《Analytica Chimica Acta》：A Colorimetric/Fluorescent/Electrochemical Tri-modal Biosensor Based on Dual CRISPR/Cas12a System for Detection of microRNA
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基于双CRISPR/Cas12a系统的三模态生物传感器实现miRNA let-7a高灵敏检测
张和华|朱焕|高洪民|周洋|阙龙斌|荣胜忠|马洪坤|常东|潘洪志
上海医学与健康科学大学协同研究中心，中国上海 201318
摘要
背景
肿瘤标志物的精准检测对于早期癌症诊断和监测至关重要。现有的单模检测方法在复杂的生物样本中容易受到干扰，难以同时实现高灵敏度和可靠性。微小RNA（miRNA）作为一类关键的癌症相关生物标志物，需要新型的检测方法来进行多层次的验证。本研究旨在开发一种具有多信号输出的生物传感平台，以解决当前肿瘤标志物检测中灵敏度、特异性和结果可信度之间的平衡问题。
结果
我们成功构建了一种基于双CRISPR/Cas12a系统的三模生物传感器，用于高灵敏度和特异性地检测miRNA let-7a。该传感器通过指数放大反应（EXPAR）生成触发链，同时调节三个独立的信号通路：① 它启动第一个CRISPR/Cas12a系统来抑制G-四链体/血红素DNA酶（G4/hemin DNAzyme）的形成，从而关闭ABTS比色信号；② 它还激活双链特异性核酸酶（DSN）来抑制杂交链反应（HCR），从而阻止FAM荧光与链霉亲和素包覆的磁性纳米粒子（SMBs）的结合，关闭荧光信号；③ SMBs上没有HCR产物时，第二个CRISPR/Cas12a系统保持不活跃状态，从而使电极的P1探针能够与P2-3D-CdCo-ONSs@AuNPs结合，并保持纳米复合材料的高“开启”电化学信号。因此，miRNA let-7a的浓度范围从50 fM到1 pM，可以通过比色、荧光和电化学信号进行精确定量和验证。
意义
本研究将双CRISPR/Cas12a系统与包括比色、荧光和电化学检测在内的三模输出策略相结合，构建了一个具有交叉验证机制的检测平台。这种设计不仅显著提高了检测准确性和抗干扰能力，还为开发下一代高可靠性的分子诊断工具奠定了坚实基础。它在早期癌症筛查和精准医疗领域具有巨大的应用潜力。
引言
微小RNA（miRNA）是一类长度约为19-25个核苷酸的小型非编码RNA分子，在基因表达的转录后调控中起着关键作用[1]。研究表明，miRNA表达的失调与多种疾病（尤其是癌症）的发病机制和进展密切相关[2]、[3]、[4]。其中，let-7家族是一类重要的肿瘤抑制性miRNA，其表达水平显著下调，与多种恶性肿瘤的进展、转移和不良预后密切相关[5]。因此，开发高灵敏度和特异性的miRNA let-7a检测方法对于早期癌症诊断、精准治疗和预后评估具有重要的临床价值。
然而，传统的检测技术（包括Northern印迹、微阵列分析和实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）在临床应用中存在诸多限制：由于血清/组织样本中miRNA的丰度极低，灵敏度不足；区分同源序列的技术挑战；易受RNA降解的影响；以及依赖于复杂的扩增程序或繁琐的操作流程[6]、[7]、[8]。生物传感器通常包含两个核心功能模块：一个用于结合特定目标分子的识别模块，另一个用于将分子相互作用转化为可检测信号的报道模块[9]。CRISPR/Cas系统具有独特的三重功能，结合了目标识别、信号放大和信号生成，使其在生物传感器开发中极具前景[10]。一个显著的例子是CRISPR/Cas12a系统，它可以识别双链DNA（dsDNA）或单链DNA（ssDNA）目标，并在激活后通过非特异性高效降解邻近的ssDNA来表现出强大的切割活性[11]。由于其可编程的目标特异性、催化信号放大和模块化适应性，基于CRISPR/Cas12a的生物传感平台已成为miRNA检测的变革性工具。
单独的CRISPR/Cas12a技术的灵敏度通常有限。为了进一步提高检测性能，经常结合核酸扩增策略和先进的信号输出平台[12]。等温核酸扩增技术，如杂交链反应（HCR）和指数放大反应（EXPAR）[13]、[14]，由于无需热循环设备、操作简单和扩增效率高，为检测低丰度miRNA提供了创新解决方案[15]。此外，CRISPR/Cas12a可以与纳米材料结合，以实现稳定的信号放大和高灵敏度检测[16]、[17]。
