《Materials Today Advances》：A deep learning enabled
in-silico animal study approach for bone tissue engineering
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工程化组织构建体通常通过大量动物研究评估其在体效能，组织学分析是最常用的方法。然而，该技术耗时且高度依赖经验丰富的病理学家，并且难以提供同一组织位点随时间连续变化的深入信息。本研究中，研究人员提出了一种基于深度学习（DL）的模型——骨组织预测生成对抗网络（BT
工程化组织构建体通常通过大量动物研究评估其在体效能，组织学分析是最常用的方法。然而，该技术耗时且高度依赖经验丰富的病理学家，并且难以提供同一组织位点随时间连续变化的深入信息。本研究中，研究人员提出了一种基于深度学习（DL）的模型——骨组织预测生成对抗网络（BTP-GAN），该模型整合合成组织学图像生成与生物组织生长模型，以模拟骨组织随时间的发展。尽管训练数据集较小，生成的组织学图像仍具有生物学意义且真实可信，这得益于三个算法模块：分析模块、生长模块和生成模块。此外，常微分方程（ODE）-Transformer模型能够学习真实组织图像的时间模式和结构特征，从而根据各种特定生成条件生成组织学图像。BTP-GAN仅凭单张输入组织学图像，即可成功展示同一骨组织位点的连续组织学变化。这一计算动物研究可能改变组织工程领域对大量动物研究必要性的认知，并为未来计算组织工程的发展提供实用框架。
本研究旨在解决骨组织工程（BTE）领域中长期存在的核心问题。组织工程涉及利用细胞、生物材料和生化因子的组合开发受损或病变组织的生物学替代物，而工程化组织构建体通常需通过动物研究来评估其有效性和再生组织质量。在诸多评估手段中，组织学图像分析（如苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色（MT）染色）仍是最 prevalent 的技术，被广泛视为研究和临床诊断中组织评估的金标准。与其他非侵入性方法（如显微计算机断层扫描）相比，组织学分析能提供更多关于细胞结构、组织成分和再生过程中基质形成的细节信息。然而，现有方法存在诸多局限性：需要在不同时间点牺牲动物以观察愈合期的组织学变化；采集结果来自多个动物个体，无法原位监测同一标本中的相同感兴趣位点（POI）；动物个体差异和异质性可能影响数据的一致性、准确性和可重复性；样本制备过程耗时，且染色质量控制高度依赖训练有素的病理学家。因此，学界对更快速、廉价、非侵入性乃至非动物性的组织工程产品评估技术存在迫切需求。近年来，美国FDA现代化法案2.0等立法允许使用计算机模拟模型等替代方法进行药物安全评估，表明替代技术已趋于成熟，正在重塑人们对动物模型必要性的认知。
为应对上述挑战，研究人员提出了BTP-GAN模型，这是一种将深度学习与生物学生长模型相结合的创新方法，期望减少用于体内评估的组织支架相关动物模型数量及其实验时间和成本，同时赋予组织学分析堪比非侵入性成像技术的原位监测和追踪能力。
研究使用的主要关键技术方法包括：基于SegFormer架构的语义分割技术（采用ImageNet预训练的MIT-B3作为骨干网络）、逻辑生长曲线与生长图相结合的时间序列掩模合成方法、以及由向量量化生成对抗网络（VQGAN）和ODE-Transformer组成的两阶段图像生成框架。样本来源于先前未发表的Wistar大鼠颅骨缺损模型体内研究，包含自然生长组（有无电刺激）、聚己内酯（PCL）支架组（有无电刺激）四种实验条件，30天、60天和120天三个时间点的142张MT染色图像。
