通过靶向蛋白质组学方法对混合奶酪进行定性和定量分析

《Journal of Dairy Science》：Qualitative and quantitative analysis of mixed-milk cheeses by targeted proteomics

　　E. Wims | T.F. O'Callaghan | B. McCarthy | D. Flynn | E. Serra | P. Dillon | D. Ryan | J.P. Murphy | M. Dineen
Teagasc，动物与草地研究与创新中心，Moorepark，Fermoy，科克郡，爱尔兰。P61 P302

**摘要**
本实验旨在研究合成氮肥施用量对饲喂多年生黑麦草（PRG）或PRG-白三叶草（WC）草料的奶牛的产奶量、采食量、消化率和氮排泄量的影响。最初在春季招募了12头经过反刍管插管的多次产犊荷斯坦弗里斯兰奶牛，平均妊娠天数（DIM）为66 ± 12天，体重（BW）为492 ± 41公斤，进行为期14天的适应期。随后，这些奶牛被随机分配到4种不同的日粮处理组（DT）中，采用不完全交叉设计，每个处理组包含2个22天的实验期。这一实验方案在秋季重复进行，此时奶牛的平均妊娠天数为216 ± 12天，体重为512 ± 37公斤。4种日粮处理组分别为：
1) 每公顷每次刈割施用25公斤合成氮肥的PRG（G-L）；
2) 每公顷每次刈割施用50公斤合成氮肥的PRG（G-H）；
3) 每公顷每次刈割不施用合成氮肥的PRG-WC（GC-L）；
4) 每公顷每次刈割施用25公斤合成氮肥的PRG-WC（GC-H）。

**结果分析**
1. **产奶量和乳固形物产量**：
- 春季，施用25公斤合成氮肥的PRG组（G-L）的产奶量低于施用50公斤合成氮肥的PRG组（G-H）（分别为23.4公斤/天和26.8公斤/天），乳固形物产量也低于其他两组（分别为1.53公斤/天、1.92公斤/天和1.99公斤/天）。
- 秋季，施用50公斤合成氮肥的PRG-WC组（GC-H）的脂肪产量高于不施用合成氮肥的PRG-WC组（GC-L）（分别为0.89公斤/天和0.78公斤/天），乳固形物产量与其他两组相当（分别为1.70公斤/天、1.53公斤/天和1.58公斤/天）。

2. **干物质（DM）和有机物质（OM）的摄入量及消化率**：
- 春季，各处理组之间的DM和OM摄入量无显著差异。
- 秋季，施用50公斤合成氮肥的PRG-WC组（GC-H）的DM和OM摄入量高于其他处理组。
- 无论在春季还是秋季，不施用合成氮肥的PRG-WC组（GC-L）的DM消化率均低于其他处理组。
- 春季，不施用合成氮肥的PRG-WC组（GC-L）的OM消化率低于其他处理组；秋季，施用25公斤合成氮肥的PRG-WC组（GC-H）的OM消化率低于施用50公斤合成氮肥的PRG-WC组（GC-H）。

3. **氮摄入量、尿氮浓度和尿氮排泄量**：
- 春季，施用50公斤合成氮肥的PRG组（G-H）的氮摄入量、尿氮浓度和尿氮排泄量均高于其他处理组。
- 秋季，施用25公斤合成氮肥的PRG-WC组（GC-H）的氮摄入量和尿氮排泄量高于不施用合成氮肥的PRG-WC组（GC-L）和施用25公斤合成氮肥的PRG组（GC-H）（分别为800克/天、818克/天、608克/天和447克/天、439克/天、265克/天、247克/天）。
- 春季各处理组之间的尿氮排泄量无显著差异；秋季，施用25公斤合成氮肥的PRG-WC组（GC-H）和施用50公斤合成氮肥的PRG-WC组（GC-H）的尿氮排泄量高于不施用合成氮肥的PRG-WC组（GC-L）和施用25公斤合成氮肥的PRG组（GC-H）（分别为66.0公斤/天、64.6公斤/天、47.3公斤/天和46.8公斤/天）。

**结论**
总体而言，将PRG草场的合成氮肥施用量减少25公斤/公顷对动物表现、采食量和消化率没有显著影响，但有助于改善春季的氮排泄情况。然而，这种氮排泄优势在秋季并未体现。同样，施用较低剂量合成氮肥的PRG-WC草料的奶牛在春季表现出更优的氮排泄效果；但由于秋季白三叶草比例过高，这类奶牛的氮摄入量、尿氮排泄量和尿量均高于仅施用PRG草料的奶牛。这表明需要采取额外措施来有效减少高淋溶风险时期的尿氮排泄。

**引言**
基于牧草的系统每年每公顷需要200至300公斤氮肥来维持高质量草场的生产速度（Enriquez-Hidalgo等，2016；Chapman等，2018）。通常，这些氮肥以合成氮肥的形式施用于多年生黑麦草（Lolium perenne L.）草场。欧洲的绿色协议（EC，2019）和从农场到餐桌战略（EC，2020a）等政策倡议设定了到2030年减少20%合成氮肥使用量的目标，旨在减少农业系统的氨、一氧化二氮和硝酸盐淋溶以及合成氮肥工业生产过程中的二氧化碳排放（Herron等，2021）。然而，预计全球人口将在2084年达到约103亿（联合国，2024），加之生活水平的提高，预计将对动物源性食品的需求大幅增加（Alexandratos & Bruinsma，2012；OECD-FAO，2025）。若缺乏系统创新，合成氮肥使用的减少将限制农场饲料生产及自给能力，进而增加对进口饲料的依赖，可能破坏欧盟政策的环境和食品安全目标。

