基于在线实时质谱技术的动态监测方法及草药煎煮过程最佳终点预测模型的开发

《Chinese Medicine》：Online real-time mass spectrometry-driven dynamic monitoring and optimal endpoint prediction schema development for herbal medicine decoction process

　　**摘要**

**背景**
复方制剂的煎煮过程是传统草药医学中减少毒性和保持疗效的关键步骤。然而，由于配方中草药成分和化学成分的复杂性，精确实时监测煎煮系统的动态变化并准确预测其最佳终点仍然是当前技术难以解决的重大挑战。

**目的**
开发一种基于在线实时质谱（ORT-MS）的策略，用于实时监测复方制剂煎煮过程中的复杂成分，并以镇wu煎剂为例，建立一种验证过的预测最佳煎煮终点的方案。

**结果**
成功建立了一种新型的ORT-MS监测设备，能够连续长期（>240分钟）监测镇wu煎剂中的各种化合物。通过定量追踪关键有毒成分（如乌头碱）和生物活性成分（如苯甲酰乌头碱）的煎煮过程，建立了一种评估煎剂整体毒性和生物活性的方法。此外，提出了一种综合方案来确定最佳煎煮终点，该方案整合了五个维度：安全性、生物活性、时间、能耗和成本（SBTEF）。研究结果表明，在本实验条件和剂量下，综合考虑所有因素时，镇wu煎剂的最佳煎煮终点约为150分钟。

**结论**
本研究提出了一种通用的基于质谱的实时分析策略和终点预测方案，为草药制剂煎煮过程提供了新的科学工具，有助于评估煎煮质量（特别是毒性的降低和疗效的保持），从而提高草药制剂的质量和合理临床应用。

**引言**
复方制剂的煎煮过程是传统草药医学中减少毒性和保持疗效的关键步骤。然而，由于配方中草药成分和化学成分的复杂性，精确实时监测煎煮系统的动态变化并准确预测其最佳终点仍然是当前技术难以解决的重大挑战。

**目的**
开发一种基于在线实时质谱（ORT-MS）的策略，用于实时监测复方制剂煎煮过程中的复杂成分，并以镇wu煎剂为例，建立一种验证过的预测最佳煎煮终点的方案。

**结果**
成功建立了一种新型的ORT-MS监测设备，能够连续长期（>240分钟）监测镇wu煎剂中的各种化合物。通过定量追踪关键有毒成分（如乌头碱）和生物活性成分（如苯甲酰乌头碱）的煎煮过程，建立了一种评估煎剂整体毒性和生物活性的方法。此外，提出了一种综合方案来确定最佳煎煮终点，该方案整合了五个维度：安全性、生物活性、时间、能耗和成本（SBTEF）。研究结果表明，在本实验条件和剂量下，综合考虑所有因素时，镇wu煎剂的最佳煎煮终点约为150分钟。

**结论**
本研究提出了一种通用的基于质谱的实时分析策略和终点预测方案，为草药制剂煎煮过程提供了新的科学工具，有助于评估煎煮质量（特别是毒性的降低和疗效的保持），从而提高草药制剂的质量和合理临床应用。

**材料与方法**
**试剂、化学品和材料**
附子（Fuzi）、白术（Baizhu）、白芍（Baishao）和茯苓（Fuling）均购自安徽浩森药业有限公司。这些草药被粉碎并通过0.15毫米（100目）筛子筛选，得到均匀的样品粉末，用于后续实验。新鲜生姜（Shengjiang）购自中国北京的当地超市，并切成均匀的薄片（2.00~3.00毫米）。所有样品均由中国科学院中国医药科学院国家中药资源中心的康丽萍教授鉴定（样品编号：ZZFZ2025001、ZZFL2025001、ZZSJ2025001、ZZBZ2025001、ZZBS2025001）。参考标准品（芍药苷和苯甲酰乌头碱）由北京贝特仁康生物科技有限公司提供（纯度>98%）。这两种标准品均溶解在水中，制备浓度为1.00 mg/mL的标准储备溶液。实验中使用的水为Watsons纯净水（中国广州）。