尽管取得了进展，但CRISPR/Cas12a单模生物传感器的临床应用仍受到环境干扰和假阳性/假阴性风险等限制，影响了其在临床诊断中的可靠性[18]、[19]。为了解决这些问题，研究人员开发了多模检测策略，在单个平台上整合互补信号以通过信号交叉验证来提高准确性。近年来，已经开发了多种CRISPR/Cas12a介导的双模系统，包括荧光/比色[20]和荧光/电化学系统[21]。然而，双信号输出可能来自相同的报告分子或共享相同的扩增途径，导致信号串扰，影响有效的交叉验证[22]。为了从根本上克服串扰限制并实现更强的交叉验证，采用正交信号转导途径的三模生物传感器成为了一个有前景的方向。这些系统经过设计，确保每种检测模式通过不同的独立机制运行，从而消除相互干扰，提供真正的互补验证。
在这项研究中，我们开发了一种新型的三模（比色/荧光/电化学）生物传感器用于miRNA let-7a的检测。核心设计整合了双CRISPR/Cas12a系统、EXPAR预放大和DSN辅助的信号转导以及HCR，构建了三个独立的信号通路。简而言之，目标miRNA let-7a首先通过EXPAR扩增生成丰富的触发链。然后这个触发链启动三个独立的级联反应：① 比色（关闭信号）：触发链激活第一个CRISPR/Cas12a系统，切割G-四链体（G4）形成序列，抑制G4/hemin DNAzyme的形成，降低ABTS比色信号；② 荧光（关闭信号）：触发链与磁珠上的捕获探针杂交，形成双链，被DSN酶切割，阻止FAM标记链的后续HCR组装，导致FAM荧光信号几乎不可检测；③ 电化学（开启信号）：由于DSN酶切割导致没有HCR产物，第二个CRISPR/Cas12a系统保持不活跃状态，使3D-CdCo-ONSs@AuNPs纳米复合材料能够与电极结合，产生放大的电化学响应。基于比色、荧光和电化学原理的三个输出信号分别通过独立且不干扰的反应途径生成，实现了真正的多模交叉验证。这种设计不仅显著提高了miRNA let-7a的检测准确性和结果可靠性，还为复杂生物样本的精确分析和临床诊断应用提供了一个多功能、稳健的平台。
实验部分
实验细节，包括试剂、仪器、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）条件、P2-3D-CdCo-ONSs@AuNPs合成方案、电极修饰程序以及电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）测量方法，在补充信息中提供。
生物传感器示意图
该系统创新性地整合了关键技术，包括EXPAR扩增、CRISPR/Cas12a切割、HCR级联扩增和DSN酶消化。通过三个检测模块——比色、荧光和电化学——实现了miRNA let-7a的精准检测。具体模块的原理如下（图1）：
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miRNA let-7a信号输入（步骤1）：miRNA let-7a通过EXPAR扩增生成特定的单链DNA（触发链）。
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结论
本研究成功开发了一种基于双CRISPR/Cas12a系统、等温扩增和DSN酶的多模生物传感器，通过比色、荧光和电化学检测模式实现了miRNA let-7a的高灵敏度和特异性检测。该传感器的关键创新包括：（1）多模信号输出和交叉验证：传感器集成了比色、荧光和电化学检测模式，提供同时的信号输出
CRediT作者贡献声明
周洋：正式分析。阙龙斌：可视化、数据管理。荣胜忠：撰写——审稿与编辑。马洪坤：软件、正式分析。张和华：撰写——初稿、方法学、研究、概念化。朱焕：可视化、数据管理。高洪民：可视化、数据管理。常东：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。潘洪志：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取
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致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（82504549、82574158、82473682、82173568、82273687）、上海之星计划（24YF2721100）、上海市卫生健康委员会健康产业临床研究专项2025（20254Y0157）、黑龙江省春燕计划青年科技人才团队项目（CYQN24028）、上海市卫生健康和计划生育委员会重点学科建设项目（PWZxk2022-08）等项目的支持。
