一管式RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测技术的建立及其在铜绿假单胞菌和蜡样芽孢杆菌快速现场检测中的应用

《Foods》：One-Tube RPA-CRISPR/Cas12a Assays for Rapid and Visual Detection of Pseudomonas fluorescens and Bacillus cereus Changli Yang, Gaoke Wang, Xiaowu Zhou, Jie Song, Xu Luo, Hua Liu, Haijuan Zeng, Wenhui Wu, Xiaoyan Zhao and Jinbin Wang

为解决食品冷链中食源性嗜冷菌（如蜡样芽孢杆菌和铜绿假单胞菌）检测面临的常规方法耗时长、依赖热循环设备、现有RPA-CRISPR方法存在气溶胶污染风险等问题，研究人员开发了两种独立的、用于快速视觉检测这两种病原菌的一管式RPA-CRISPR/Cas12a检测方法。该研究利用物理分离设计，将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a检测系统预装于同一反应管内，实现了在37°C下40分钟内完成检测，并通过蓝光下直接观察荧光判断结果。该方法展现出良好的特异性与高灵敏度（检测限分别为5.1×101copies/μL和2.1×101copies/μL），在真实食品样本检测中与传统PCR结果100%一致。此工作为冷链食品安全的现场监测提供了一种污染风险低、快速可靠的解决方案。

　　

在享受从冰箱里取出的美味牛奶、即食沙拉或鲜切水果时，你可曾想过，即使是在低温环境下，一些“嗜冷”的微生物依然在悄悄生长，威胁着我们的健康？蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）正是这类食源性嗜冷菌中的两大代表。前者在全球食品中污染率高达23.8%，是导致细菌性食物中毒的常见元凶；后者则是冷藏乳制品和肉制品腐败变质的主要推手，造成巨大的经济损失。传统的培养检测方法往往需要数天时间，而依赖精密仪器的分子检测方法（如PCR）又难以在资源有限的现场环境（如农场、食品加工厂、超市）中普及。更令人头疼的是，近年来将高效的等温核酸扩增技术（如重组酶聚合酶扩增，RPA）与高特异性的CRISPR/Cas系统结合的策略，虽然快速灵敏，但通常需要“开管”操作——将第一步的扩增产物手动转移到第二步的检测体系中。这一步操作极易产生气溶胶污染，导致假阳性结果，成为阻碍其走向标准化现场应用的“阿喀琉斯之踵”。

为了破解这一难题，由杨昌利、王国可、周晓武、宋洁、罗旭、刘华、曾海娟、吴文辉、赵晓燕和王金彬组成的研究团队，在《Foods》期刊上发表了一项创新性研究。他们成功开发了两种独立的、用于蜡样芽孢杆菌和铜绿假单胞菌快速视觉检测的一管式RPA-CRISPR/Cas12a检测方法。这项研究的意义在于，它巧妙地将扩增与检测步骤物理隔离地集成在一个密闭的反应管内，通过一次简单的短暂离心混合即可启动检测，从根本上杜绝了气溶胶污染的风险。该方法仅需一个金属浴恒温器、一个手持蓝光灯和一个小型离心机（或手动甩动）即可在40分钟内完成检测，并通过肉眼直接观察荧光判断结果，为实现冷链食品安全的便携、快速、可靠的现场监测提供了强有力的工具。

为开展这项研究，作者主要运用了以下几个关键技术方法：首先，通过生物信息学分析，分别针对蜡样芽孢杆菌的肠毒素基因nheB和铜绿假单胞菌的ropD基因，设计了特异性的RPA引物和CRISPR引导RNA（crRNA）。其次，建立并优化了“一管式”检测体系，其核心是将RPA扩增体系置于管底，而将含有Cas12a蛋白、crRNA和单链DNA荧光报告分子的CRISPR检测体系预装在管盖内侧，通过短时离心实现两者混合。最后，研究系统地评估了该方法的可行性、特异性、灵敏度，并分别通过人工加标的猪肉/鸡肉样本，以及从本地市场采集的多种真实食品样本（总计14种易被蜡样芽孢杆菌污染的食品和14种易被铜绿假单胞菌污染的食品），验证了其在复杂食品基质中的实际应用性能。