分析模块方面，研究人员开发了基于Transformer的语义分割神经网络，处理原始组织学图像并将像素自动分类为预定义类别。该模块采用SegFormer架构，结合卷积神经网络（CNN）的归纳偏置和Transformer的全局建模能力，成功建立了输入图像与手动标注之间的因果关系。定量结果显示，对于软结缔组织等组织学元素充足的类别， dice 分数稳定且准确；对于骨样组织和血管等元素较少的类别，结果亦可接受且实际可用。自动分割掩模与手动标注之间差异较小，表明该模块在识别和分割组织学图像目标元素方面具有可靠性。
生长模块方面，该模块将掩模中的分割元素面积随时间推移按天然骨组织生长方式进行增长和变化。模块解耦为生长曲线和生长图两个组件：生长曲线采用S形逻辑曲线描述组织类型的时间动态，不同组织类型的曲线相对差异可用于估计各组织类型的比例贡献；生长图则通过欧氏距离图及其逆图的合并与阈值化处理，建模组织发育的空间属性，反映组织在二维平面上的生长趋势和位置边界信息。基于Day 30的输入掩模，该模块生成Day 60和Day 120的时序掩模，显示软结缔组织区域扩展、致密结缔组织从软结缔组织区域起源、以及最终矿化组织占据主导区域的动态过程，与动物研究发现的骨组织再生序列一致。
生成模块方面，该模块处理生长模块产生的新时序掩模并生成相应的合成组织学图像。第一阶段利用VQGAN将原始图像编码为低维量化表示，通过自重建任务训练高效的离散表示系统和高质量图像重建能力；第二阶段使用ODE-Transformer学习条件语义图像合成，其中ODE求解器建模组织图像风格的连续时间动态，Transformer则预测码本向量的概率分布。该框架明确将组织形态学和生长序列作为模拟组织再生的关键因素，而非采用黑箱式的图像到图像翻译方法。研究以电刺激和支架作为特定生成条件，结果显示：仅电刺激条件下形成的血管和管腔更多；仅支架条件下更倾向于骨组织形成而非血管化，且纤维基质排列更有序；两者联合则显示协同效应，骨样组织或成熟骨组织增加而管腔减少。此外，模块还可进行前向时间模拟（从Day 30预测未来状态）、后向时间重构（从Day 120重建早期状态，作为学习到的连续时间轨迹上的插值解释）以及无输入掩模时的图像生成。
讨论部分，研究人员指出BTP-GAN模型代表了针对BTE的一种新型计算动物研究方法，将深度学习算法与生物学生长模型相整合。与传统非侵入性观察方法（如计算机断层扫描CT、磁共振成像MRI、正电子发射断层扫描PET）相比，该方法能提供细胞或蛋白质水平的组织组成信息；与侵入性组织学分析相比，该方法可实现同一组织位点的连续观察。与需要大量数据的扩散模型不同，VQGAN利用离散视觉tokens捕获重复结构模式，可更有效利用有限数据进行组织学图像合成。ODE-Transformer的连续时间表述使其能够在任意中间时间点评估学习到的潜在动态，赋予模型离散模型无法实现的时序插值能力。定量Fréchet Inception Distance（FID）指标显示，BTP-GAN优于GauGAN、Pix2PixHD等基线方法；替换ODE-Transformer为循环神经网络（RNN）后FID分数增加，证明了基于ODE设计的必要性。 supplementary 的每图像Inception Feature Distance（IFD）及配对t检验进一步验证了BTP-GAN的优越性。
研究结论指出：BTP-GAN模型是一种概念验证性的基于深度学习的计算动物研究原型，能够从单张输入MT染色图像生成真实且具有生物学意义的连续骨再生组织学阶段图像。该模型由三个功能模块组成：自动将原始组织学图像像素分类为预定义类别的分析模块；使模拟组织成分按天然骨组织再生进程随时间增长和转化的生长模块（采用简捷有效的逻辑曲线）；以及由VQGAN和ODE-Transformer驱动、能学习真实组织图像时间模式和结构特征并据此生成图像的生成模块。尽管BTP-GAN成功展示了同一解剖组织位点随时间的连续组织学变化，但仍需显著改进，包括扩大训练数据集规模、通过整合多模态非侵入性跨尺度成像融合增强组织生长动力学、以及纳入更多细胞和结构监督信号。这一开创性的计算动物研究可能改变组织工程领域对大量动物研究必要性的认知，并为未来计算组织工程的发展提供实用框架。
