利用液相色谱-四极杆轨道阱质谱联用技术对尸检血液中氟伏沙明降解产物进行表征

《Forensic Toxicology》：Characterization of fluvoxamine degradation products in postmortem blood by liquid chromatography coupled with quadrupole-Orbitrap mass spectrometry

　　摘要
目的
氟伏沙明（FLV）是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，主要用于治疗强迫症。在日本，氟伏沙明与致命性中毒和自杀事件有关。因此，确定其尸检（PM）血液中的确切浓度非常重要。据报道，血液中的氟伏沙明浓度会随时间下降。本研究旨在阐明人体血液中氟伏沙明浓度变化的机制。

方法
我们检测了在含有FeCl2、血红蛋白（Hb）或过氧化氢（H2O2）的芬顿反应混合物中，氟伏沙明是否会发生羟基化和/或氧化反应，并在37°C下孵育24小时后进行观察。此外，我们使用液相色谱-四极杆 Orbitrap 质谱联用技术测定了人体血液中的氟伏沙明及其降解产物。

结果
质谱分析结果显示，在反应混合物中形成了 (E)-N-(2-(((5-甲氧基-1-(4-三氟甲基)苯基)戊亚胺)氧)乙基)甲酰胺（FLV-CHO）、(E)-5-羟基-1-(4-三氟甲基)苯基)戊烷-1-酮-O-(2-氨基乙基)肟（FLD）和 (E)-5-(羟基甲氧基)-1-(4-三氟甲基)苯基)戊烷-1-酮-O-(2-氨基乙基)-肟（FLV-OH）。此外，人体血液中 FLV-CHO 的浓度与其初始浓度的降解百分比之间存在强相关性。

结论
我们的结果表明，由 Hb/H2O2 介导的血液中氟伏沙明降解产生的 FLV-CHO 可能是校正尸检血液中氟伏沙明浓度的潜在生物标志物。

引言
法医毒理学是毒理学的一个应用领域，对于保护人们的权利至关重要。法医毒理学家（FTs）分析尸检过程中获得的生物样本（如血液、尿液和组织），为司法系统提供具体证据。特别是准确确定死亡时的血液药物浓度对于确认药物中毒死亡至关重要。然而，法医毒理学家面临一个难题：死于药物中毒的人在尸检时的血液药物浓度远低于死亡时的浓度。尸检时的血液药物浓度可能无法准确反映死亡时的情况[1]。
氟伏沙明（以下简称“FLV”）是一种肟 O-醚，其苯环在1位被 (1E)-N-(2-氨基乙氧基)-5-甲氧基戊酰胺基团取代，在4位被三氟甲基取代。作为一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI），它主要用于治疗强迫症（OCD）[2]。它通过增加大脑中的5-羟色胺水平来改善情绪并减少焦虑和强迫思维。与其他 SSRIs 不同，它主要用于治疗 OCD，但也用于抑郁症和其他焦虑症。常见副作用包括恶心、嗜睡和失眠。必须按处方服用，并避免突然停药，因为这可能导致戒断症状。与所有抗抑郁药一样，可能需要几周时间才能感受到其全部效果。患者应监测潜在的副作用和行为变化，尤其是在治疗初期。在日本，氟伏沙明被认为是导致自杀或意外中毒的原因之一[3]。氟伏沙明的致死血液浓度大于 2800 ng/mL[4]。据报道，血液中的氟伏沙明浓度会随时间下降[5]。在日本，尸体通常在尸检前被保存在4°C下数天[6]。因此，死于中毒的人的血液中氟伏沙明浓度远低于死亡时的浓度。目前，尚不清楚血液中氟伏沙明浓度变化的原因。
血红蛋白（Hb）是导致死亡后血液中药物和农药浓度下降的重要因素[7,8,9,10,11,12,13]。死亡后，Hb 会从红细胞中释放出来[14]。另一方面，过氧化氢（H2O2）是由 HbO2 自氧化产生的 O2•– 引发的[15]。芬顿反应是由血液中的 H2O2 和 Hb 诱导的[11]。最近的研究表明，Hb/H2O2 可以导致阿莫地平、溴唑epam、艾司唑仑、帕利哌酮和唑吡坦等药物的尸检后降解[7,8,9,10,11]。据我们所知，目前没有关于氟伏沙明与 Hb 之间相互作用的报道。然而，我们推测 Hb 可能会影响血液中氟伏沙明浓度的变化。
在本研究中，我们在芬顿反应混合物和人体血液中测定了氟伏沙明及其降解产物。为了表征氟伏沙明及其降解产物，使用了液相色谱-四极杆 Orbitrap 质谱联用技术（LC-Q-Orbitrap-MS）。Orbitrap-MS 可以提供准确的质量数据，而串联质谱（如 Q-Orbitrap-MS）可以提供结构信息[7,8,9,10,16]。因此，LC-Q-Orbitrap-MS 非常适合检测血液中未知的分子物种，例如未知的氟伏沙明降解产物。