研究表明，在PRG草场中加入白三叶草（Trifolium repens L.）等饲料豆科植物可减少维持草场生产力所需的合成氮肥量（减少100公斤/公顷；Egan等，2018；Murray等，2024），同时提高奶牛的产奶效率（当白三叶草比例超过20%时效果更明显（McClearn等，2019）。由于白三叶草具有生物固氮（BNF）能力，植物可利用的氮素供应更为缓慢且与植物吸收同步（Ledgard等，2009），从而提高氮素利用效率（NUE）。Hennessy等（2019）指出，在基于牧草的奶牛系统中，即使考虑BNF效应，PRG-WC草场的NUE也高于纯PRG草场（分别为51%和40%）。因此，在合成氮肥施用受限的情况下，加入饲料豆科植物是一种有前景的创新策略，有助于维持草场生产力、动物表现和人类食品生产。

**关键挑战**
随着生物固氮作用的增强，必须减少合成氮肥的投入以避免总氮输入量的增加。Ledgard等（2009）发现，无论氮素来源是生物固氮还是合成氮肥，总氮输入量的增加会导致可淋溶的硝酸盐氮量呈指数级增长。反刍动物的营养生理机制无法区分这两种氮源，过量氮素会被排出体外，形成土壤中的氮沉积（Selbie等，2015）。这种可溶性氮素通过硝酸盐淋溶易从生产系统中流失（Di和Cameron，2007；Selbie等，2015），尤其是在土壤湿度高、降雨量大、牧草生长缓慢和蒸散量低的晚秋和冬季。

**研究方法**
实验于2022年春季（4月至5月）和秋季（9月至11月）在爱尔兰科克郡Fermoy的Teagasc动物与草地研究与创新中心进行（坐标：52°16′N, 8°25′W；海拔49米）。土壤类型为排水良好的酸性棕壤至壤土。实验获得了爱尔兰Dublin卫生产品监管局的批准（实验许可证AE19132-P150），依据欧盟指令2010/63/EU和2012年法规（欧盟，2012）。气象数据来自科克郡Fermoy的气象站，记录了每日气温（°C）、100毫米深度的土壤温度（°C）和降雨量（毫米）。

**实验设计**
最初招募了12头经过反刍管插管的多次产犊荷斯坦弗里斯兰奶牛，平均妊娠天数为66 ± 12天，体重为492 ± 41公斤，进行为期14天的适应期，期间所有奶牛共同放牧于每公顷每次刈割施用25公斤合成氮肥的纯PRG草场，并补充0.90公斤干物质的标准浓缩饲料。适应期结束后，奶牛被随机分配到4种日粮处理组中，每个处理组包含2个22天的实验期。奶牛首先在每个处理组适应14天后进入8天的测量期，随后再次调整到另一个处理组进行第二个14天的适应期，最后进行最后一个8天的测量期。每个处理组内的奶牛随机交叉到其他处理组。在14天的适应期内，奶牛在户外饲料垫设施中食用相应日粮；测量期间则单独关在代谢棚内，可自由饮水。秋季实验重复了相同的方案，此时奶牛的平均妊娠天数为216 ± 12天，怀孕时间为148 ± 12天，体重为512 ± 37公斤。秋季适应期内，所有奶牛共同放牧于每公顷每次刈割施用25公斤合成氮肥的纯PRG草场，并补充0.88公斤干物质的标准浓缩饲料。春季实验从4月初持续到5月底，秋季实验从9月底持续到11月初。实验开始前，奶牛的乳固形物产量和体重已平衡。标准浓缩饲料的成分（按鲜重计）包括：玉米粉28.7%、玉米酒糟25.0%、大豆皮20.0%、未压榨甜菜浆10%、液体糖蜜7%、大豆粉3.5%、氧化镁2.9%、碳酸钙1.2%、氯化钠0.8%、矿物质和维生素0.6%、脱氟磷0.4%。标准浓缩饲料的化学成分如下：干物质含量89.1 ± 1.4%，粗蛋白（CP）含量16.1 ± 0.3%，可溶性氮（% of N）含量59.7 ± 0.2%，非降解氮（NDIN）含量16.0 ± 0.7%，ADIN含量3.8 ± 0.3%，淀粉酶和亚硫酸钠处理后的NDF（aNDIFom）含量28.1 ± 0.5%，WSC含量9.5 ± 0.4%，灰分含量10.6 ± 0.2%。12小时、72小时和120小时后的uNDFom残留量（占aNDFom的百分比）分别为60.9 ± 4.9%、10.9 ± 0.4%和10.9 ± 0.4%。