研究结果

3.1. 一管式RPA-CRISPR/Cas12a检测原理

该方法的工作原理基于一个物理分离的集成设计。在反应管底部预装含有待测DNA模板的RPA扩增体系，在管盖内侧预装含有Cas12a蛋白、crRNA和荧光报告分子（5‘-HEX-(TTTT)₃-BHQ1-3’）的CRISPR检测体系。反应首先在37°C孵育20分钟，完成目标DNA的RPA等温扩增。随后，通过短暂离心，将管盖上的检测液滴甩至管底与扩增产物混合。如果存在目标DNA，其扩增产物会与crRNA引导的Cas12a复合物结合，激活Cas12a的非特异性切割活性，将荧光报告分子切割，使荧光基团（HEX）与淬灭基团（BHQ1）分离，从而在蓝光照射下产生可见的绿色荧光；若无目标，则无荧光信号。

3.2. 可行性分析与条件优化

研究人员通过设置包含完整反应体系及分别缺失Cas12a、crRNA、荧光报告分子或RPA扩增产物的对照实验，验证了该集成检测体系的可行性。结果显示，只有包含所有关键组分的完整反应才能产生强烈的荧光信号，而缺失任一组分均导致信号显著降低或消失。此外，通过比较RPA体系与CRISPR检测体系的不同体积配比（10 μL:10 μL 对比 15 μL:5 μL），发现15 μL:5 μL的比例能为两种目标菌的检测带来最强的信号和最高的信噪比，因此被确定为最优条件。

3.3. 特异性与灵敏度

特异性测试显示，两种检测方法仅对其各自的目标菌（蜡样芽孢杆菌或铜绿假单胞菌）的基因组DNA产生显著的荧光信号，而对包括金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门菌等在内的六种常见非目标食源性病原菌均无交叉反应。灵敏度测试表明，针对蜡样芽孢杆菌的检测方法，其视觉检测限为5.1×10¹copies/μL；针对铜绿假单胞菌的检测方法，其视觉检测限为2.1×10¹copies/μL。

3.4. 加标样本检测

为评估方法在复杂食品基质中的抗干扰能力和检测性能，研究选取了猪肉（针对蜡样芽孢杆菌）和鸡肉（针对铜绿假单胞菌）进行人工加标实验。结果显示，在猪肉基质中，该方法可稳定检测出浓度不低于3.2×10²CFU/mL的蜡样芽孢杆菌；在鸡肉基质中，可稳定检测出浓度不低于2.6×10²CFU/mL的铜绿假单胞菌，证明了其在真实食品样本中良好的适用性。

3.5. 真实样本检测

最终，研究对从本地市场采集的共计28种真实食品样本（各14种）进行了检测验证。蜡样芽孢杆菌检测方法在冷藏米饭和牛奶样本中检出阳性，而铜绿假单胞菌检测方法在鸡肉和猪肉样本中检出阳性，其余样本均为阴性，且未出现假阳性信号。所有检测结果均经传统PCR方法验证，符合率达到100%，充分证明了该方法在复杂食品基质中检测的准确性与可靠性。

研究结论与意义

本研究成功建立了两种独立的一管式RPA-CRISPR/Cas12a视觉检测方法，分别针对蜡样芽孢杆菌的nheB基因和铜绿假单胞菌的ropD基因。这是首次报道的针对铜绿假单胞菌的一管式检测方法。该方法的成功之处在于其创新的物理分离设计，将扩增与检测步骤整合于一个密闭系统，通过简单的离心操作启动检测，彻底消除了传统“两步法”中开管转移带来的气溶胶污染风险。整个检测过程可在37°C下于40分钟内完成，仅需便携式金属浴和蓝光灯等简单设备，检测结果可直接肉眼判读，视觉检测限分别达到5.1×10¹copies/μL（蜡样芽孢杆菌）和2.1×10¹copies/μL（铜绿假单胞菌）。在针对多种真实食品样本的检测中，该方法与传统PCR结果完全一致，展现了极高的准确性与可靠性。

该研究的核心意义在于，它为解决冷链食品中关键嗜冷菌的快速现场监测难题提供了一个切实可行的“一体化”解决方案。相较于现有的PCR、微滴数字PCR、RPA侧流层析等方法，本研究建立的一管式RPA-CRISPR/Cas12a方法在操作简便性、防污染能力、检测速度和设备便携性方面取得了良好平衡。其模块化的引物和crRNA设计理念，也使其易于被改造用于检测其他食源性病原体。这项工作标志着食源性病原体检测技术从实验室向现场可部署解决方案的重要转变，为保障冷链食品安全、实现早期预警和主动防控提供了有力的策略性工具。尽管当前方法在区分蜡样芽孢杆菌近缘种等方面存在理论局限，且样本规模有待扩大，但其为未来开发可区分活菌/死菌、实现多重检测乃至集成智能手机定量分析的下一代现场快检技术奠定了坚实基础。