《IUCrJ》：Automated microbatch-under-oil phase diagrams to rationalize serial crystallography sample preparation
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研究人员描述了一种自动化、低体积的油下微滴结晶方法，能够快速绘制相图边界。该方法通过明确区分亚稳态区与成核区，为串行晶体学微晶悬浮液的生产提供了合理化方案，从而用定量指导取代了经验性的试错优化。在X射线自由电子激光（XFEL）和第四代同步辐射光源上进行的串行晶
研究人员描述了一种自动化、低体积的油下微滴结晶方法，能够快速绘制相图边界。该方法通过明确区分亚稳态区与成核区，为串行晶体学微晶悬浮液的生产提供了合理化方案，从而用定量指导取代了经验性的试错优化。在X射线自由电子激光（XFEL）和第四代同步辐射光源上进行的串行晶体学（SX）已从根本上改变了结构生物学。通过合并来自数千个微晶体的衍射数据，SX使得在生理温度下的结构解析成为可能，并促进了动态过程的时间分辨研究。然而，SX的有效性取决于能否获得足够数量且尺寸均匀的微晶体。因此，从单晶体生长过渡到均质的微晶悬浮液仍然是主要的瓶颈。
大分子结晶由相图控制，它将蛋白质和沉淀剂浓度映射到不同的区域：不饱和区、亚稳态区（晶体生长）和不稳定区（成核与沉淀）。虽然概念上的相图可以指导初步筛选，但实际的相边界通常是不可预测的。因此，经验性的相图测定对于确定可重复的、最优的微晶体生长条件至关重要，因为晶体形态、尺寸分布和衍射质量在相空间中可能存在显著差异。
与蒸汽扩散法相比，油下微滴结晶在绘制相图方面具有明显优势。通过在油层下密封混合物，溶剂蒸发被有效消除，从而维持了稳定的化学环境，使得在成核点能够严格识别特定的组分浓度，这些参数在蒸汽扩散法中通常被平衡的动态轨迹所掩盖。尽管成核后蛋白质浓度会因溶质快速消耗而降低，但恒定的沉淀剂浓度使得能够从溶解度曲线开始，精确绘制穿过亚稳态区的相边界。尽管有这些优势，SX样品优化仍然严重依赖于耗时且经验性的调整，包括晶种方案、孵育时间和结晶条件。因此，对相空间的系统探索对于提供优化指导至关重要。
本研究报道了一种用于快速、低体积（15–60 μl或约0.15–3.8 mg蛋白质）测定全面相图的自动化油下微滴结晶方法的开发。研究人员采用了对角采样策略，通过改变蛋白质与沉淀剂的比例，来采样平行于预期溶解度曲线的路径。这种有针对性的策略比传统的正交网格更有效地识别了受控微晶成核和生长的最佳条件。为了展示SX样品制备流程的合理化基础，研究人员将该工作流程应用于五个蛋白质靶标，这些靶标的选择涵盖了多样化的生物物理和结晶空间。该选择包括经过充分表征的基准和模型系统伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）、藻蓝蛋白（phycocyanin）和木聚糖酶（xylanase），以及两个用于时间分辨串行晶体学的靶标：拟南芥（Arabidopsis thaliana）吡哆醛5′-磷酸合酶亚基1.3（AtPdx1.3）和类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）景天庚酮糖-7-磷酸异构酶（BpGmhA）。
本研究旨在开发一种系统化的方法，以克服串行晶体学（SX）中微晶悬浮液制备的瓶颈。目前，SX样品制备严重依赖经验性试错，缺乏对结晶相图的定量指导，导致微晶产量、尺寸和均匀性难以控制，影响了时间分辨实验的效率和成功率。为此，研究人员开发了一种自动化、低体积的油下微滴结晶方法，用于快速绘制全面的相图，并结合微晶种技术，以实现对微晶成核和生长的理性控制。论文发表在《IUCrJ》上，其意义在于将SX样品制备从经验性过程转变为基于相图指导的定量化、可预测流程，为结构生物学，特别是时间分辨研究，提供了更可靠的样品保障。
研究采用的关键技术方法包括：1）自动化油下微滴结晶平台：使用配备四通道分配头的Oryx8机器人，在未处理的疏水性银蒸气批量板（VB-SILVER）上分配2 μl液滴，并覆盖100%石蜡油（HR3-411），以实现无蒸发、稳定的结晶环境。2）对角相空间采样策略：通过自定义脚本和用户界面（通过WaspRun菜单提供），自动化设计和执行对角采样，根据用户定义的角浓度、孔数和最终液滴体积计算分配体积，生成平行于预期溶解度曲线的浓度梯度。3）微晶种技术：使用来自高质量单晶制备的晶种储备液，通过接种将结晶从成核区转移到亚稳态区，以控制晶体尺寸和形态。4）样品放大与优化：将相图确定的优化条件从2 μl微滴放大至10 μl PCR管乃至更大体积（如150 μl或500 μl）的批次制备，并通过调整晶种浓度和混合策略（如涡旋混合）来确保均匀性和可重复性。