**饮食处理、草料管理和草料测量**
4种饮食处理（DT）如下：
1) 接受25公斤/公顷/割的合成氮（G-L）的PRG；
2) 接受50公斤/公顷/割的合成氮（G-H）的PRG；
3) 不接受合成氮（GC-L）的PRG-WC；
4) 接受25公斤/公顷/割的合成氮（GC-H）的PRG-WC。
选择这些合成氮的施用量是为了代表当前在牧场系统中使用的策略。由于在整个实验过程中草料都是通过机械方式收割并直接提供给动物的，因此也考虑到了没有动物粪便中的氮返回到草料中的情况。对于仅接受PRG的草场，选择了25公斤和50公斤/公顷/割的合成氮的施用量，分别代表中等施用量（即每年每公顷125公斤合成氮）和当时的最大允许施用量（即每年每公顷250公斤合成氮）。其中一种PRG-WC处理也采用了同样的中等施用量25公斤/公顷/割，因为这些草场可以利用生物固氮（BNF）。最后一种处理不接受任何合成氮，以模拟完全依赖生物固氮而非合成氮的牧场系统。为了生成这些饮食处理，设置了两个实验区（每个3公顷），其中一个只包含PRG，另一个包含PRG和WC的混合草场。现有的草场是在2020年5月建立的。建立时，之前的草场被喷洒了草甘膦并进行了翻耕，然后通过圆盘耙和动力耙将地面整平至5厘米深。种子以1厘米的深度播种，并进行了压平。仅包含PRG的草场的播种量为32公斤/公顷（16公斤AstonEnergy，16公斤Abergain），而PRG-WC草场的播种量为27公斤/公顷（13.5公斤AstonEnergy，13.5公斤Abergain）加上5公斤/公顷的WC（Coolfin）。在当前实验之前，最近一次合成氮的施用量为2021年9月的25公斤/公顷。

**实验设计**
为了生成这些饮食处理，设置了两个实验区（每个3公顷），其中一个只包含PRG，另一个包含PRG和WC的混合草场。现有的草场是在2020年5月建立的。建立时，之前的草场被喷洒了草甘膦并进行了翻耕，然后通过圆盘耙和动力耙将地面整平至5厘米深。种子以1厘米的深度播种，并进行了压平。仅包含PRG的草场的播种量为32公斤/公顷（16公斤AstonEnergy，16公斤Abergain），而PRG-WC草场的播种量为27公斤/公顷（13.5公斤AstonEnergy，13.5公斤Abergain）加上5公斤/公顷的WC（Coolfin）。在当前实验之前，最近一次合成氮的施用量为2021年9月的25公斤/公顷。每个实验区进一步划分为8个相等的地块（每个0.375公顷；每种饮食处理4个地块），以便在适用的情况下施用合成氮。从2022年1月到2月，所有饮食处理区的草料被均匀收割，以确保春季实验有稳定的草料供应。每种饮食处理的4个重复地块以交错的方式轮作，以便在整个实验期间都有相似生长年龄的草料供应。收割后，向相应的饮食处理区施用了25或50公斤/公顷的合成氮，形式为保护性尿素（N-(n-丁基)硫磷酰胺；含氮量46%；Goulding Chemicals Ltd.，Centre Park Road, Marina, Cork, Ireland）。GC-L饮食处理不接受任何合成氮。这些合成氮的施用量在整个放牧季节保持不变，直到9月中旬停止施用合成氮（DAFM, 2022）。2022年期间，G-L、G-H、GC-L和GC-H地块分别接受了6次、6次、0次和6次合成氮的施用，相当于每年每公顷150公斤、300公斤、0公斤和150公斤的合成氮。由于季节性生长模式，每次合成氮施用与收割之间的再生间隔在春季平均为18天，在秋季为34天。在春季和秋季实验之间，保持相同的特定饮食处理合成氮施用量，并将草场保存为青贮饲料。7月，实验区接受了34公斤/公顷的钾（硫酸钾；含钾42%，含硫16%；Goulding Chemicals Ltd., Centre Park Road, Marina, Cork, Ireland）。

**收割和饲喂**
草场每天在08:00和15:30使用GrassTech Grazer GT80（Future Grass Technology, Borris, Co., Carlow, Ireland）收割两次。草料在离地面4厘米的高度被收割。在14天的适应期内，每天在收割时给奶牛提供两次草料。在8天的测量期内，每天在06:30、08:30、10:30、12:30、14:30、16:30、18:30和20:30给奶牛提供8次草料，每次喂食之间将草料冷藏在4°C以减少呼吸作用（如Dineen等人（2020）所述）。记录每头奶牛的采食量，并在次日上午07:30收集剩余草料并称重。根据需要调整饲喂量，使剩余草料占采食量的5%到10%。收割后，对每个饮食处理区的草料进行采样并在90°C下干燥16小时以确定干物质（DM）含量。每天对每头奶牛的剩余草料进行采样并冷冻在-20°C以备后续化学分析。在适应期和实验期间，所有奶牛每天还补充标准浓缩饲料（春季每头奶牛0.90公斤DM，秋季每头奶牛0.88公斤DM）。浓缩饲料在挤奶时分两次喂食；记录每次喂食的量，并在每个8天的测量期内收集和称重任何剩余的浓缩饲料。每隔一天采集浓缩饲料样本并在60°C下干燥64小时。

**草料产量和营养成分**
在收割前，使用Etesia割草机（Etesia UK. Ltd., Warwick, Co., Carlow, Ireland）在每个地块切割两条1.2米×10米的草带，高度为4厘米，以确定预收割草料的产量。收割后的材料被称重，并取100克样品在90°C下烘干16小时以确定干物质浓度。草场密度按照Dineen等人（2021）的方法计算：使用上升板测量仪（直径355毫米，Jenquip，Feilding, NZ）记录收割前后两次的10个压缩草高测量值，然后计算草场密度：
\[ \text{草场密度} = \frac{\text{预收割草料产量（公斤/公顷）}{\text{预收割压缩草高（厘米）} \times \text{收割后压缩草高（厘米）/公顷} \]
此外，使用上述上升板测量仪在每个地块的对角线上测量30个压缩草高，以确定预收割时的压缩草高。根据Dineen等人（2021）的方法计算预收割草料产量：
\[ \text{预收割草料产量（公斤/公顷）} = \left[ \text{预收割压缩草高（厘米）} - 4 \text{厘米} \right] \times \text{草场密度（公斤/公顷·厘米） \]
收割后，使用上升板测量仪在每个地块记录30个压缩草高测量值以确定收割后的压缩草高。在收割前，使用Gardena手剪（Accu 90, Gardena International GmbH, Ulm, Germany）在每个GC-L和GC-H地块随机选取15到20个样本，切割至4厘米高度。将样本混合后，取70克样品并分离成PRG和WC部分，在90°C下烘干16小时以确定其比例。