实验程序
**化学品和仪器**
所有溶剂均为 LC-MS 或 HPLC 级。乙腈（ACN）和水购自关东化学公司（日本东京）。氟伏沙明（CAS 号：54739-18-3）、FeCl2、100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、1 M 甲酸铵溶液、H2O2（30%）和甲酸购自富士胶片和和光纯化学公司（日本大阪）。地西泮-d5 购自林纯化学工业有限公司（日本大阪）。Hb（人源，H7379）购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。人体血液购自 BioIVT（英国伦敦）。仪器设置详情见表 S1。LC-Q-Orbitrap-MS 用于检测芬顿反应混合物中的氟伏沙明及其降解产物。使用的仪器为 Vanquish Flex Binary LC 系统，配备 Q-Exactive plus Orbitrap 质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。

**从芬顿反应混合物中回收氟伏沙明**
反应条件基于我们之前的报告[7,8,9,10,11]。我们使用乙腈溶解血液中的氟伏沙明。从芬顿反应混合物中回收氟伏沙明的方法如下：准备含有 1 μg/mL 氟伏沙明、0.3 mg/mL H2O2、100 mg/mL Hb 或 40 mM FeCl2 的 100 μL 反应混合物。对照样品含有 100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中的氟伏沙明，但不含 Hb、FeCl2 或 H2O2。将反应混合物在 37°C 下孵育 24 小时，然后加入 1.9 mL 含有地西泮-d5（25 ng/mL）作为内标（IS）的 ACN。将反应混合物超声处理、涡旋混合并离心（10,000 ×g）10 分钟。上清液通过 LC-Q-Orbitrap-MS 分析以确定氟伏沙明浓度。相应的提取离子 m/z 为 319.1628，m/z 容差为 5 ppm。

**未知氟伏沙明降解产物的检测和表征**
反应和预处理条件与“从芬顿反应混合物中回收氟伏沙明”相同。在上述预处理后，使用 LC-Q-Orbitrap-MS 分析芬顿反应混合物。通过 Compound Discoverer 软件（版本 3.3；Thermo Fisher Scientific）通过差异分析从质谱中提取未知的氟伏沙明降解产物。

**检测血液中的氟伏沙明和氟伏沙明降解产物**
准备含有 1 μg/mL 氟伏沙明的 100 μL 血液样本，并在 37°C 下孵育。采样时间为 0、24、96 和 168 小时。向其中加入 400 μL 含有 IS（25 ng/mL）的 ACN，然后涡旋混合并离心（10,000 ×g）10 分钟。上清液通过 LC-Q-Orbitrap-MS 分析。检测到的氟伏沙明、FLV-UK-1、FLV-UK-2 和 FLV-UK-3 的提取离子 m/z 分别为 319.1628、347.1577、305.1471 和 335.1564，m/z 容差为 5 ppm。

**统计分析**
使用 Tukey 检验和 Dunnett 多重比较检验对四组数据进行比较。在 Tukey 检验中，显著性水平设为 p < 0.05，不同字母的组表示显著不同。在 Dunnett 多重比较检验中，单个和双星号（*）分别表示 p < 0.05 和 p < 0.01 的显著性水平。数据以平均值 ± 标准差（SD）（n = 4）表示。

