《Experimental and Applied Acarology》：DNA barcoding reveals cryptic diversity in chiggers (Trombiculidae) parasitizing small mammals across Peninsular Malaysia
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恙螨（Acariformes: Trombiculidae）是小型哺乳动物的外寄生虫，同时也是scrub typhus（恙虫病）的重要传播媒介，然而其在东南亚地区的分类学及分子多样性研究仍十分匮乏。本研究首次对马来半岛小型哺乳动物寄生的恙螨进行了DNA条形码（
恙螨（Acariformes: Trombiculidae）是小型哺乳动物的外寄生虫，同时也是scrub typhus（恙虫病）的重要传播媒介，然而其在东南亚地区的分类学及分子多样性研究仍十分匮乏。本研究首次对马来半岛小型哺乳动物寄生的恙螨进行了DNA条形码（DNA barcoding）和系统发育评估，整合了线粒体基因（COI，细胞色素c氧化酶亚基I）和核基因（28S rDNA，28S核糖体DNA）数据。研究人员共对192只恙螨进行测序，这些样本代表了6个属的11个形态种（morphospecies），采用最大似然法（maximum likelihood）推断系统树拓扑结构，并通过多种物种界定（species delimitation）方法予以支持。COI基因可将5个物种鉴定为单系群（monophyletic），而28S rDNA基因分析则阐明了Walchia属和Leptotrombidium属内的系统发育关系。在若干分类群中，特别是Gahrliepia fletcheri、Leptotrombidium deliense和Walchiella oudemansi，形态学界限与分子界限之间存在不一致性，这提示了隐存谱系（cryptic lineages）的存在以及潜在的区域性多样化。重要的是，本研究为8个物种提供了首次分子记录，其中包括Gahrliepia属和Walchiella属在全球范围内仅有的条形码数据。这些发现为东南亚恙螨的分子鉴定提供了重要资源，并强调了整合形态学、分子数据和生物地理学方法以解析复杂物种界限、改进螨媒疾病媒介监测的必要性。
**研究背景与问题提出**
恙螨（Trombiculidae）作为恙虫病（scrub typhus）的重要传播媒介，其准确物种鉴定对于疾病防控具有关键意义。该疾病由Orientia spp.细菌引起，全球已描述约3000种恙螨，其中东南亚地区是生物多样性热点区域。在已报道的450种中，马来西亚有多达205种，使其成为该科多样性最高的国家之一。然而，传统形态学鉴定方法面临诸多挑战：恙螨体型微小（常小于0.5 mm）、种间形态差异细微，且许多类群缺乏更新的分类学检索表，这些因素严重制约了恙螨生态学及其所传播疾病流行病学研究的深入开展。
DNA条形码技术以线粒体COI基因为靶标，已成为分类困难类群物种鉴定的有力补充工具。尽管该技术在Acariformes螨类研究中显示出良好应用前景，但全球范围内Trombiculidae科仅约1.5%的已知物种具有公开的序列数据。在马来西亚，205个报告物种中仅9种有条形码数据，覆盖率不足5%。这一显著的数据缺口严重阻碍了基于DNA的工具在生物多样性评估和媒介监测中的应用。因此，本研究旨在从形态学验证的Trombiculidae标本中产生分子数据，以实现准确的物种鉴定，并为后续生态学和流行病学研究中探索恙螨隐存多样性奠定基础。
**研究设计与核心结论**
研究人员开展了马来半岛小型哺乳动物寄生恙螨的首例DNA条形码和系统发育分析，整合线粒体COI基因和核基因28S rDNA数据，对192只代表6属11个形态种的恙螨进行测序分析。研究发现COI基因可将5个物种鉴定为单系群，而28S rDNA基因分析阐明了Walchia属和Leptotrombidium属内的系统发育关系。形态学与分子界限的不一致性提示了Gahrliepia fletcheri、Leptotrombidium deliense和Walchiella oudemansi等类群中存在隐存谱系。该研究为8个物种提供了首次分子记录，包括Gahrliepia属和Walchiella属的全球首例条形码数据。论文发表在《Experimental and Applied Acarology》。