**动物测量**
奶牛每天在07:30和15:30挤奶两次。每次挤奶时记录个体产奶量（Dairymaster, Causeway, Co. Kerry, Ireland）。在8天的测量期内，每次挤奶时收集奶样，并使用中红外光谱分析（Milkoscan 7, Foss Electric, Hiller?d, Denmark）分析脂肪、粗蛋白（CP）和乳糖浓度。计算乳固体[脂肪（公斤）+蛋白质（公斤）]、ECM（Tyrrell and Reid, 1965）和饲料效率（ECM/DMI）。在每次测量期前后一天使用电子便携式称重秤和Winweigh软件包（Tru-test Limited, Auckland, New Zealand）测量体重。同时由经验丰富的观察者根据0.25单位的增量在1到5的范围内记录体况评分（Edmonson et al., 1989）。

在每个8天的测量期内，奶牛佩戴外部背带，背上装有粪便收集围裙。将粪便收集到每头奶牛正后方的托盘中。每天称重并记录前24小时的总粪便量。称重后，手动混合粪便并将2个样本立即冷冻在-20°C以备后续化学分析。为了便于分离尿液和粪便，在每头奶牛的外阴周围安装了乳胶尿液分离器。尿液被引导到一个60升的收集桶中，每10升尿液加入100毫升9摩尔硫酸以防止氮挥发。每天称重并记录前24小时的总尿液量。称重后，尿液立即冷冻在-20°C以备后续化学分析。在每个8天的测量期内，第1天到第6天的数据均纳入当前分析。

**实验室分析和计算**
所有草料和粪便样本在-55°C的LS40+chamber（MechaTech Systems Ltd., Bristol, UK）中冷冻干燥约96小时，直至达到恒定重量。浓缩饲料样本在60°C下烘干64小时。干燥后，使用Cyclotech 1093样品研磨机（Foss, DK-3400）通过1毫米筛网研磨。草料、浓缩饲料和粪便样本分别按照AOAC（2000；方法942.05）分析灰分、氮（使用Leco FP-928分析仪（Leco Corp., St Joseph, Michigan, US）、aNDFom（Mertens, 2002）和uNDFom（在体外用瘤胃液处理后，如Dineen等人（2020）所述）。草料样本还使用Morgan等人（1989）的方法分析体外有机物消化率（OMD），使用FibertecTM系统（FOSS, Ballymount, Dublin 12, Ireland）分析ADF（包括灰分残渣），使用ANKOM技术（Macedon, NY, USA；AOAC（1995；方法973.18）分析WSC，以及根据Hall（2014）的方法分析可溶性氮（NDIN）和ADIN。冷冻的尿液样本解冻后，立即使用上述Leco FP-928分析仪分析氮浓度。

**总消化道表观消化率**
首先从每种营养素的摄入量中减去粪便中的相应量，然后除以总摄入量，从而确定总消化道表观消化率。氮的分配通过将尿液、粪便或牛奶中回收的氮量除以总氮摄入量来计算。未计入的氮量计算为氮摄入量减去尿液、粪便和牛奶中氮的总和。

**统计分析**
所有数据使用SAS版本9.4（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）中的MIXED程序中的线性混合效应模型进行分析，模型如下：
\[ Yijkl = μ + DTi + Sj + DTSij + Pkj + DTPikj + Clj + εijkl, \]
其中 \( Yijkl \) 是因变量，\( μ \) 是总体均值，\( DTi \) 是饮食处理i的固定效应，\( Sj \) 是季节j的固定效应，\( DTSij \) 是饮食处理i和季节j的固定交互效应，\( Pkj \) 是嵌套在季节j内的时期k的固定效应，\( DTPikj \) 是饮食处理i和时期k的固定交互效应，\( Clj \) 是嵌套在季节j内的奶牛l的随机效应，\( εijkl \) 是残差误差。当 \( P > 0.1 \) 时，从模型中去除包含DT和P的交互项。使用Tukey–Kramer方法进行多个处理均值之间的比较。当DT和季节的固定交互效应显著时，使用SLICE选项比较同一季节内的DT。如果 \( P ≤ 0.05 \) 则认为具有统计显著性，如果 \( 0.05 < P ≤ 0.10 \) 则认为具有统计趋势。

**结果**
2022年春季和秋季实验期间的气象数据见表1。实验期间的平均月平均气温和土壤温度与过去10年的平均值一致。7月和8月的总降雨量低于平均值，而9月、10月和11月的总降雨量高于过去10年的平均值。9月、10月和11月的降雨量分别比过去10年的平均值多73毫米、124毫米和65毫米。

