/w)。采用微量肉汤稀释法与革兰氏染色法评估各样品对口腔病原菌(变形链球菌 Streptococcus mutans、发酵乳杆菌 Lactobacillus fermentum、嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus 及白色念珠菌 Candida albicans)的抗菌及抗生物膜性能。结果表明，各油脂和提取物均呈剂量依赖性抗菌活性(MIC50)。本研究强调了绿色与常规提取技术对竹叶花椒种子提取物质量的影响及其应用潜力。
论文解读：提取方法对竹叶花椒（Zanthoxylum armatum DC.）种子油脂及提取物品质及其抗口腔病原菌活性的影响
本文发表于《Results in Chemistry》。竹叶花椒（Zanthoxylum armatum DC.）为芸香科传统药用植物，其种子富含萜类、生物碱及脂肪酸等次级代谢产物，在阿育吠陀医学中常用于缓解牙痛及消化不良，且具抗菌、抗氧化等活性。然而，已有研究多关注不同溶剂提取物的化学成分，尚未系统比较超临界CO?萃取（一种绿色先进提取技术）与常规水蒸气蒸馏及溶剂萃取法对同种原料——竹叶花椒种子——所得产物的得率、特征化学谱图（挥发性单萜与脂肪酸组成）及针对致龋口腔病原菌（变形链球菌、乳杆菌属及白色念珠菌）的抑菌和抗生物膜效力的差异，也缺乏经ICH指南验证的高灵敏度GC–MS/MS定量方法对该类样品中标志性成分（柠檬烯limonene、芳樟醇linalool）的质控分析。因此，研究人员开展此项对照研究，旨在明确不同提取工艺对提取物化学属性及生物活性的调控作用，为天然植物源口腔护理制剂的原料加工提供实验依据。
研究人员采集印度北阿坎德邦Dharchula产竹叶花椒成熟种子（凭证标本No.967），粉碎后分别采用：(1) 水蒸气蒸馏法(hydrodistillation)制取精油(EO)；(2) 己烷及甲醇:水(70:30 v/v)浸提制得己烷提取物(HE)与水甲醇提取物(HME)；(3) 超临界CO?萃取(supercritical CO? extraction, SCFE，萃取器条件350 bar/75 °C，CO?循环压力55±5 bar/40 °C，22 h)制得SCFE油。采用经ICH Q2(R1)验证的三重四极杆气相色谱–质谱(GC–MS/MS)进行定性（HP-5MS柱）与定量（选择离子监测SIM模式，以柠檬烯m/z 79.0为定量离子、68.0为定性离子；芳樟醇m/z 71.0为定量离子、93.0为定性离子）分析主要挥发性标志物，并通过甲酯化后GC–MS/MS(HP-88柱)分析脂肪酸甲基酯(FAME)谱。以标准菌株（MTCC来源的S. mutans 497、L. acidophilus 1037、L. fermentum 903及C. albicans 183）采用CLSI标准微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度MIC50，以结晶紫(crystal violet, CV)染色法定量评价对已形成生物膜的破坏率，并辅以革兰氏染色镜检。
3.1. Extractive yields（提取物得率）
水蒸气蒸馏法得率为2.34%(w/w)，SCFE油得率最高达18.89%(w/w)，己烷提取物为12.84%(w/w)，水甲醇提取物为20.0%(w/w)。结论：SCFE较水蒸气蒸馏显著提高非挥发性脂类提取效率，溶剂提取的水甲醇体系因溶出极性成分而得率最高。
3.2. Qualitative analysis of extracts and oils from Z. armatum seeds using GC–MS/MS method（GC–MS/MS定性分析）
EO检出7种挥发性成分，以柠檬烯(38.75%)和芳樟醇(44.84%)为主，含β-水芹烯、β-蒎烯、α-松油烯、(E)-甲基肉桂酸酯及石竹烯；SCFE油与HE均含其中5种（缺α-松油烯与石竹烯），HME中未检出挥发性成分。结论：水蒸气蒸馏最利于富集热稳定挥发性单萜/倍半萜，SCFE与己烷可部分保留单萜但损失含氧单萜氧化物及倍半萜，极性甲醇/水体系几乎不萃出挥发油。
3.3. Validation of GC–MS/MS method for the quantification of limonene and linalool（GC–MS/MS定量方法学验证）