**关键技术方法概述**
研究样本来自马来半岛三个地点：柔佛州哥打丁宜（Kota Tinggi）的马来亚大学油棕种植园、霹雳州波打（Bota） Tumbuh Hangat的Orang Asli定居点（油棕种植园内），以及登嘉楼州Pasir Raja森林保护区。使用100-150个钢制笼 traps 捕获啮齿类和树鼩类动物，经安乐处死后进行形态鉴定，并用细镊子从宿主体表采集恙螨。经形态学鉴定的样本一部分永久制片保存为凭证标本，其余用于DNA提取。采用QIAamp DNA Micro kit提取基因组DNA，通过PCR扩增约710 bp的COI基因片段和约850 bp的28S rDNA片段，Sanger测序后进行序列分析。数据处理包括NCBI GenBank的BLASTn比对、BioEdit序列编辑、ClustalW序列比对，使用MEGA12计算基于Kimura 2-parameter模型的种内和种间遗传距离；采用TaxonDNA进行Best Match、Best Close Match和All Species Barcode分析；物种界定方法包括ASAP、ABGD和mPTP；系统发育树构建使用IQ-tree进行最大似然分析，10,000次超快速bootstrap重复。
**研究结果**
**样本采集与物种组成**
三个采样点共收集1,624只恙螨，代表11个物种。其中Pasir Raja站点的42只小型哺乳动物宿主上发现11个物种，4种先前已在哥打丁宜和/或Tumbuh Hangat报道，另7种为新记录。三个地点共鉴定21个物种。DNA条形码分析中，11个物种获得192条COI序列和39条28S序列，PCR成功率分别为57%和66%。该研究提供了8个物种的首次分子数据，包括Gahrliepia和Walchiella两属的全球首例条形码。
**遗传分化与条形码间隙**
COI序列的种内平均遗传分化范围为0.1%-16.08%。低种内分化（<3%）见于W. rustica（0.1%）、E. wichmanni（0.15%）、W. impar（0.46%）和L. arenicola（1.18%）；而7个物种显示出高分化（>4%），以L. deliense（16.08%）、W. disparunguis pingue（14.44%）、G. fletcheri（11.35%）和W. oudemansi（9.96%）为最。仅5个物种呈现明确的条形码间隙；G. fletcheri、L. deliense、W. disparunguis pingue、W. ewingi ewingi和W. oudemansi因种内-种间距离重叠而缺乏该间隙。28S基因种内分化较低（0.02%-1.72%），最低种间分化见于W. disparunguis pingue与W. ewingi ewingi之间（0.28%）。
**物种界定**
三种物种界定方法（ASAP、ABGD、mPTP）揭示的分子操作分类单元（MOTUs）数量（25-27个）远多于最初识别的11个形态种，表明存在可观的隐存多样性。Best Match和Best Close Match标准下的鉴定成功率较高（分别为97.18%和94.36%），但All Species Barcode标准下较低（60.56%），主要因在G. fletcheri、L. deliense、W. disparunguis pingue和W. oudemansi等种内变异高的物种中存在模糊匹配。
**系统发育分析**
COI基因的最大似然分析恢复了两个强烈支持的主要分支。分支I包含5个属的9个物种。Walchia属呈并系（polyphyletic），W. rustica与来自Tumbuh Hangat的G. fletcheri形成姐妹群。W. disparunguis pingue、W. ewingi ewingi和G. fletcheri等显示出并系或多系结构，与多个MOTUs一致。Ascoschoengastia、Eutrombicula和Walchiella属为单系，但A. indica在不同国家形成独立的地理支系，两个Walchiella物种也形成地理区隔的MOTUs。分支II仅包含两个Leptotrombidium物种。L. deliense形成两个主要支系，均包含不同地点的马来半岛标本；L. arenicola虽被界定为独立MOTU，却嵌套于L. deliense的第二支系中，导致后者呈并系。