**表1. 实验期间的平均气温、土壤温度和总降雨量与过去10年平均值（2012至2021年）的比较**
| 项目 | 2022年 | 过去10年平均值 |
|------------|---------------|-------------|
| 平均气温（°C） | 7.4 | 5.9 |
| | 6.7 | 6.7 |
| | 9.1 | 7.2 |
| | 12.4 | 8.5 |
| | 13.8 | 11.3 |
| | 16.6 | 13.4 |
| | 16.8 | 13.7 |
| | 12.2 | 10.6 |
| | 9.0 | 9.0 |
| | 10-年平均值 | 5.8 |
| | 7.2 | 7.2 |
| | 10.4 | 10.0 |
| | 14.1 | 13.6 |
| | 16.1 | 15.3 |
| | 13.4 | 10.6 |
| | 12.9 | 9.0 |
| | 11.5 | 7.7 |
| | 10-年平均值 | 10.6 |
| | 968 | 944 |
| | 836 | 873 |
| | 733 | 651 |
| | 428 | 342 |
| | 230 | 165 |
| | 106 | 774 |
| | 736 | 671 |
| | 100 | 100 |

**饮食营养价值**
实验中使用的草料的预收割产量、WC比例和营养价值见表2。春季的草料预收割产量高于秋季（分别为1,684公斤/公顷和1,322公斤/公顷）。在两个季节中，与GC-H草地相比，GC-L草地的WC（水溶性碳水化合物）比例更高。秋季的WC比例高于春季，平均占草地干物质的53%。春季的草料干物质浓度高于秋季（分别为18.1%和13.4%）。春季时，G-H草地的草料粗蛋白（CP）最高（占干物质的18.9%），G-L和GC-H草地分别为16.3%和15.4%，而GC-L草地最低（占干物质的12.8%）。秋季，PRG-WC草地的草料CP平均高于仅种植PRG的草地（分别为24.8%和19.2%）。

表2. 实验中使用的割前产量、割前高度、白三叶草比例和草料营养价值（平均值±标准差）

项目 春季 秋季
G-L G-H GC-L GC-H GC-L GC-H
割前产量（kg DM/ha） 154 817 161 182 122 167 107 131 185
割前草地高度（cm） 10.0 ± 1.4 10.5 ± 0.9 9.6 ± 0.1 11.0 ± 0.5 9.4 ± 1.6 10.2 ± 0.8 7.4 ± 0.1 10.0 ± 1.2
白三叶草比例（% DM） —— 23.5 ± 12.7 13.3 ± 5.3 —— 64.5 ± 18.5 42.0 ± 7.6
草料干物质（%） 18.0 ± 2.4 16.5 ± 2.2 19.7 ± 2.7 18.1 ± 2.4 14.5 ± 1.5 14.0 ± 1.4 12.4 ± 1.1 12.8 ± 0.9
草料粗蛋白（% DM） 16.3 ± 0.1 18.9 ± 0.3 12.8 ± 1.0 15.4 ± 0.6 18.6 ± 1.1 19.7 ± 0.2 25.9 ± 0.9 23.6 ± 0.2
可溶性氮（% N） 63.1 ± 4.5 67.5 ± 6.0 61.1 ± 1.8 64.1 ± 4.5 60.2 ± 0.8 61.0 ± 0.1 61.6 ± 2.0 61.8 ± 2.6
非可溶性氮（% N） 7.0 ± 1.1 6.3 ± 0.8 7.8 ± 0.7 7.2 ± 1.1 6.8 ± 0.1 6.5 ± 0.1 6.0 ± 0.7 6.2 ± 0.6
ADIN（% N） 2.2 ± 0.1 1.8 ± 0.2 3.0 ± 0.4 2.7 ± 0.5 2.6 ± 0.2 2.3 ± 0.4 1.9 ± 0.1 2.3 ± 0.3
总氮消化率（% DM） 32.8 ± 2.5 33.7 ± 2.9 31.7 ± 2.7 32.3 ± 2.5 34.4 ± 0.8 35.4 ± 0.6 24.5 ± 0.4 29.9 ± 0.2
24小时总氮消化率（% aNDFom） 47.7 ± 1.4 52.1 ± 2.7 69.9 ± 7.9 54.6 ± 6.8 61.8 ± 3.2 57.6 ± 2.8 59.5 ± 10.6 54.2 ± 9.2
24小时非可溶性氮消化率（% aNDFom） 25.3 ± 3.6 25.1 ± 2.7 30.6 ± 3.5 29.7 ± 6.6 44.2 ± 7.8 29.2 ± 4.3 33.1 ± 10.5 39.1 ± 2.5
24小时非可溶性氮消化率（% aNDFom） 13.2 ± 1.1 11.6 ± 0.7 14.2 ± 3.2 15.3 ± 0.5 19.3 ± 0.7 16.4 ± 0.4 23.3 ± 0.7 18.6 ± 0.3
24小时非可溶性氮消化率（% aNDFom） 11.0 ± 1.0 11.5 ± 1.5 13.0 ± 2.7 13.0 ± 1.2 17.5 ± 0.1 15.3 ± 0.1 15.3 ± 0.1 18.6 ± 0.4
24小时非可溶性氮消化率（% aNDFom） 12.4 ± 1.1 1.8 ± 0.2 3.0 ± 0.4 2.7 ± 0.5 2.6 ± 0.2 2.3 ± 0.4 1.9 ± 0.1 2.3 ± 0.3
水分溶性碳水化合物（% DM） 24.9 ± 1.2 21.8 ± 2.4 26.8 ± 3.5 26.6 ± 2.1 16.0 ± 2.9 16.9 ± 2.4 11.7 ± 0.2 14.5 ± 0.6
灰分（% DM） 8.0 ± 0.1 8.7 ± 0.2 8.0 ± 0.1 8.1 ± 0.2 10.6 ± 1.9 11.0 ± 2.4 14.4 ± 3.9 12.4 ± 2.5
体外有机质消化率（% OM） 86.2 ± 0.9 85.9 ± 0.8 85.6 ± 1.4 85.9 ± 0.8 83.0 ± 0.5 83.8 ± 0.1 84.1 ± 0.8 83.7 ± 0.3

