《AAPS Open》：Drying technologies for messenger RNA and other nucleic acid-lipid nanoparticles: advances in freeze-drying and beyond
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这篇综述深入探讨了通过干燥技术（尤其是冷冻干燥(lyophilization)）提高mRNA-LNP等核酸脂质纳米颗粒稳定性的策略。文章系统分析了mRNA-LNP的固有稳定性、冷冻干燥过程中的挑战与优化方案（如冻干保护剂(lyoprotectant)、工艺参数），并扩展讨论了siRNA、saRNA、circRNA等其他核酸-LNP的干燥策略。此外，还介绍了连续冷冻干燥、薄膜冷冻干燥等新兴干燥方法，为开发在更高温度下保持稳定性和效力的固态NA-LNP提供了全面见解。
核酸疗法，作为继小分子和抗体之后的第三大类治疗药物，正在重塑医药格局。其中，脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticles, LNPs)已成为核酸递送的领先平台。新冠mRNA疫苗的成功验证了其巨大潜力，但同时也暴露了其致命弱点：对超低温储存的苛刻要求，这严重限制了其全球运输和分发。干燥技术，尤其是冷冻干燥(Lyophilization)，为在更高温度下维持其稳定性提供了解决方案。这篇综述旨在梳理mRNA-LNP的内在稳定性、利用冷冻干燥提升其稳定性的现状与挑战，并展望更广阔的核酸-LNP干燥策略。
mRNA-LNP的结构与不稳定性根源
mRNA-LNP由包裹mRNA的多种脂质成分自组装而成。其结构复杂，可能呈现无序的逆六方结构、核壳结构或在内部形成充满溶质的“水疱”(bleb)结构。mRNA本身是单链RNA，其核糖2‘羟基在碱性环境中易攻击磷酸二酯键导致断裂，是其主要的不稳定因素。此外，温度、湿度、pH值、离子强度以及新型的mRNA-脂质加合物形成等，都会加速其降解。虽然LNP系统中的脂质也存在水解、氧化等化学不稳定性风险，但具有类似LNP系统的siRNA药物Onpattro能在2–8°C稳定保存三年的事实表明，mRNA自身的不稳定性是mRNA-LNP制剂稳定性差的主要原因，而非LNP系统本身。
冷冻干燥作为改善mRNA-LNP稳定性的干燥方法
冷冻干燥通过冻结、一次干燥（升华）、二次干燥（解吸）三步去除水分。然而，这个过程本身引入的冻结和干燥应力可能损害mRNA-LNP的稳定性。
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冻结与干燥应力：冻结时，冰晶形成导致溶质浓度急剧升高，可能引发LNP聚集；缓冲盐结晶可能导致pH剧烈波动，而pH升高会碱催化RNA水解；冰/水界面可能引起脂质重排，影响LNP完整性。干燥过程中，水分的移除可能破坏由水分子氢键稳定的RNA局部结构及脂质极性头基间的距离，导致结构损伤。
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冻干保护剂配方：添加冻干保护剂(Lyoprotectant)是保护LNP在冻干过程中保持结构和生物活性的关键。其保护机制主要包括玻璃化、隔离和水替代假说。蔗糖、海藻糖和麦芽糖是mRNA-LNP冻干中最常用的保护剂，总浓度通常在10–20% (w/v)。近年来，羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)等因其能提高干燥制剂的玻璃化转变温度(Tg)，作为Tg调节剂受到关注，其中添加1% PVP-K12显示出改善冻干过程中及储存稳定性的潜力。此外，缓冲液类型和浓度（如低浓度Tris缓冲液优于PBS）、脂质摩尔比（如DSPC与胆固醇的比例）以及mRNA浓度也会影响冻干后mRNA-LNP的稳定性。
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冻干工艺优化：工艺参数对产品稳定性至关重要。冻结阶段的冷却速率和冰核温度影响冰晶结构和LNP在冻结浓缩液中的停留时间，进而影响稳定性。一次干燥的搁板温度需设定在制剂的塌陷温度(Tc)以下，以防多孔结构坍塌。二次干燥的温度和时间则直接影响最终产品的残余水分，而适宜的残余水分对长期储存稳定性有重要影响。研究表明，不完全的二次干燥或过高的二次干燥温度可能导致粒径增大、包封率下降和mRNA完整性损失。
其他核酸脂质纳米颗粒的干燥以改善稳定性