**建立草药制剂煎煮的实时质谱监测平台**
独立建立了一个名为在线实时质谱（ORT-MS）的监测平台，用于草药制剂煎煮过程。该平台主要分为三个功能单元：
(1) 复方煎煮单元：一个500毫升的三颈烧瓶，配备数字温度控制的磁加热套（TAISITE, 98-Ⅱ-CN）和回流冷凝管；
(2) 样品传输单元：包括惰性硅胶管（内径：2毫米）、多通道蠕动泵（LongerPump, BT100-3J）和0.45微米聚醚砜过滤器（Jinteng, 天津，中国）；
(3) 实时质谱检测单元：自制的喷雾喷嘴与线性离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific, 马萨诸塞州，美国）相连。

**关键参数的优化**
在实际样品分析之前，需要系统优化ORT-MS的关键参数。以主要成分的离子峰强度（负离子模式下的芍药苷和正离子模式下的苯甲酰乌头碱）为指标，采用自动和手动调整相结合的方法：首先，仪器自动优化毛细管电压和管透镜参数；随后，手动优化喷雾电压、喷雾气体压力和毛细管温度。优化过程采用单因素优化策略：在100–450℃范围内系统调整毛细管温度，以确定具有最佳信号响应的温度；然后，在3.0–6.0 kV范围内确定最佳毛细管电压；最后，在0.2–0.5 MPa范围内优化喷雾气体压力，以确认最佳压力参数。

**镇wu煎剂的实时监测**
准确称量每种草药：附子0.414克、白术0.276克、白芍0.414克、茯苓0.414克和生姜0.414克。将这些草药放入500毫升的三颈烧瓶中，加入400毫升超纯水浸泡30分钟。每种草药的固液比为约1:1000，这种极低的浓度可以最小化基质效应和不同成分之间的相互干扰。煎煮过程分为两个阶段：初始阶段，混合物在高温下加热至沸腾，然后转为低温保持温和沸腾状态，实验连续记录240分钟。为了确保结果的可靠性，分别在正离子模式和负离子模式下进行了三次独立重复实验。为了评估草药之间的相互作用，每种草药按照其在复方中的相应浓度进行煎煮并随后进行分析操作。

**ORT-MS数据处理**
在线质谱系统获取全扫描数据（m/z 100–1500），并在240分钟内为每种化学成分获取大约72,000个信号强度值。在使用箱车平滑算法（窗口大小=3）对动态信号进行去噪处理后，提取了目标化合物的离子色谱图（EICs）。利用MATLAB R2016a软件及其内置的曲线拟合工具，基于高斯模型和傅里叶模型对数据进行了拟合，从而实现了对煎煮过程中化学成分动态变化的可视化分析。

为了将ZWD的研究结论扩展到更多的草药，并建立确定煎煮终点的通用标准，本研究提出了一个全面的五维预测框架（SBTEF）。该框架基于五个核心维度构建：安全性、生物活性、时间、能耗和成本（SBTEF）。通过明确每个维度的权重分配，实现了煎煮终点的客观和标准化确定。对于安全性维度，主要标准是毒性成分的含量必须保持在安全阈值范围内；在生物活性维度上，关键指标是在保证安全性的前提下，活性成分尽可能丰富，并且在高效力范围内保持稳定；关于时间维度，核心要求是缩短煎煮时间并简化样品预处理过程；对于能耗维度，关键测量标准是减少能源使用，减轻潜在的环境危害，从而实现研究过程的绿色化；对于成本效益维度，通过计算试剂消耗和劳动力投入来控制总体研究成本。

首先，开发了一个基于实时质谱技术的草药化合物煎煮监测平台，命名为ORT-MS，该平台具有结构简单、操作简便、多功能性强和稳定性优异的特点。如图1所示，该平台通过将LTQ XL线性离子阱质谱仪与自制的ESI离子源耦合而成。左侧是反应单元，包括一个三颈烧瓶、一个温控磁力加热套和一根冷凝管：三颈烧瓶用于盛放草药和溶剂；温控磁力加热套实现加热和磁力搅拌；冷凝管防止溶剂挥发导致化合物浓度波动。样品传输通道采用惰性硅胶管（内径2.00毫米），其入口包裹着无纺布以避免管道堵塞。精密蠕动泵提供恒定的流速，确保检测信号的稳定性和重复性。此外，0.45微米的微孔膜实现了在线杂质去除，结合自制ESI离子源的高电离效率，使得无需任何离线预处理即可直接分析复杂基质的样品，显著缩短了检测周期。这种集成设计实现了草药化合物煎煮过程中化学成分的实时和准确检测。与现有的质谱监测系统（如ND-APCI-MS [14]和PSI-mini-MS [15]）相比，ORT-MS能够连续、不间断地对中药煎煮液进行采样和实时电离分析。它在240分钟内完成了72,000次质谱信号采集，展示了其在实时多组分监测复杂中药煎煮系统中的不可替代能力。