**结果**
在 37°C 下孵育 24 小时后，H2O2、Hb 和 Hb/H2O2 反应混合物中的氟伏沙明浓度均低于对照组（图 1A）。对照组和 H2O2、Hb、Hb/H2O2 反应混合物中未降解的氟伏沙明百分比分别为 94.8 ± 2.2%、85.2 ± 2.0%、66.9 ± 1.3% 和 28.3 ± 1.0%。氟伏沙明浓度的下降顺序为 Hb/H2O2 > Hb > H2O2 > 对照组。
图 1 芬顿反应试剂对氟伏沙明浓度的影响。含有 1 μg/mL 氟伏沙明和 H2O2（A 和 B）、Hb（A）、Hb/H2O2（A）、FeCl2（B）和 FeCl2/H2O2（B）的反应混合物在 0 和 24 小时后孵育。对照组由 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和氟伏沙明组成。温度保持在 37°C。数据以平均值 ± 标准差（SD）（n = 4）表示。使用 Tukey 检验对四组进行比较。显著性水平设为 p < 0.05，不同字母的组表示显著不同。

在 37°C 下孵育 24 小时后，H2O2、FeCl2 和 FeCl2/H2O2 反应混合物中的氟伏沙明浓度均低于对照组（图 1B）。对照组和 H2O2、FeCl2、FeCl2/H2O2 反应混合物中未降解的氟伏沙明百分比分别为 93.4 ± 2.5%、85.6 ± 4.6%、88.2 ± 0.9% 和 60.1 ± 1.6%。氟伏沙明浓度的下降顺序为 FeCl2/H2O2 > H2O2 ≥ FeCl2 ≥ 对照组。

**检测/表征芬顿反应混合物中的未知氟伏沙明降解产物**
按照实验程序描述的方法对对照组和 Hb/H2O2 及 FeCl2/H2O2 处理后的样品进行质量数据分析。在 Hb/H2O2 处理的样品中检测到一个 m/z 为 347.1577 的离子（图 2B）。在 FeCl2/H2O2 处理的样品中检测到三个 m/z 为 347.1577、305.1458 和 335.1564 的离子（图 2C 和 F、2I）。这三个未知降解产物的保留时间分别为 10.8 分钟、6.4 分钟和 6.6 分钟，分别命名为 FLV-UK-1、FLV-UK-2 和 FLV-UK-3。在 Hb/H2O2 处理的样品中未检测到 FLV-UK-2 和 FLV-3。

**FLV-UK-1 的 MS/MS 分析结果**
图 3A 显示了 FLV-UK-1 的 MS/MS 分析结果。检测到一个前体离子（FLV-UK-1-Fr.1）和五个产物离子（FLV-UK-1-Fr.2–FLV-UK-1-Fr.6），m/z 值分别为 347.1577、258.1100、226.0839、200.0683、87.0809 和 71.0497。值得注意的是，FLV-UK-1 的前体离子和产物离子的 Δm/z 值 < ± 10 ppm（表 S2）。FLV-UK-1 的前体离子和产物离子的归属在图 3A 和表 S2 中显示。FLV-UK-1 被鉴定为 (E)-N-(2-(((5-甲氧基-1-(4-三氟甲基)苯基)戊亚胺)氧)乙基)甲酰胺。

**FLV-UK-2 的 MS/MS 分析结果**
图 3B 显示了 FLV-UK-2 的 MS/MS 分析结果。检测到一个前体离子（FLV-UK-2-Fr.1）和四个产物离子（FLV-UK-2-Fr.2–FLV-UK-2-Fr.5），m/z 值分别为 305.1456、244.0940、229.0835、200.0674 和 77.0715。值得注意的是，FLV-UK-2 的前体离子和产物离子的 Δm/z 值 < ± 10 ppm（表 S3）。FLV-UK-2 的前体离子和产物离子的归属在图 3B 和表 S3 中显示。FLV-UK-2 被鉴定为 (E)-5-羟基-1-(4-三氟甲基)苯基)戊烷-1-酮 O-(2-氨基乙基)肟。

