微基质固相分散方法用于萝卜中四环素类抗生素及其转化产物的多残留测定

《Microchemical Journal》：Micro-matrix solid-phase dispersion method for the multiresidue determination of tetracycline antibiotics and their transformation products in radish

　　

母体四环素类抗生素及其转化产物可存在于施用粪肥、处理过的污水污泥或使用再生城市废水灌溉的土壤中生长的蔬菜中。某些四环素类抗生素和转化产物在动物源性食品中已有监管，但在蔬菜中尚未实施。本文提出了一种分析方法，用于测定七种母体四环素类抗生素和六种转化产物。所选转化产物对应于差向异构体和脱水产物，据报道它们毒性最强。该方法基于微型化基质固相分散（μ-MSPD）法，结合在线固相萃取-液相色谱-串联质谱（online SPE-LC-MS/MS）测定。该方法已在萝卜可食用部分（叶和球茎）中验证，用于食品监测，并在根部中验证，用于污染物植物吸收和转运研究。所提方法的方法定量限（MQLs）低于5 ng g^-1 dw，准确度在85–100%范围内，相对标准偏差（RSD%）低于5.5%，适用于大多数化合物和基质。将该方法应用于萝卜样本，结果揭示即使在未检测到相应母体化合物的样本中，也存在四环素类抗生素的转化产物。使用ComplexGAPI和AGREEprep绿色分析化学指标的绿色度评估表明，与文献中报道的其他用于蔬菜中四环素类抗生素测定的方法相比，所提方法具有最高的绿色度。

论文解读

四环素类抗生素（tetracycline antibiotics）是广泛应用于人类和兽医医学的重要抗菌药物，因其抗菌活性和低副作用而常用。然而，这些药物可通过动物粪便施肥、污水污泥农用或再生城市废水灌溉进入农业土壤，进而被蔬菜吸收。尽管欧盟已对动物源性食品中的四环素类抗生素（如四环素（TC）、土霉素（OTC）和多西环素（DOX））及其某些转化产物（如4-差向异构体）设定最大残留限量（MRLs），但蔬菜中此类物质尚无监管标准。现有分析方法多针对有限数量的母体化合物（通常少于四种），且很少包含其转化产物，而转化产物（如差向异构体和脱水产物）可能具有更高毒性，并可转化为其母体化合物。此外，传统方法普遍存在样品用量大、溶剂消耗多、处理时间长及绿色分析化学（GAC）原则遵循不足等问题。因此，研究人员旨在开发一种绿色、灵敏且高效的方法，用于同时测定蔬菜（以萝卜为例）中多种四环素类抗生素及其主要转化产物的残留，并为食品监测和污染物迁移研究提供可靠工具。该论文发表于《Microchemical Journal》。

研究人员开展的研究基于微型化基质固相分散（μ-MSPD）法，结合在线固相萃取-液相色谱-串联质谱（online SPE-LC-MS/MS）测定，建立了同时定量七种母体四环素类抗生素（TC、OTC、金霉素（CTC）、DOX、替加环素（TGC）、米诺环素（MNC）、美他环素（MTC））及六种转化产物（4-差向四环素（ETC）、4-差向土霉素（EOTC）、4-差向金霉素（ECTC）、脱水四环素（ATC）、4-差向脱水四环素（EATC）、异金霉素（ICTC））的方法。该方法在萝卜（Raphanus sativus L.）的根、球茎（可食用的贮藏根）和叶中进行了全面验证，样本来自西班牙塞维利亚本地市场和超市。主要关键技术方法包括：（1）μ-MSPD提取：将冻干样品（0.1 g干重）与硅胶（分散剂）混合，填入装有C18（净化吸附剂）的注射器柱中，用7.5 mL McIlvaine缓冲液（pH 4.5，含15 mM EDTA）洗脱；（2）online SPE-LC-MS/MS分析：通过在线SPE系统（PLRP-S柱）对提取液进行富集和净化，使用300 μL进样体积，加载溶剂为2 mM甲酸铵（pH 7.0），色谱分离在Zorbax RRHD Eclipse Plus C18柱上进行，流动相为含0.1%甲酸和0.5 mM氟化铵的10 mM甲酸铵缓冲液与甲醇，质谱在正离子电喷雾电离（ESI）动态多反应监测（dMRM）模式下检测。