为了实现更高效的电离和检测，基于关键成分（芍药花苷和苯甲酰麻黄碱）的信号强度，系统地优化了ORT-MS的关键参数（喷射电压、喷射气体压力和毛细管温度）（图2）。如图2A、B所示，当使用高纯度氮气作为喷射气体时，总离子电流（TIC）信号强度在喷射气体压力为0.3 MPa时达到最大值，因此两种模式下喷射气体压力均设定为0.3 MPa。在正离子模式下（图2C），苯甲酰麻黄碱的信号响应随着毛细管温度在100–350℃范围内的升高而增强，但在350–400℃之间略有下降。因此，正离子模式的毛细管温度确定为350℃。在负离子模式下（图2D），芍药花苷在250℃时显示出最高的信号响应，因此选择250℃作为负离子模式的毛细管温度。进一步优化喷射电压后发现，TIC信号强度随着电压的升高而逐渐增强。在5.5–6.0 kV的范围内，化合物信号响应的差异很小；然而，过高的电压容易导致放电现象。基于此，正离子模式的喷射电压设定为5.5 kV（图2E），负离子模式的相应喷射电压设定为-5.5 kV（图2F）。这些优化参数共同确保了草药化合物煎煮过程中关键成分的高效电离和稳定检测，为ORT-MS平台的实时监测性能奠定了可靠基础。

条件优化后，本研究建立的草药化合物煎煮实时质谱监测平台展示了检测各种目标成分的能力。该平台能够连续、灵敏地收集草药化合物煎煮样品的质谱数据；对于不同结构类型的靶成分，它可以获取清晰、准确的质量谱，并利用串联质谱数据促进其精确的结构鉴定。结果显示，附子中的生物碱成分（例如苯甲酰麻黄碱，m/z 590；苯甲酰阿康碱，m/z 604）在正离子模式下显示出显著响应（图3A），且电离效率较高。相比之下，白芍中的特征性单萜糖苷成分（例如芍药花苷，m/z 525；芍药花苷亚硫酸盐，m/z 543）在负离子模式下显示出更强的响应（图3B）。基于此，本研究采用了双离子扫描模式，在正负离子条件下分别对ZWD煎煮样品进行了全面分析，有效覆盖了化合物煎煮中的多种化学成分类别。通过综合比较标准参考数据、文献中报告的MS/MS裂解模式，并系统搜索包括ChemBank（http://chembank.med.harvard.edu/）和MassBank（http://www.massbank.jp/）在内的专业数据库，共鉴定出51种目标成分。这些成分涵盖了生物碱和单萜糖苷等关键化合物类别，其中包括来自附子的24种生物碱。所有鉴定成分的关键参数（如名称、分子式、分子量和特征碎片离子）列在表S1中。

基于ORT-MS，阐明了草药在ZWD煎煮过程中降低毒性和保持疗效的机制。附子是Aconitum carmichaelii Debx.的侧根，具有多种药理活性，包括镇痛、抗炎、免疫调节、抗抑郁和抗肿瘤作用[16, 17]，以及显著的心脏强心作用[16]。然而，附子中的生物碱不仅是其药理活性的主要物质基础，也是其毒性的重要来源[18]。研究表明，含有两个酯键（C-8位置的乙酰基和C-14位置的苯甲酰基）的二酯型生物碱具有强烈的心脏毒性和神经毒性，是导致附子临床毒性反应的主要物质[19, 20]。在加热条件下，这些生物碱的C-8位置的乙酰基容易发生水解，进一步降解为单酯型阿康碱[15]。作为附子的关键活性成分，单酯型阿康碱（例如苯甲酰氢阿康碱、苯甲酰麻黄碱、苯甲酰阿康碱）由于酯键数量减少，毒性降低（仅为二酯型阿康碱的1/200–1/500）[21]，并且它们具有明显的药理作用，如显著增强心肌收缩力和改善心脏功能，是附子发挥“恢复阳气、救治虚脱”传统功效的核心物质基础。如果加热条件持续，单酯型阿康碱的C-14位置的酰基会进一步水解形成氨基醇型阿康碱。这一水解过程导致毒性进一步降低（仅为阿康碱的1/2,000–1/4,000），但其药理活性相应减弱[22]。因此，在附子生物碱的转化过程中，单酯型阿康碱含量越高，疗效越强；如果转化阶段的单酯型阿康碱含量低而氨基醇型阿康碱含量高，则会导致整体疗效下降。因此，适当的时间控制和草药化合物的兼容性对于促进更多单酯型阿康碱的产生至关重要。这一规则不仅阐明了附子功效与生物碱类型之间的核心关联，也为“降低毒性和保持疗效”在附子临床应用中的过程优化提供了关键基础。