除了mRNA，其他核酸-LNPs也面临稳定性挑战，干燥技术同样适用，但需根据其结构特点进行调整。
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小干扰RNA (siRNA)：因其双链结构、较短长度及化学修饰，siRNA比mRNA更稳定。研究表明，20% w/v的蔗糖或海藻糖能有效保护siRNA-LNP在冻干后的活性。喷雾干燥siRNA-LNPs（如使用5%乳糖溶液）可制备用于肺部递送的干粉，并在4°C和25°C下储存3个月保持稳定。
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自扩增RNA (saRNA)：结构类似mRNA但尺寸更大（8–15 kbp），更易发生水解和剪切降解。使用10% w/v蔗糖冻干可保持其理化性质，但转染效率可能有所下降。也有研究报道冻干的SARS-CoV-2 saRNA-LNPs在室温下可稳定超过15周。
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质粒DNA (pDNA)：闭环双链DNA结构使其对核酸酶具有抗性。研究发现20% w/v海藻糖是pDNA-LNP有效的冻干保护剂，可在室温下保持24个月的稳定性。
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环状RNA (circRNA)：其共价闭合的环状结构赋予其对外切酶降解的固有抗性。研究表明，冻干后的circRNA-LNPs能在4°C储存24周后保持结构完整性和转染效率，并可能通过配体修饰实现靶向递送。
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微小RNA (miRNA)：单链非编码RNA，易降解。冻干技术可用于延长靶向角质形成细胞的miRNA-LNPs的保质期，用于局部给药。
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CRISPR-Cas9系统：包含Cas9蛋白和单链向导RNA(sgRNA)，稳定性挑战大。目前有研究使用10%蔗糖和10%麦芽糖作为冻干保护剂，冻干后的CRISPR-Cas9 LNP与新鲜制剂相比，仍能实现相当的蛋白敲低效果。
用于改善核酸-脂质纳米颗粒稳定性的其他干燥方法
传统冷冻干燥耗时长、存在批次间差异、放大生产困难。因此，其他干燥技术被探索用于改善NA-LNP的稳定性，尤其适用于肺部等非注射途径给药。
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基于旋转冻结的连续瓶装冷冻干燥：该技术通过旋转使药液在瓶壁形成薄层冻结，增大了干燥表面积，缩短了干燥时间，并易于规模化。研究表明，该技术能成功保持mRNA-LNP的包封率和体内外转染效率，冻干产品在4°C、22°C和37°C下储存至少12周仍能保持转染特性。
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薄膜冷冻干燥：通过将液滴滴到冷却的旋转鼓上瞬间冻结，形成薄层，再进行冷冻干燥。该方法干燥速度快，所得粉末质脆，适用于口服和吸入给药。研究显示，该技术能保持siRNA固体脂质纳米颗粒(SLNs)和具有“水疱”结构的mRNA-LNPs的理化性质和免疫原性，并具有良好的气雾剂性能。
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喷雾冷冻干燥：将液体雾化成微小液滴后进行深度冻结和干燥。同样适用于生产吸入用干粉。已有研究通过pH调节的喷雾冷冻干燥制备了不含蔗糖的mRNA-LNPs吸入粉雾剂，以及用于肺癌靶向治疗的siRNA-LNPs干粉吸入剂。
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喷雾干燥：一种半连续的干燥工艺，直接将液体转化为干粉，效率高、成本较低，适用于生产吸入用粉末。但过程中存在热应力和剪切应力，且要达到较低的残余水分需要较高温度。已有研究成功将mRNA-LNPs喷雾干燥用于气管内递送，干燥后产品显示出比液体制剂更好的稳定性。
综上所述，干燥技术，特别是不断优化的冷冻干燥及其替代工艺，是突破核酸-LNPs（尤其是mRNA-LNPs）温度敏感性瓶颈的关键策略。通过合理的配方设计（冻干保护剂、缓冲体系等）和工艺控制（冻结、干燥参数），可以显著提高这类前沿疗法的稳定性，拓宽其给药途径（如吸入给药），从而降低储存和运输成本，提升药品可及性，最终惠及全球更多患者。