**动物表现**
合成氮施用量和草地种类对牛奶产量（P < 0.01）、粗蛋白产量（P < 0.01）、脂肪产量（P < 0.01）、蛋白质产量（P < 0.01）、乳糖产量（P < 0.01）和乳固体产量（P < 0.01）有显著影响。春季，饲喂GC-L草地的奶牛的粗蛋白、脂肪和乳固体产量低于饲喂G-L和G-H草地的奶牛，其牛奶、蛋白质和乳糖产量也低于饲喂G-H草地的奶牛。秋季，饲喂GC-H草地的奶牛脂肪产量较高（+14%），乳固体产量也较高（+11%），但与饲喂G-H草地的奶牛相似（P > 0.05）。在春季和秋季，合成氮施用量和草地种类对牛奶脂肪、蛋白质或乳糖浓度以及饲料效率、体重（BW）和体况评分（BCS）均无影响（P > 0.05）。

表3. 合成氮施用量和草地种类对春季和秋季奶牛牛奶生产、饲料效率、体重和体况评分的影响

**摄入量和表观消化率**
合成氮施用量和草地种类对干物质（DM）、有机质（OM）、总氮消化率（aNDFom）和未消化总氮消化率（uNDFom）的摄入量有影响（见表4）。春季，饲喂GC-L草地的奶牛的aNDFom摄入量低于饲喂G-L和G-H草地的奶牛，但与饲喂GC-H草地的奶牛相似。秋季，饲喂GC-H草地的奶牛的DM和OM摄入量高于其他处理组的奶牛（P < 0.01）。秋季，饲喂GC-L草地的奶牛的aNDFom摄入量低于其他处理组的奶牛。在春季和秋季，合成氮施用量和草地种类对体重或体况评分的变化均无影响（P > 0.05）。

表4. 合成氮施用量和草地种类对春季和秋季奶牛摄入量和表观消化率的影响

**氮摄入量和全身氮分配**
表5. 合成氮施用量和草地种类对奶牛氮摄入量、尿液中氮含量、粪便中氮含量和氮分配的影响

**氮摄入量和全身氮分配**
表5显示了合成氮施用量和草地种类对奶牛氮摄入量、尿液中氮含量、粪便中氮含量和牛奶中氮含量的影响。春季，饲喂GC-L草地的奶牛氮摄入量最低（353 g/d），而饲喂G-H草地的奶牛氮摄入量居中（分别为436 g/d和442 g/d）。秋季，饲喂GC-L草地的奶牛氮摄入量高于其他处理组的奶牛。在春季，饲喂GC-H草地的奶牛尿液中氮含量最高（533 g/d），而饲喂G-L草地的奶牛尿液中氮含量最低（353 g/d）。在秋季，饲喂GC-L草地的奶牛粪便中氮含量低于其他处理组的奶牛。在春季，饲喂GC-H草地的奶牛氮消化率低于其他处理组的奶牛；而在秋季，饲喂GC-L草地的奶牛氮消化率低于饲喂G-H草地的奶牛。在春季，不同处理组（DT）之间的尿量没有差异（P > 0.05），而在秋季，喂食GC-L和GC-H的奶牛尿量比喂食G-L和G-H的奶牛更多（分别为66.0、64.6、47.3和46.8公斤/天）。在秋季，喂食GC-L的奶牛粪便干物质（DM）浓度高于其他DT处理的奶牛；同时，喂食GC-L和GC-H的奶牛粪便DM产量也高于喂食G-H的奶牛，但与喂食G-L的奶牛相似。在春季，喂食G-H的奶牛粪便中可溶性非纤维（aNDFom）的产量低于喂食GC-L和GC-H的奶牛，但与喂食G-L的奶牛相当；而在秋季，喂食GC-L的奶牛粪便中aNDFom的产量低于喂食G-L的奶牛，但与喂食G-H和GC-H的奶牛相似。

表6. 合成氮施用量和牧草种类对奶牛春季和秋季排泄物产量的影响

| 项目 | 春季 | 秋季 | SEM值 |
|-----------|---------|---------|--------|
| G-L | 26.8a | 32.1a | 24.4a |
| G-H | 27.0a | 46.8b | 66.0a |
| GC-L | 47.3a | 64.6a | 2.09 |
| DT | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
| 粪便鲜重（kg/d） | 40.3 | 37.4 | 39.4 |
| 粪便DM（%） | 9.5a | 9.9a | 9.7a |
| 粪便DM（kg/d） | 3.8a | 3.6a | 3.7a |
| 粪便OM（kg/d） | 3.1 | 2.9 | 3.0 |
| 粪便aNDFom（kg/d） | 1.29a | 1.15b | 1.42a |

**注：**
1. DT = 饲养处理；S = 季节。
2. G-L = 每公顷每次刈割施用25公斤合成氮的多年生黑麦草；G-H = 每公顷每次刈割施用50公斤合成氮的多年生黑麦草；
3. GC-L = 每公顷每次刈割施用0公斤合成氮的多年生黑麦草-白三叶草；GC-H = 每公顷每次刈割施用25公斤合成氮的多年生黑麦草-白三叶草。
4. a表示差异显著（P ≤ 0.05）；b表示差异不显著（P > 0.05）。

