使用LC-Q-TOF MS结合MSALL技术对卒中患者脑脊液中完整糖胺聚糖的定量分析

《Talanta》：Quantitative analysis of intact glycosaminoglycans in cerebrospinal fluid of stroke patient using LC-Q-TOF MS coupled with the MSALL technique

　　

糖胺聚糖（GAGs）是不同硫酸化程度的线性多糖，是内皮糖萼的关键结构成分。内皮糖萼有助于维持血脑屏障（BBB）的完整性；然而，其降解或脱落会导致BBB功能障碍。理解GAG水平与BBB功能障碍之间的关系需要一种稳健、高通量的GAG定量策略。在以往使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的研究中，GAGs通常需要先经酶解或化学解聚为二糖后再进行分析。完整GAGs具有异质性分子量、多样的硫酸化模式和多重电荷态，使得直接质谱分析具有挑战性。为克服这些挑战，研究人员采用了基于MSALL的液相色谱-三重四极杆/飞行时间质谱（LC-Q-TOF MS）技术。据研究人员所知，这是首次在不经化学或酶解的情况下对完整GAGs进行LC-MS/MS定量。此外，研究人员开发了一种独特的样品前处理方法，包括浓缩后经苯酚和二氯甲烷萃取，以克服GAGs与蛋白质之间的静电相互作用。方法验证显示，GAGs在50–5000 ng/mL浓度范围内呈线性检测关系，检测限（LOD）为20 ng/mL，定量下限（LLOQ）为50 ng/mL。作为原理验证，对83例卒中患者和42例对照受试者的脑脊液（CSF）分析显示，卒中组GAG水平升高，在区分卒中引起的BBB功能障碍与对照组方面，特异性达83.13%，敏感性达76.19%。这些发现表明，GAG定量可作为糖萼脱落的有效衡量指标，且GAG可能代表一种潜在的BBB功能障碍生物标志物。

**论文解读：基于LC-Q-TOF MS结合MSALL技术对卒中患者脑脊液中完整糖胺聚糖的定量分析**

**研究背景**
血脑屏障（BBB）保护大脑免受体循环影响并维持神经稳态。内皮糖萼是覆盖于内皮细胞腔表面的一层富含碳水化合物的结构，是维持BBB完整性的关键组成部分。糖萼脱落会导致BBB功能破坏，而防止其降解有助于维持屏障稳定性。糖胺聚糖（GAGs）是构成糖萼主要结构的线性多糖，其中硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸软骨素（CS）和硫酸皮肤素（DS）在内皮糖萼中含量最丰富。糖萼降解会将其成分（尤其是GAGs）释放到循环系统中，因此循环GAG水平可以作为衡量糖萼脱落的指标，可能反映BBB损伤程度。在严重卒中情况下，广泛BBB破坏会导致大量渗漏，提示GAG水平可用于监测卒中患者BBB损伤的严重程度。然而，现有GAG定量方法存在局限性：比色法易产生假阳性或假阴性；酶联免疫吸附试验（ELISA）成本高；高效液相色谱（HPLC）需繁琐的酶解步骤，且常用LC-MS/MS方法需将GAGs酶解或化学解聚为二糖，处理时间超过1.5天，限制其高通量应用。因此，开发一种简单、可重复、成本效益高的完整GAG定量方法对于准确评估卒中患者BBB损伤至关重要。论文发表在《Talanta》。

**研究方法**
研究人员开发了一种基于MSALL技术的液相色谱-三重四极杆/飞行时间质谱（LC-Q-TOF MS）方法，直接对完整GAGs进行定量分析，无需化学或酶解步骤。关键核心技术包括：①采用MSALL模式，对所有前体离子进行碰撞诱导解离（CID），高效产生GAG特征碎片离子（m/z 282.0289用于定量，m/z 458.0610用于确证），并利用Q-TOF的高分辨率（质量误差<5 ppm）和窄质量提取窗口（MEW ±10 mDa）提高选择性；②开发新型样品前处理方法：通过乙腈沉淀使GAGs与蛋白质共沉淀浓缩，再用Tris饱和苯酚萃取将GAGs从蛋白沉淀中释放至水相，随后用二氯甲烷去除残留苯酚，避免对质谱信号的抑制；③采用亲水相互作用液相色谱（HILIC）柱，以含0.1% NH₃的乙腈/甲醇（95/5）和水为流动相进行梯度洗脱，分离HS、CS和DS。样本队列来源：来自吉林大学第一医院2024年7月至2025年8月期间的83例卒中患者（40例脑出血、18例脑梗死、25例蛛网膜下腔出血）和42例白血病对照患者的脑脊液（CSF）样本。

**研究结果**

**3.1 GAGs的质谱特征**
通过直接进样分析HS、CS和DS标准品，发现当碰撞能量（CE）升高至-40 eV时，产生一系列特征碎片离子，包括m/z 175.0248（脱氢-糖醛酸）、282.0289（脱氢-GalNAc/GlcNAc + S）、300.0395（GalNAc/GlcNAc + S）、370.0449（双电荷脱氢-UA + 2GalNAc/GlcNAc + 2S）和458.0610（脱氢-UA + GalNAc/GlcNAc + S）。与源内CID相比，MSALL方法产生的碎片离子信号强度高约27倍，表明在碰撞池中GAGs的碎裂效率更高。