28S rDNA系统树同样支持大多数物种界限，但在近缘种间分辨率低于COI。Walchia属恢复为单系，G. fletcheri为其姐妹群。与COI结果相似，W. disparunguis pingue呈并系，L. arenicola的嵌套位置使L. deliense呈并系。
**讨论与研究结论**
本研究是马来西亚小型哺乳动物寄生恙螨的首例DNA条形码分析，为11个物种提供了新分子数据，其中8个为首次测序。L. arenicola的纳入凸显了该研究的流行病学意义，该种为马来西亚特有种，与Orientia tsutsugamushi感染呈正相关。对于具有COI参考序列的物种，A. indica和L. deliense分别与泰国和马来西亚的同类序列具有高度相似性（>98%）；而马来半岛L. deliense种群间（如哥打丁宜vs. Tumbuh Hangat）以及马来半岛W. ewingi ewingi与印度、老挝同类之间的较低相似性，提示了地理结构和潜在的局域多样化。
COI系统发育恢复了两个主要分支，大致对应属级分组。A. indica与老挝、泰国同类形成强烈支持的单系群，与先前东南亚研究一致。然而Walchia属在COI树中呈并系，这一发现呼应了Gahrliepiinae亚科长期存在的分类学不稳定性：部分学者认为Gahrliepia是唯一有效属，而另一些学者则承认包括Schoengastiella和Walchia在内的多个属。有趣的是，28S rDNA树支持Walchia属的单系性，G. fletcheri为其姐妹支系，提示线粒体与核基因数据的不一致可能源于不完全谱系分选或基因渗入。
尽管所有分子界定方法一致将L. arenicola界定为基于COI条形码的独立MOTU，但其却嵌套于L. deliense的广泛多样性之内，形成低种内变异的分支。28S数据同样反映了这一模式，尽管缺乏马来西亚以外参考序列阻碍了确切结论。28S rRNA基因数据表明，L. arenicola与L. deliense的分化程度不超过后者种群内的变异水平。该模式与L. deliense及其他亚洲Leptotrombidium物种代表物种复合体的先前证据相吻合，高遗传分化和多MOTUs的形成暗示了可能的隐存物种形成。
COI在种群水平提供了良好的分辨率，但若干形态种（G. fletcheri、L. deliense、W. disparunguis pingue、W. ewingi ewingi）并非单系；而28S rRNA数据集中识别的种内支系较少。这种基因间的不一致性在韩国Leptotrombidium物种中已有记载，其COI的种内变异高达17%，而ITS2和18S rRNA基因序列几乎相同。线粒体DNA较快的进化速率解释了其在种群水平分化中的精细分辨率，但对深层系统发育推断的可靠性降低。因此，尽管COI可作为有效的物种鉴别条形码，尤其在Leptotrombidium属之外，但ITS2和18S rRNA等额外核基因的加入将有助于数据解读。
隐存多样性的发现强调了形态学方法在媒介物种鉴定中的局限性。误鉴定可能掩盖疾病传播模式，特别是在不同谱系媒介能力存在差异的地区。涵盖更广泛地理和宿主范围的综合性DNA条形码数据库对于准确监测和快速物种鉴定至关重要。本研究的局限性在于未对单个恙螨或形态种群内的形态学和分子变异进行系统比较，未来研究可采用自发荧光方法作为潜在分类学修订的前期工作。整合形态特征、线粒体和核基因座以及地理数据，理想情况下辅以全基因组测序支持，对于完善Trombiculidae系统学、增进对东南亚媒介-宿主-病原体相互作用的理解至关重要。
本研究提供了马来西亚小型哺乳动物寄生恙螨的首例分子条形码间隙分析和系统发育评估，填补了区域分类学知识的关键空白。通过整合线粒体（COI）和核（28S rDNA）基因数据，研究结果不仅确立了E. wichmanni、G. fletcheri以及两个Walchiella物种等的首次分子记录，还揭示了L. deliense和W. oudemansi等关键类群中的隐存多样性和潜在谱系分化。某些类群中形态学与分子界限的不一致性突显了恙螨系统学的复杂性，强调了整合形态学、遗传学和生物地理学方法的必要性。这些结果为未来的分类学修订提供了关键的分子框架，增强了准确鉴定媒介的能力，并为该地区恙虫病及其他螨媒疾病的流行病学监测奠定了坚实基础。