系统适用性RSD＜2%（柠檬烯1.53%，芳樟醇1.39%），专属性良好无溶剂干扰，线性范围柠檬烯0.16–50 μg/mL(r=0.9999)、芳樟醇0.33–50 μg/mL(r=0.9993)，LOD分别为0.05与0.10 μg/mL，LOQ分别为0.16与0.33 μg/mL，日内/日间精密度RSD≤3.05%，加标回收率94.60%–103.99%，耐受柱流速±5%及柱温±2 °C波动。结论：所建GC–MS/MS/SIM法专属、准确、精密、稳健，适用于Z. armatum种子精油中标志单萜的质控定量。
3.4. Quantitative analysis of Z. armatum seeds extracts and oils using GC–MS/MS method（标志性成分定量分析）
EO中柠檬烯8.66%(w/w)、芳樟醇45.30%(w/w)；SCFE油中分别为5.70%、3.31%；HE中分别为2.69%、1.52%。结论：水蒸气蒸馏最利于保留及浓缩芳樟醇等含氧单萜，SCFE与己烷提取导致热敏感/极性单萜类物质部分丢失。
3.5. Identification of fatty acids from Z. armatum extracts and oil using GC–MS/MS analysis（脂肪酸谱分析）
鉴定出棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)及亚麻酸(C18:3)。总脂肪酸含量SCFE油(50.64% w/w)＞HE(38.46% w/w)＞HME(14.94% w/w)，其中棕榈油酸为最优势脂肪酸。SCFE油中饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)及多不饱和脂肪酸(PUFA)总量均最高。结论：超临界CO?萃取可有效富集种子中的中性脂质与不饱和脂肪酸，常规溶剂提取己烷亦可部分提取脂肪酸，水甲醇提取主要溶出极性非脂溶性成分。
3.6. Anti-microbial and anti-biofilm activities against plaque-forming cariogenic oral pathogens（抗微生物及抗生物膜活性）
MIC50（mg/mL）：EO对C. albicans、L. acidophilus、L. fermentum、S. mutans分别为83.00、10.24、13.78、3.33；SCFE油分别为0.32、4.58、13.85、3.76；HME分别为2.45、110.60、11.31、73.77；HE分别为9.18、130.70、49.51、101.50。抗生物膜实验显示EO与SCFE油可清除已成型生物膜（S. mutans分别约48%与＞50%，L. acidophilus分别53%与39%），HME与HE清除率＜25%。结论：富含挥发性单萜的EO对革兰氏阳性致龋菌具良好抑制效果，SCFE油因高含量不饱和脂肪酸及残留单萜对白色念珠菌及细菌均有较强抑制，且二者具明显抗生物膜破坏作用；HME与HE活性较弱。
3.7. Biofilm formation capacity of oral pathogens（病原菌成膜能力评估）
S. mutans 48 h达最大中等强度成膜(OD/ODc=3.21)，L. fermentum 48 h弱成膜(1.67)，L. acidophilus 72 h弱成膜(1.34)，C. albicans 96 h中等成膜(2.12)。结论：所选菌株均具可检测成膜能力，满足后续抗生物膜测试模型要求。
3.8. Anti-biofilm activity against the oral pathogens（抗生物膜活性详述）
经MIC50浓度处理预成型生物膜，EO与SCFE油组可见明显生物膜基质减少及活菌数下降（革兰氏染色镜检印证），效果接近阳性对照红霉素（抗细菌）与两性霉素B（抗真菌）；HME与HE无明显破坏作用。结论：Z. armatum种子经水蒸气蒸馏或SCFE所得油脂可通过干扰菌斑生物膜发挥潜在防龋作用。
讨论与结论（翻译浓缩）
Zanthoxylum armatum DC.为具医药、化妆品及口腔护理开发价值的芳香植物。本研究对比了超临界流体萃取与常规（溶剂萃取及水蒸气蒸馏）法对种子提取物得率、化学组成（经验证之GC–MS/MS法表征挥发性单萜及脂肪酸谱）及抗口腔病原菌（S. mutans、Lactobacillus spp.、C. albicans）活性的影响。研究发现：EO含最丰富的挥发性单萜（柠檬烯与芳樟醇为主），SCFE油含最高的总脂肪酸(50.64% w/w)；SCFE油较其他提取物略优的MIC50值及抗生物膜清除率表明绿色超临界萃取技术在获取兼具抑菌脂类方面具优势，而水蒸气蒸馏更适合获取高纯度抗菌挥发性精油。优化提取工艺可提升产物得率与特征活性成分含量，有利于其在草本口腔护理制剂、食品、化妆品及制药工业中的应用。