通过分析图4、图5和表S1中生物碱信号强度的变化曲线，我们可以系统地理解附子单煎煮系统和ZWD共煎煮系统中成分的动态演变模式（其中绿色曲线代表共煎煮系统，黄色曲线代表单煎煮系统）。在单煎煮和共煎煮系统中，各种生物碱（包括二酯型、单酯型和氨基醇型生物碱）如氢阿康碱、苯甲酰氢阿康碱和阿康碱表现出明显的曲线波动特征，成为附子煎煮过程中成分转化的核心标志。从煎煮时间的角度来看，生物碱的溶解和转化在单煎煮和共煎煮系统中都表现出阶段特异性特征。在浸泡和早期煎煮阶段（0–50分钟），两种煎煮系统中溶解的生物碱量都很大，其浓度呈急剧上升趋势——表明这一阶段是生物碱溶解的主要时期。当煎煮时间达到50分钟时，单煎煮系统和共煎煮系统中生物碱的变化显示出显著差异。在附子的单煎煮系统中，二酯型生物碱氢阿康碱的浓度迅速下降（图4A）：其信号强度从峰值7.36×10^3降至3.48×10^3，下降了52.7%。相比之下，在共煎煮系统中，氢阿康碱的溶解受到其他药材的影响：其最大信号强度为4.49×10^3，仅为单煎煮系统峰值的61%。这种有毒二酯型生物碱在煎煮过程中的显著减少为“减轻”在传统煎煮过程中的科学内涵提供了确凿的实验证据和坚实的理论支持。在单煎煮系统中，单酯型生物碱苯甲酰氢阿康碱（图4B）、苯甲酰麻黄碱（图5A）和苯甲酰阿康碱（图5C）的浓度迅速下降：苯甲酰氢阿康碱从初始的3.66×10^4降至9.93×10^3（下降了72.9%）；苯甲酰阿康碱从3.92×10^4降至7.30×10^3（下降了81.4%）；苯甲酰麻黄碱的热稳定性最差，降解速率最快，从初始的2.84×10^5降至2.86×10^4（下降了89.9%）——这与单酯型生物碱的进一步水解转化规则一致。然而，在ZWD的共煎煮系统中，单酯型生物碱的下降速率显著降低，某些成分甚至出现浓度回升：苯甲酰氢阿康碱从初始的2.27×10^4升至2.45×10^4（增长了约7.9%，这可能与共煎煮系统中其他药材对其水解的抑制作用或转化效率的提高有关）；苯甲酰阿康碱从初始的2.58×10^4降至2.33×10^4（下降了9.7%）；苯甲酰麻黄碱从初始的1.83×10^5降至1.39×10^4（下降了24.0%）。这进一步表明ZWD的兼容性可以抑制单酯型生物碱的水解，促进某些成分的保留，并改变附子中的强心活性成分含量——验证了草药兼容性中“保持疗效”的科学机制。