**讨论**
通过确定合成氮施用量和生物量氮（BNF）的最佳组合，基于牧草的系统可以在减少环境氮排放的同时维持或提高人类食物生产。值得注意的是，在秋季实验中，GC-L和GC-H处理组的杂草纤维素（WC）比例过高（分别为64.5%和42%）。这可能是由于整个生长季节对牧草的反复机械收割以及WC的季节性生长模式所致（Walsh等人，2025年）。我们的目标是使杂草纤维素比例达到20-30%，但这超出了管理范围。

**动物表现**
在仅使用多年生黑麦草（PRG）的饲料中，合成氮施用量适度减少（即每公顷每次刈割25公斤氮）通常对动物表现、采食量和消化率没有影响。尽管在秋季喂食G-L的奶牛的有机 matter（OMD）较低，但对牛奶产量和成分没有影响。Peyraud和Astigarraga（1998年）的综述指出，减少合成氮的施用量对PRG牧草的OMD和净能量含量几乎没有影响；而在喂食PRG的奶牛中，非氨氮（non-ammonia N）进入十二指肠的流量仅略有下降。Astigarraga（2002年）和Macle（1996年）的研究也表明，合成氮施用量降低对牛奶产量和成分没有影响。Murray（2024年）的研究还发现，在三个放牧季节中，喂食PRG牧草且每年施用250或150公斤合成氮的奶牛之间，牛奶产量没有差异。在一些实验中，合成氮施用量的减少幅度比本实验更大，例如高氮和低氮处理组之间的差异在每次刈割时达到20至80公斤氮（Delagarde等人，1997年；Peyraud等人，1997年）。在某些情况下，由于土壤水分不足等局部农业气候条件，牧草的粗蛋白（CP）含量过低（约10%），导致动物表现下降（Peyraud和Astigarraga，1998年）。在这种情况下，提供额外的蛋白质来源（尤其是那些富含粗蛋白的来源）已被证明可以改善动物表现（Delaby等人，1996年；Delagarde等人，1997年）。在当前的春季和秋季实验中，仅使用PRG的牧草的杂草纤维素比例仍保持在16%以上，因此动物表现相似。总体而言，虽然合成氮施用量的适度差异可能不会影响每头奶牛的表现，但由于杂草DM产量和这些农场系统可实现的最佳放牧密度降低，每公顷的产量可能会下降（Murray等人，2024年）。

在必须减少合成氮施用量的情况下，显然需要种植豆科植物来维持牧草生产和动物表现（Murray等人，2024年）。Dineen（2018年）的荟萃分析显示，当牧草中杂草纤维素比例为31.6%时，喂食PRG-WC牧草的奶牛的日牛奶产量和乳固体产量分别增加了1.4公斤和0.12公斤。这些发现也与最近的实验结果一致（McClearn等人，2019年；McAuliffe等人，2022年；Murray等人，2024年），表明杂草的营养价值得到了提升。在当前的实验中，春季喂食GC-L的奶牛的乳固体产量低于喂食纯PRG牧草的奶牛。GC-L牧草的CP含量为12.8%，这可能导致DM、OM和aNDFom消化率降低，从而导致DMI数值最低。虽然研究表明杂草纤维素可以改善春季产犊奶牛的表现，但这种效果在泌乳中期到后期更为明显（McClearn等人，2019年）。Andrews（2007年）指出，至少需要20%的杂草纤维素比例才能观察到牛奶产量的提升，而Rochon（2004年）认为30%的杂草纤维素比例是最优的。春季喂食GC-L的奶牛表现较低（即每公顷施用0公斤氮）强调了优化合成氮施用量和生物量氮组合的重要性，而不是完全消除合成氮。需要注意的是，在正常的放牧系统中，部分有机氮会以尿液和粪便的形式回归牧草中；而在当前实验中，牧草是机械收割的，排泄物没有返回牧草中。

在秋季实验中，喂食GC-H的奶牛的乳固体产量高于喂食G-L和GC-L的奶牛。较高的乳固体产量可能是由于DMI增加而非消化率提高所致。McCarthy（2023年）和Lee（2004年）的研究均表明，喂食PRG-WC的奶牛的DMI高于喂食纯PRG的奶牛。Lee（2004年）发现DMI随杂草纤维素比例的增加而线性增加。然而，DMI的增加并不总是稳定的，可能与测量方法（标记物法与直接测量法）、牧草纤维素比例或季节有关（Enriquez-Hidalgo等人，2014年；Egan等人，2017年；Hurley等人，2021年）。目前尚不清楚为什么喂食GC-L的奶牛的DMI和牛奶产量没有增加。如上所述，秋季PRG-WC牧草中的杂草纤维素比例过高，导致GC-H牧草的aNDFom浓度较为理想（占DM的30%），可能有助于提高DMI；而GC-L牧草的aNDFom浓度较低（占DM的25%），导致aNDFom消化率降低。体内aNDFom消化率的降低与体外结果一致，即GC-L牧草在120小时和240小时后的aNDFom残留物较多。因此，这种过高的杂草纤维素比例和较低的aNDFom浓度可能限制了动物表现。有趣的是，所有处理组在秋季的表现都优于春季。Dwan（2025年）的研究也观察到，在夏季放牧PRG和PRG-WC牧草的奶牛中，DMI有类似的季节性增加，这与Berry（2007年）的大规模研究结果一致，表明DMI在整个放牧季节都有所增加。