研究结果部分包括以下子标题及其结论：

3.1 μ-MSPD样品前处理优化：通过单变量和Box-Behnken设计（BBD）优化了提取溶剂（最终选用纯McIlvaine缓冲液，pH 4.5，15 mM EDTA）、分散剂（硅胶最佳）、净化吸附剂（C18，0.5 g）及洗脱溶剂体积（7.5 mL），实现了无需有机溶剂蒸发即可直接进样至online SPE系统，提高了绿色度。

3.2 在线SPE优化：加载溶剂pH为7.0时信号最高；最佳进样体积为300 μL；柱洗涤溶剂采用丙酮:乙腈（50:50，v/v）能有效降低残留（大部分化合物残留<1%）。

3.3 方法验证：方法检测限（MDL）和定量限（MQL）分别为0.2–15 ng g^-1 dw和0.5–50 ng g^-1 dw（除EATC和TGC外，多数化合物MQL≤5 ng g^-1 dw）；线性范围从MQL至500–2000 ng g^-1 dw（R²≥0.99）；回收率在根、球茎和叶中分别为24–109%、28–109%和16–96%（叶片中部分化合物回收率较低，推测与高矿物质含量有关）；准确度范围为67–106%；相对标准偏差（RSD%）低于12%（多数低于5.5%）。基质效应主要表现为负效应（尤其叶片中），但未影响异构体分离。

3.4 绿色度评估：采用ComplexGAPI和AGREEprep指标评估，与文献中其他方法（如QuEChERS、SPE等）相比，研究提出的μ-MSPD方法因样品量小（0.1 g）、试剂消耗少、废液少、安全性高等特点获得了最高绿色度评分。

3.5 方法应用：应用于市售萝卜样本（n=6），在根和叶中未检测到目标物，但在部分球茎样本中检测到OTC、EOTC、ETC、CTC、DOX、ATC和EATC等（浓度低于MQL），其中差向异构体和脱水产物的存在表明母体化合物可能已转化，揭示了监测转化产物对风险评估的必要性。

总结讨论部分回顾了方法优化中的关键因素（如提取溶剂酸度、EDTA浓度、净化条件）对回收率和信号的影响，并指出叶片中回收率较低的可能原因（矿物质螯合）。验证结果满足食品残留分析要求，且方法绿色度显著优于现有方法。研究结论部分（第4节）翻译如下： 所开发的μ-MSPD方法，结合在线SPE–LC–MS/MS测定，为同时测定萝卜中四环素类抗生素及其主要（毒性更强）转化产物提供了一种灵敏且可靠的方法。其微型化设计减少了样品和溶剂消耗以及试剂暴露，缩短了处理时间，并最小化了废液产生。该方法已针对萝卜根、球茎和叶进行了验证，多数化合物和基质的MQL低于5 ng g^-1 dw，线性高达2000 ng g^-1 dw，RSD%低于5.5%。准确度范围在85–100%（除TGC在三种基质中为70–82%，以及转化产物ATC（叶片中84%）、EOTC（根中67%）、ECTC（球茎和叶片中分别为78%和84%）、MTC（根中75%）和MNC（根中80%）外）。据研究人员所知，该方法首次实现了蔬菜中多种四环素类抗生素及其转化产物的同时测定，首次将μ-MSPD应用于蔬菜中四环素类抗生素的测定，并且根据ComplexGAPI和AGREEprep指标，是此类测定中最绿色的方法。该方法可作为推广μ-MSPD作为蔬菜中污染物测定绿色分析技术的起点。