关于醇胺型生物碱，它们的含量变化与单酯型生物碱的水解转化直接相关。在单煎煮系统中，由于目标性水解了相应的单酯型前体（苯甲酰基海考因、苯甲酰基美沙考因和苯甲酰基阿考因），海考因、美沙考因和阿考因的含量呈现出明显的上升趋势。作为生成速度最快的醇胺类生物碱，美沙考因的信号强度从30分钟时的2.18×10^4增加到230分钟时的1.46×10^5，增幅高达570%。计算表明，这一增幅大约是海考因（345%）和阿考因（303%）的1.5倍——这一现象与其前体苯甲酰基美沙考因的快速降解速率一致。然而，在ZWD的共煎煮系统中，阿考因的含量变化呈现出独特模式：在50-100分钟的时间段内，由于系统中其他药用成分的复杂影响（例如与阿考因的可逆结合或存在竞争性转化途径），其含量呈下降趋势，并在100分钟后趋于稳定。相比之下，海考因和美沙考因的变化趋势与单煎煮系统中的趋势一致。这一结果表明，不同类型的醇胺类生物碱受兼容性的影响程度各不相同。总之，ZWD的共煎煮系统调节了单酯型生物碱的水解过程，减少了单酯型生物碱向醇胺型生物碱的过度转化。这不仅减少了有毒物质的积累，还间接促进了单酯型生物碱的合理保留，从而实现了“降低毒性并保持疗效”的兼容性效果。

除了在共煎煮和单煎煮系统中表现出显著动态变化的生物碱外，图S1中的其他生物碱成分（如富芝碱和松果碱）在两种系统中的浓度数据点和拟合曲线也非常相似。我们推测这种现象的根本原因是这些生物碱在煎煮系统中的相对稳定性较高。在加热条件下，它们几乎不会发生水解、分子间相互作用或结构转变。同时，ZWD共煎煮系统中的其他草药成分并未与这些生物碱发生明显的结合或竞争性反应，也没有显著干扰它们的溶解和现有状态。因此，这些生物碱含量的动态变化仅受初始溶解过程的控制，共煎煮系统和单煎煮系统之间没有显著差异。这也反映了富芝生物碱的结构多样性及其对化合物兼容性和煎煮条件的不同响应特性。

在ZWD的药效学系统中，白芍是核心成分之一。其药理作用主要依赖于多种活性成分的协同作用，其中单萜类及其苷类以及多酚类化合物是主要活性成分。研究表明，单萜类成分（如芍药花苷和白花苷）具有显著的抗炎和镇痛活性：它们不仅能有效缓解疼痛，还能调节身体的免疫功能[23, 24]；多酚类成分（包括没食子酸、1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖和1,2,3,4,6-五没食子酰-葡萄糖等）具有强抗氧化活性，能够有效清除自由基并减轻氧化应激对细胞的损伤[25]。由于草药配方的兼容性会影响成分的存在状态，白芍的单煎煮和ZWD共煎煮系统中上述活性成分的溶解和转化行为存在显著差异，具体细节如下所示（图6；S2）。

在单萜类及其衍生物中，芍药花苷和白花苷的总信号强度在白芍的单煎煮系统中几乎没有显著变化，但在共煎煮系统中呈现出下降趋势。到240分钟时，它们的总信号强度下降了近50%（图6A）。像没食子酰芍药花苷、芍药花苷磺酸盐和苯甲酰芍药花苷磺酸盐（图6B–D）这样的成分表现出与芍药花苷和白花苷相似的趋势。然而，在共煎煮系统中，下降速率相对较慢。这表明不同的单萜类及其苷类在共煎煮过程中与其他成分的相互作用不同，导致它们的降解或转化速率也有所不同。

单宁1,2,3,4,6-五没食子酰-葡萄糖是由一个葡萄糖分子与五个没食子酸分子通过酯键连接形成的，在煎煮过程中表现出相对复杂的变异模式（图6E）。在白芍的单煎煮系统中，这种单宁的信号强度在100分钟时达到1.92×10^3，增长速率相对较慢。这一阶段被认为是由于草药组织的溶解和其他高度取代的没食子酰葡萄糖的水解所致。相比之下，从100分钟到180分钟，增长速率加快，信号强度达到8.62×10^3，这可能是由于随着煎煮的进行，其他高度取代的没食子酰葡萄糖的水解加剧，从而促进了该成分的生成。随后，在180分钟后观察到下降趋势，信号强度在225分钟时降至6.80×10^3。这种下降可能是因为在持续加热下，该成分进一步水解为低取代没食子酰葡萄糖的速率超过了其通过分解高度取代的没食子酰葡萄糖的生成速率，最终导致其含量逐渐减少。对于另一种单宁成分1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖，在白芍的单煎煮系统中其总信号强度几乎没有显著变化。但在共煎煮系统中，其信号强度呈现出显著下降趋势，到240分钟时减少了近50%（图6F）。这种差异可能源于该成分与共煎煮系统中其他草药成分形成的复合物，或者它参与了与苷元成分的酰基转移反应——这两种情况都会导致溶液中其游离形式的含量减少。