**3.1 相图揭示了非常规且复杂的结晶景观**
蛋白质展现出由独特的物理化学性质（如柔性、寡聚状态、溶解度和表面电荷）所控制的巨大结构和功能多样性，这些性质决定了其形成晶体的倾向。虽然一些球状蛋白质显示出经典的相图，但其他蛋白质则呈现出非典型、不可预测的相边界，这些边界在传统的稀疏矩阵或网格筛选中常被忽略。本研究开发的自动化油下微滴方法通过系统采样蛋白质和沉淀剂浓度来绘制整个相图的相边界，从而解决了这一问题。研究人员将这种对角采样策略应用于多个蛋白质靶标，重点研究了拟南芥吡哆醛5′-磷酸合酶亚基1.3（AtPdx1.3）和类鼻疽伯克霍尔德菌菌株K96423的景天庚酮糖-7-磷酸异构酶（BpGmhA）。对于AtPdx1.3，系统性的相图绘制识别了平衡衍射质量与SX实验所需晶体尺寸的精确边界。关键的是，该方法揭示了两个不同的亚稳态区域，只有在添加晶种后才会发生晶体生长。研究人员推测，这两个独立的亚稳态区域（一个在高蛋白质/低沉淀剂浓度，另一个在低蛋白质/高沉淀剂浓度）反映了相互竞争的盐溶（salting-in）和盐析（salting-out）效应。
**3.2 接种相图使得能够进入关键的亚稳态区**
未接种的相图依赖于自发成核，通常包含晶体生长在能量上有利但成核在动力学上受阻的区域。相比之下，微晶种引入了预先形成的（理想情况下是均质的）晶体碎片（晶种），作为晶体生长的模板。通过绕过随机且能量需求高的初级成核步骤，接种促进了蛋白质分子直接附着到现有晶格上。这使得晶体生产可以从成核区转移到亚稳态区，为解耦成核与生长、实现对微晶尺寸和密度的优异控制提供了一条理性途径。对于本研究中调查的五个蛋白质系统，微晶种通过优化现有条件和进入先前无效的亚稳态区域，扩展了可及的结晶相空间。此外，该技术提高了晶体的形态质量。在亚稳态区生长以较低的过饱和度（supersaturation）为特征，与不稳定区相关的快速生长相比，通常促进分子更有序地添加到晶格中。虽然视觉形态并非衍射质量的绝对预测指标，但由此产生的晶体表现出更高的光学均匀性和晶面清晰度，这些是受控生长条件的物理指标，通常是在SX实验中获得高分辨率衍射和低镶嵌度（low mosaicity）所必需的。
**3.3 利用油下微滴相图获取晶体形态**
对BpGmhA的初步96孔稀疏矩阵筛选确定柠檬酸钠和聚乙二醇3350（PEG 3350）是有效的沉淀剂，能持续产生大的、衍射良好的单晶。研究人员选择了这些沉淀剂进行系统的相空间映射，但偏离了传统的蛋白质与沉淀剂相图，而是同时改变了两种沉淀剂的浓度。这种方法生成了一个新的相图，成功识别了BpGmhA的三种不同晶体形态。低沉淀剂浓度有利于小的五边形片状晶体，表明生长由各向异性表面动力学和台阶流动机制（step-flow mechanism）主导，有利于二维扩展；而较高浓度则产生大的菱面体晶体和密集的棒状微晶簇。这些高浓度形态表明是扩散限制的生长，其中结晶的热力学驱动力超过了蛋白质输送到晶体表面的速率。
**3.4 放大油下微滴相图以用于串行晶体学**
虽然油下微滴筛选能快速提供洞察，但放大到适合SX的体积常常受到改变的成核动力学和容器几何形状的阻碍。体积增加通常会加剧过饱和度梯度，导致异质成核和生长，从而使微观条件失效。为了解决这个问题，研究人员将优化工作流程集中在相图上，以指导从2 μl液滴过渡到更大批次的体积。在小型批次试验中使用PCR管（10 μl）验证条件是一种规避风险的策略，可以在脱离石蜡油的同时最大限度地减少样品消耗。自动分配和手动涡旋对于确保充分混合至关重要，可以防止导致异质成核的局部过饱和度梯度。
**讨论与结论**
相图仍然是理性结晶优化的关键但未充分利用的框架。本文提出的自动化油下微滴结晶方法将相图绘制从一个耗样品的障碍转变为高通量工具。通过利用新颖的对角采样策略和少至15–60 μl的蛋白质，研究人员成功识别了通常对标准稀疏矩阵筛选不可见的复杂景观。关键的是，微晶种和晶种储备液滴定的结合使得能够预测性地挽救成核受限的系统。这种系统性的成核与生长解耦提供了一个稳健的机制，可以优先选择针对串行晶体学优化的特定晶体形态，并通过有效超越大晶体形成，确保放大到更大批次时仍具有可重复性。最终，将结晶工作流程围绕接种的油下微滴相图展开，为串行晶体学样品制备提供了一个稳健、理性的策略。
**结论翻译**：相图仍然是理性结晶优化的关键但未充分利用的框架。本文提出的自动化油下微滴结晶方法将相图绘制从一个耗样品的障碍转变为高通量工具。通过利用新颖的对角采样策略和少至15–60 μl的蛋白质，我们成功识别了通常对标准稀疏矩阵筛选不可见的复杂景观。关键的是，微晶种和晶种储备液滴定的结合使得能够预测性地挽救成核受限的系统。这种系统性的成核与生长解耦提供了一个稳健的机制，可以优先选择针对串行晶体学优化的特定晶体形态，并通过有效超越大晶体形成，确保放大到更大批次时仍具有可重复性。最终，将结晶工作流程围绕接种的油下微滴相图展开，为串行晶体学样品制备提供了一个稳健、理性的策略。