**3.2 MSALL分析**
MSALL模式下，所有前体离子经Q1进入Q2进行CID，TOF分析器在m/z 100–500范围内以0.075 s周期采集高分辨质谱。由高分辨提取离子色谱图（MEW ±10 mDa）提取m/z 282.0289和458.0610的峰面积，其中282.0289信号强度最高，选为定量离子。优化MEW从±500 mDa降至±10 mDa时，信噪比（SNR）提升高达10.9倍，有效去除干扰。

**3.3 源内CID分析**
采用QTRAP 5500进行源内CID分析，以m/z 458.2作为替代前体离子，m/z 282.0作为定量离子。虽然源内CID产生更高离子信号强度，但干扰峰强度也增加，导致灵敏度低于MSALL（图5）。

**3.4 色谱分离**
采用HILIC柱和含0.1% NH₃的流动相（有机相为95%乙腈+5%甲醇），添加0.1% NH₃使HS信号强度提升1.3倍，并改善峰形。使用快速梯度（93%–50%有机相，1.2 min内）同时洗脱所有多分散GAG组分。

**3.5 样品前处理**
利用GAGs在蛋白沉淀时与蛋白质共沉淀的特性，用乙腈浓缩GAGs于蛋白沉淀中，去除含小分子干扰的上清液。随后用Tris饱和苯酚萃取，使GAGs溶于水相，变性蛋白分配至酚相；水相用二氯甲烷去除残留苯酚，避免质谱信号抑制。该方法快速（<1小时），且适用于与蛋白质共沉淀的其他分析物。

**3.6 HS、CS和DS的质谱信号比较**
在优化条件下，HS、CS和DS在HILIC柱上保留时间相同。CS和DS的m/z 282.0289碎片离子信号强度分别为HS的116.2%和117.3%，最大质量偏差为-5.67 ppm。由于HS占糖萼GAGs的50%–90%，选择HS作为代表性分析物进行全面验证，CS和DS进行部分验证。

**3.7 方法验证**
为了模拟真实CSF环境，采用含0.4%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%鱼精蛋白的人工CSF作为替代基质（正电荷蛋白鱼精蛋白提高了GAGs的提取回收率）。校准曲线在50–5000 ng/mL范围内线性良好。HS的LLOQ（50 ng/mL）和QC样品（75、2000、4000 ng/mL）的日内精密度（CV%）为3.48%–6.08%，日间精密度为6.47%–9.94%，准确度（偏差%）为1.25%–5.89%；CS和DS的精密度和准确度也在可接受范围内。基质效应、提取回收率和总过程效率分别为95.14%、100.95%和102.43%。乙腈沉淀回收率为98.4%–107%。分析物在短期稳定（室温6 h）、进样后稳定（自动进样器6 h、室温2 h）、冻融稳定（3个循环）和长期稳定（-20°C 30天）条件下稳定，准确度90.27%–106.67%。

**3.8 临床研究**
应用该方法检测83例卒中患者和42例对照的CSF中GAG水平。对照组中位GAG浓度为313.1 ng/mL（IQR: 172.2–475.0）；脑出血患者中位值为911.4 ng/mL（IQR: 591.1–1349.3，P<0.001）；脑梗死患者中位值为965.1 ng/mL（IQR: 428.9–1885.0，P=0.01）；蛛网膜下腔出血患者中位值为642.4 ng/mL（IQR: 429.2–1090.2，P=0.001）。总体卒中患者中位GAG浓度为834.1 ng/mL（IQR: 566.3–1419.0），显著高于对照组（P<0.001）。ROC曲线分析显示，AUC为0.8746（95% CI: 0.8132–0.9367），以466.9 ng/mL为截断值时，诊断敏感性83.13%，特异性76.19%。结果表明，卒中相关BBB功能障碍导致糖萼脱落，GAG释放入CSF，CSF GAG升高可作为BBB功能障碍的标志物。

**讨论与结论**
研究结论部分翻译如下：研究人员基于MSALL技术开发了一种LC-Q-TOF-MS方法，用于患者CSF中GAGs的定量分析。据研究人员所知，这是首次在不经化学或酶解的情况下通过LC-MS定量完整GAGs。GAGs浓度可反映糖萼脱落的严重程度，并与BBB功能障碍程度相关。不同分子量和硫酸化模式的GAGs在四极杆中碎裂，产生特征碎片离子m/z 282.0289和m/z 458.0610，其中m/z 282.0289信号强度最高，选为定量离子。独特的样品前处理方法提供了高效的样品净化，提高了重现性，回收率高且基质效应可忽略。由于Q-TOF-MS的高分辨率和优化选择的MEW实现了方法选择性，而样品前处理中的GAG浓缩则提高了方法灵敏度。通过省略化学或酶解步骤，样品前处理时间从1.5天缩短至不到1小时，使该方案更适用于临床应用。该方法成功用于定量患者CSF样本中的GAG水平，展示了其作为诊断BBB功能障碍工具的潜力，例如在卒中患者中，CSF GAG浓度升高与BBB功能障碍相关。