作为单宁成分的水解产物，没食子酸和鞣花酸在单煎煮和共煎煮系统中都呈现出持续上升的趋势。到240分钟时，它们的信号强度分别在单煎煮系统中上升到3.79×10^4和8.15×10^3，在共煎煮系统中上升到3.08×10^4和8.15×10^3（图6G, H）。煎煮初期的增长主要是由于草药组织的逐渐溶解，而在后期可能与1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖等其他多取代没食子酰化合物的水解有关。儿茶素在共煎煮系统中保持稳定，而在单煎煮系统中，在中后期略有增加随后又下降（图6I）。据推测，共煎煮系统中的某些成分对儿茶素具有保护作用，从而抑制了其转化或降解。相比之下，单煎煮系统中缺乏这种保护成分，导致儿茶素最初积累，随后在长时间煎煮过程中由于结构转化或分解而含量下降。在单煎煮系统中，二-O-咖啡酰奎宁酸（图6J）和羧酸化合物柠檬酸（图6K）在0-50分钟内完全溶解，然后持续减少（减少率分别为26.79%和48.62%）。相比之下，在共煎煮系统中，它们的减少速度更快，减少率分别达到53.6%和49.39%。可以推断，共煎煮系统中的其他成分加速了它们的降解或转化，或者与它们形成了复合物。苯甲酸在共煎煮（增加238%）和单煎煮（增加309%）系统中都呈现出明显的上升趋势（图6L）。这一趋势可能是由于含有苯甲酰基的物质的水解，释放出苯甲酰基团，随后转化为苯甲酸。

总体而言，在该复方配方的煎煮过程中，一方面单萜类苷类（如芍药花苷）可能与其他草药反应生成新的活性化合物；另一方面，煎煮过程提高了系统中多酚类物质的含量。这两个方面协同增强了复方配方的疗效，从而共同加强了其抗氧化和免疫调节功能。

在研究ZWD的化学成分时，三种草药（生姜、白术和茯苓）的可检测生物活性成分类型较少且含量较低，与富芝和白芍相比。这些生物活性成分大致可以分为两类：首先是生姜特有的姜醇类成分，作为生姜发挥温阳通经作用的关键物质基础，主要包括6-姜醇和8-姜醇；其次是白术特有的倍半萜醇类成分，是白术补脾益气的主要生物活性物质。对于茯苓，由于大多数成分的水溶性较差，未检测到特征性的生物活性成分。

对生姜煎煮过程的监测显示，6-姜醇和8-姜醇的含量在不同系统中有所变化。具体来说，这两种成分在共煎煮系统中呈下降趋势，而在单煎煮系统中含量没有显著变化。6-姜辣醇和姜酮的信号强度在两种系统中都有所增加。对于6-姜辣醇，其在单煎煮系统中的信号强度从3.42×10^3增加到1.03×10^4，增加率约为201.2%，大约是共煎煮系统的4倍（51.5%）；对于姜酮，其在单煎煮系统中的信号强度从3.32×10^3增加到2.26×10^4，增加率约为580.7%；在共煎煮系统中，其信号强度从1.87×10^3增加到6.78×10^3，增加率约为262.6%，单煎煮系统的增加率约为共煎煮系统的2.2倍（图7A–D）。先前的研究已经证实，姜醇在高温条件下可以转化为姜辣醇[26]，这表明共煎煮系统可能抑制了这一转化过程。此外，对白术中倍半萜醇类成分的监测显示，这些成分在煎煮初期迅速溶解。在随后的180分钟连续煎煮过程中，ZWD共煎煮系统和白术单煎煮系统中它们的含量没有显著变化。这一结果表明，倍半萜醇类成分具有很强的热稳定性，不太可能与ZWD中的其他成分发生相互作用，其疗效主要取决于初期的充分溶解（图7E, F）。