许多作者认为，添加杂草纤维素可以提高牧草的消化率（Egan等人，2018年；Murray等人，2024年）；然而，关于喂食杂草纤维素的泌乳奶牛的体内消化率的数据较少。Niderkorn（2017年）报告称，不同杂草纤维素比例对圈养羊的DM和OM消化率没有影响，而Hurley（2021年）发现圈养羊喂食PRG-WC牧草的DM和OM消化率高于喂食纯PRG牧草的羊。在当前实验中，没有证据表明杂草纤维素的添加能提高喂食纯PRG奶牛的DM、OM或aNDFom消化率。进一步的研究应探讨杂草纤维素对泌乳奶牛瘤胃消化动力学和发酵特性的影响，以阐明DMI和动物表现提升的机制。总体而言，这些结果表明，在含有豆科植物的牧草中，可以减少合成氮的施用量而不影响动物表现，但不应完全消除合成氮。

**氮排泄**
在春季，仅使用PRG的饲料中，合成氮施用量减少会导致氮摄入量、尿氮浓度和尿氮产量降低；而在秋季，这些变量没有变化。这可能是由于春季合成氮施用量增加导致草的CP含量显著提高（+2.6%），而秋季仅增加1.1%（Peyraud和Astigarraga，1998年）。O'Connor（2019年）报告称，合成氮施用量增加还会导致春季草的WSC含量增加（-3.1%），而秋季为-0.9%。秋季末期，牧草生长速度下降，土壤氮矿化作用增强（Johnson和Jenkinson，1989年），使得草的CP含量对合成氮施用量的响应减弱。这表明，仅依靠减少合成氮施用量来降低秋季泌乳奶牛的尿氮排泄存在局限性，因为此时尿氮淋溶的风险较高（Selbie等人，2015年）。此外，这种策略还会通过减少牧草产量降低每公顷的动物表现（Murray等人，2024年）。

我们假设，喂食PRG-WC牧草且合成氮施用量较低的奶牛尿氮排泄量会低于喂食纯PRG牧草且合成氮施用量较高的奶牛。此外，我们假设这种效应会随季节变化，春季尿氮排泄量的降低比秋季更为明显。事实证明，喂食PRG-WC牧草且合成氮施用量较低的奶牛的氮摄入量、尿氮浓度和尿氮产量确实低于喂食纯PRG牧草且合成氮施用量较高的奶牛（即G-H）。这种差异可能是由于PRG-WC牧草的CP含量较低所致。春季时，较低的杂草纤维素比例和较低的BNF导致牧草氮供应不足；而在秋季，杂草纤维素比例过高，BNF较高，为牧草提供了充足的氮。这反映在秋季PRG-WC牧草的高CP含量（>23%），导致氮摄入量、尿氮产量和尿氮占比增加。秋季喂食PRG-WC的奶牛的高氮摄入量和尿氮排泄量会增加牧草中的氮负荷，从而增加氮淋溶的风险（Selbie等人，2015年）。此外，减少PRG-WC牧草的合成氮施用量还会增加杂草纤维素比例和CP含量，进一步增加氮淋溶的风险。然而，全年轮牧的牧草系统不太可能达到当前实验中的杂草纤维素比例。因此，需要进一步的研究来确定通过调整草坪中木质纤维素（WC）的比例，是否可以找到合成氮（synthetic N）施用率和生物氮固定（BNF）的最佳组合，从而减少秋季的氮排泄量。有趣的是，在秋季，含有木质纤维素的牧草（PRG-WC）的干物质（DM）浓度低于仅含有蛋白质氮（PRG）的牧草。当奶牛食用这种含有木质纤维素的牧草时，它们的尿量平均增加了39%，而食用仅含有蛋白质氮牧草的奶牛尿量没有变化。这种利尿作用在之前也有研究报道，例如在喂食车前草（forage plantain）和菊苣（chicory）的奶牛中（Mangwe等人，2019年；Minnée等人，2020年）。Minnée等人（2020年）指出，尿量的增加主要是由于牧草干物质含量降低导致的饮水量增加，并未发现其他额外的利尿机制。然而，在喂食车前草的奶牛中，尿氮浓度通常会显著降低。但在当前的实验中，食用含有木质纤维素牧草的奶牛尿氮浓度反而高于仅食用蛋白质氮牧草的奶牛，这表明尿量增加的“稀释效应”不足以抵消它们较高的氮摄入量。因此，正如Eady等人（2024年）所提出的，通过提供低干物质含量的饲料来复制车前草的“稀释效应”可能只有在不增加氮摄入量的情况下才能有效降低尿氮浓度。最终，可能需要采取其他干预措施，如引入其他牧草品种或调整木质纤维素的比例，以克服基于牧草系统的秋季氮排泄问题。

**结论**
在本实验中，仅在蛋白质氮牧草上适度减少合成氮的施用量对春季和秋季的动物表现、摄入量和消化率没有显著影响。春季时，食用仅含有蛋白质氮牧草且合成氮施用量减少的奶牛表现出更有利于氮排泄的情况；然而，这种益处在秋季并未显现。在含有木质纤维素的牧草中，可以降低合成氮的施用量而不影响动物表现，但无法完全消除合成氮的施用。同样，春季时，食用含有木质纤维素牧草且合成氮施用量减少的奶牛氮排泄情况也更好；但由于秋季木质纤维素比例过高，这些奶牛的氮摄入量、尿氮排出量以及氮在尿液中的比例都高于仅食用蛋白质氮牧草的奶牛。总体而言，这些结果表明，需要采取额外的策略，包括引入其他牧草品种或实施如控制放牧时间的管理措施，才能有效减轻高淋溶风险时期的尿氮排泄问题。