**FLV-UK-3 的 MS/MS 分析结果**
图 3C 显示了 FLV-UK-3 的 MS/MS 分析结果。检测到一个前体离子（FLV-UK-3-Fr.1）和四个产物离子（FLV-UK-3-Fr.2–FLV-UK-3-Fr.5），它们的m/z值分别为335.1564、317.1462、256.0941、103.0756和71.0497。值得注意的是，FLV-UK-3的前体离子和产物离子的Δm/z值均小于±10 ppm（表S4）。FLV-UK-3的前体离子和产物离子的归属信息如图3C和表S4所示。FLV-UK-3的化学结构被鉴定为(E)-5-(羟甲氧基)-1-(4-(三氟甲基)苯基)戊-1-酮 O-(2-氨基乙基)肟。

图4：含有FeCl2/H2O2的反应混合物中FLV降解的示意图
图5：FLV浓度变化及FLV降解产物的检测

在37°C下保存的人体血液中，FLV浓度在168小时时显著下降（图S1A）。与0小时相比，24小时、96小时和168小时时未降解FLV的百分比分别为95.0 ± 2.8%、56.9 ± 3.6%和54.9 ± 2.6%。

在37°C下保存的人体血液中，FLV-UK-1的峰面积在168小时时高于0小时（图S1B）。0小时、24小时、96小时和168小时时FLV-UK-1的峰面积分别为857×10^2 ± 470×10^2 a.u.、840×10^3 ± 270×10^2 a.u.、158×10^4 ± 110×10^3 a.u.和188×10^4 ± 672×10^2 a.u.

将FLV-UK-1的峰面积与其初始浓度的降解百分比进行绘图（图4、图5），发现FLV-UK-1的峰面积与其初始浓度的降解百分比之间存在强烈的正相关关系，相关系数（r2）为0.97。

图5：使用人体血液进行的体外研究中，FLV-UK-1的峰面积与其初始浓度的降解百分比之间的关系

在168小时内，未在人体血液中检测到FLV-UK-2和FLV-UK-3。

**讨论**
我们发现FLV被Hb/H2O2和FeCl2/H2O2产生的氢氧根离子及羟基自由基降解（图1和图5），这与预期一致。已有研究表明Hb似乎能够降解血液中的多种药物[7,8,9,10,11,12,13]。此外，FLV还是与甲醛形成的加合物的目标（图3和图5）。我们的发现揭示了Hb/H2O2在人体血液中导致FLV自由形式变化的新机制。

如图4的示意图所示，在FeCl2/H2O2反应混合物中检测到了FLV-CHO、FLD和FLV-OH；而在Hb反应混合物和人体血液中仅检测到了FLV-CHO（图2、图5和S2）。有报道称，如甲氧基甲基和马拉硫磷等反应物会与血液蛋白（如Hb）结合[12, 13]。这些结果表明，由于FLV-OH可能结合到Hb残基上（图S3），因此FLV-OH及其衍生物在Hb溶液和人体血液中无法被检测到。因此，在法医毒理学中，FLV-CHO具有实用性。

在法医毒理学中，血液中的药物浓度对于判断药物中毒情况至关重要。血液中的FLV浓度会随时间逐渐降低[5]。为了证明FLV中毒，需要一种血液生物标志物来估算死亡时的FLV浓度。在本研究中，我们在每个时间点都检测到了人体血液中的FLV-CHO，并发现其浓度与FLV的降解百分比密切相关（图5）。这些结果表明FLV-CHO可能是一种有价值的生物标志物，可用于估算死亡时的FLV浓度。此外，还检测到了包括FLD在内的十一种代谢物（这些代谢物由人体肝微粒体产生）。据我们所知，FLV-CHO在活体个体的血液中无法检测到，因为它仅由Hb/H2O2生成。因此，FLV-CHO可以作为FLV死后显著降解的指标。

**结论**
FLV在人体血液中会被降解，通过Fenton反应与Hb的氧化和/或羟基化作用生成FLV-CHO、FLD和FLV-OH等降解产物。血液中的FLV-CHO可作为估算死亡时FLV浓度的有价值生物标志物。此外，FLV-CHO还可以指示FLV在死亡后的显著降解情况。