提出了SBTEF五维预测模型用于预测草药配方的最佳煎煮终点，并评估ZWD的最佳煎煮终点。草药复方配方在煎煮过程中物质的复杂变化使得确定其最佳煎煮终点变得困难。因此，在传统实践中，通常基于固定时间或感官经验进行粗略判断。总体而言，理想的目标是在保证化合物安全性的前提下，尽可能保留高水平的活性成分，并通过降解有毒成分来实现这一目标。同时，实际生产和日常生活中的关键因素（如时间、成本和能耗）也应综合考虑。因此，本研究首次创造性地提出了SBTEF五维预测模型，用于预测草药的最佳煎煮终点（图8）。安全性是首要考虑的因素，也是煎煮过程的主要决策标准，必须确保有毒成分降解到安全阈值以下。生物活性对于保证疗效至关重要。在满足安全要求的前提下，应努力尽可能保留关键生物活性成分（如单酯类生物碱和芍药花苷），以确保中药的最佳疗效。考虑到成本和环境保护，一旦满足安全性和生物活性要求，最佳煎煮终点应根据最短时间、最低能耗和最低成本来选择。这一综合策略实现了“降低毒性和增强疗效”的双重目标。

根据上述逻辑，以ZWD为例，通过对ZWD煎煮过程中每种草药化学成分的动态变化进行系统分析，其煎煮终点的预测必须遵循“降低毒性和保持疗效”的核心原则以及复方配方的整体协同效应。附子的转化规则是确定煎煮时间的关键：大约在煎煮100-150分钟后，二酯类生物碱（如假乌头碱）会完全水解至较低水平，其毒性显著降低。相比之下，与核心疗效相关的单酯类生物碱（如苯甲酰假乌头碱）则受益于共煎体系中抑制水解的环境，使其浓度在100至150分钟期间保持相对稳定的平台期。因此，附子的煎煮时间应控制在100-150分钟之内。白芍的活性成分则需要稍长的煎煮时间：其主要苷类成分（如芍药苷）的转化较为缓慢，而多酚类成分（如1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖）的水解及其活性代谢物（没食子酸、鞣花酸）的产生在煎煮的中后期（100-240分钟）更为活跃。较长的煎煮时间有助于实现溶解与转化的平衡，从而增强抗氧化活性。在煎煮过程中，生姜中的姜辣素含量呈持续上升趋势，而白术中的阿特拉克林类成分则在早期溶解后保持稳定。两者都支持中长期的煎煮。综上所述，在本研究的实验条件和剂量下，为了平衡附子的“毒性降低与疗效保持”需求，以及白芍和生姜的成分溶解与转化要求，将ZWD的煎煮终点设定在大约150分钟最为合适。这一时间点不仅确保了有毒成分的有效去除和疗效成分的最佳保留，还促进了白芍中多酚类成分的充分水解及其活性代谢物的生成，从而最大化了该复方配方的整体疗效（图8）。这一终点预测为ZWD的传统煎煮过程提供了定量科学依据，实现了毒性降低与疗效保持的统一。

**结论与未来方向**
基于自建立的ORT-MS技术平台，本研究开发了一种通用的草药煎煮过程实时分析策略，并提出了一种五维协同预测方案，用于确定煎煮终点，该方案整合了安全性、生物活性、时间、能耗和成本等因素。以ZWD为例，该策略成功实时捕捉了不同煎煮阶段51种关键成分（包括生物碱、单萜苷等）的动态变化特征，阐明了“毒性降低与疗效保持”的协同机制，并结合五维方案SBTEF确定了150分钟为最佳煎煮终点。这确保了复方配方的整体疗效最大化，并为草药煎煮从经验驱动向科学标准化的转变提供了重要工具。然而，本研究仍存在某些局限性：一些低丰度和水溶性较差的成分未被检测到，可能影响煎煮系统中成分动态分析的全面性；存在同位素和异构体干扰，导致成分干扰的风险相对较高；基于体外模拟煎煮确定的最佳终点尚未通过动物或临床研究验证其与ZWD体内疗效、毒性和代谢特性的相关性。因此，其临床转化价值仍有待探索。为解决上述问题，未来的研究方向包括：利用ORT-MS的强通用性，将其与高分辨率质谱（HRMS）和离子迁移谱（IMS）结合，以减少同位素和异构体干扰并进一步提高检测精度；进行体内动物和临床疗效研究，验证ZWD 150分钟煎煮终点的有效性和安全性；以及建立一种综合评估系统，整合体外成分分析与体内药理学和毒理学评价，以完善煎煮终点的评估体系。