LDLR基因座候选顺式调控元件的功能性筛选

《PLOS Genetics》：Functional interrogation of candidate cis-regulatory elements at the LDLR locus

　　

摘要 LDLR基因表达的调控在动脉粥样硬化性疾病（如心肌梗死和脑卒中）的发生发展中起着重要作用。尽管固醇反应元件（SREs）对LDLR的调控已得到充分表征，但LDLR基因座其他非编码区域的功能重要性仍不明确。本研究开发并应用了一种高通量CRISPR筛选技术，在天然基因组背景下测试了候选LDLR顺式调控元件（CREs）的功能重要性。研究人员共发现25个离散区域对LDLR表达表现出显著影响。针对其中一个位于第一内含子且具有特别强活性的区域，研究人员通过验证其破坏会减少内源性LDLR表达，并将其插入最小启动子上游可增强报告基因表达，从而确认了其增强子活性。随后，研究人员应用大规模并行报告基因检测（MPRA）将这一区域的增强子活性精细定位到一个129 bp的区间。该区间在脊椎动物中高度保守，表现出增强子活性的生化特征，富集了转录因子结合基序，并包含一个常见遗传变异（rs57217136），该变异已被全基因组关联研究（GWAS）证实与人类低密度脂蛋白胆固醇水平相关。总之，这些发现展示了CRISPR筛选在探究候选CREs方面的强大能力，并阐明了LDLR基因座非编码序列的功能图谱。

研究背景与意义

肝脏中低密度脂蛋白受体（LDLR）的表达量是决定个体终生动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）风险的关键因素。虽然SREBP转录因子及其在LDLR基因启动子上的固醇反应元件（SREs）的结合已被确立为核心调控机制，但真核基因的调控是一个复杂过程，常涉及启动子与非编码DNA中的顺式调控元件（CREs）之间的相互作用。人类基因组中估计有数十万至数百万个CREs，而LDLR基因座除了已知的SREs外，还存在多个暗示其受复杂调控的证据：不同含SREs的基因表达差异巨大；存在不依赖固醇机制调节LDLR的其他转录因子；全基因组关联研究（GWAS）发现了位于LDLR基因座附近但与SREs不直接重叠的非编码常见遗传变异；以及基因组谱分析鉴定出了不共定位SREs的候选CREs。因此，解析LDLR基因座非编码区域的功能景观对于深入理解LDLR调控及ASCVD发病机制具有重要意义。此前，研究人员已成功建立了针对编码基因组的高通量CRISPR筛选平台，本研究则将该策略延伸至非编码基因组，旨在系统性地鉴定LDLR基因座的功能性CREs。

关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术：首先，基于多族群GWAS数据（超过160万个体）、ENCODE项目的表观遗传数据（包括ATAC-seq、DNase-seq、H3K27ac ChIP-seq）以及进化保守性分析，设计并合成了一个包含12,375条gRNA的定制化CRISPR文库，靶向LDLR基因座周围约70 kb的非编码区域。其次，在HuH7肝细胞中进行了基于流式细胞术分选的高通量CRISPR筛选，通过荧光标记LDL摄取量的变化来评估gRNA的富集情况。第三，应用大规模并行报告基因检测（MPRA），设计包含不同长度重叠片段（tile）的寡核苷酸池，对筛选出的关键区域进行增强子活性的精细定位。此外，还结合了传统的荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR、流式细胞术以及单克隆细胞的基因编辑验证等手段。

研究结果

针对LDLR基因座候选CREs的定制CRISPR文库的设计与合成

研究人员通过分析大型LDL胆固醇GWAS数据、人类肝脏组织的表观遗传特征（开放染色质、H3K27ac修饰）以及进化保守区域，综合提名了候选CREs。最终构建的CRISPR文库包含12,375个gRNA靶点，覆盖了LDLR转录起始位点（TSS）上下游约70 kb的区域，并加入了阴性和阳性对照gRNA。

通过CRISPR筛选探究候选LDLR CREs

在HuH7细胞中进行筛选，结果显示阴性对照gRNA与阳性对照gRNA（靶向LDLR和MYLIP编码区）的分离效果良好，证明了筛选体系的可靠性。分析表明，绝大多数靶向候选CREs的gRNA在LDL高摄取与低摄取群体间无显著差异。去除预测会在内含子-外显子连接处（IEJ）附近产生双链断裂（DSB）的gRNA后，仍有867条gRNA显示出显著降低LDLR表达的效果。通过滑动窗口分析，研究人员最终鉴定出25个显著且独特的CRE峰，这些区域主要聚集在靠近LDLR TSS的区域。

LDLR CREs与部分常见LDL胆固醇相关变异共定位

对包含72个强关联GWAS变异的约30 kb区域的分析显示，位于LDLR启动子上游的整个区域在筛选中活性极低，未发现显著的CRE峰。相反，位于第一内含子的多个gRNA在LDL低摄取细胞中显著富集，表明其靶向区域的破坏导致了LDLR表达下降。其中最强的活性集中在第一内含子早期的两个相邻大CRE峰上，其中一个峰与GWAS强关联变异rs59281581重叠。该区域还表现出开放染色质特征、典型的增强子组蛋白修饰模式以及高度的进化保守性。

LDLR第一内含子增强子活性的确认

为了验证第一内含子区域对内源性LDLR表达的功能意义，研究人员选取了该区域的单个gRNA转导HuH7和HepG2细胞，发现其显著降低了LDL摄取量和LDLR mRNA水平。此外，将该内含子片段克隆到带有最小启动子的慢病毒报告载体中，发现其能使eGFP荧光强度增加约50倍，活性与著名的SV40增强子相当，从而证实了该区域具有经典的增强子功能。

LDLR第一内含子增强子活性的精细定位

鉴于CRISPR筛选在精确边界界定上的局限性，研究人员开发了MPRA。设计了一个包含74个重叠tile（长度分别为172、129、86和43 bp）的文库，覆盖CRISPR筛选中活性最强的860 bp区间。在HuH7和HepG2细胞中的检测结果显示，大多数tile无显著活性，但有一组特定的tile表现出与阳性对照相当甚至更强的活性，且在两种细胞系中具有极高的相关性。热图分析表明，活性最强的tile均重叠于同一核心区域。

精细定位增强子活性的验证

研究人员构建了包含三个不同片段（包含tile 6和42）的报告基因载体，证实其中两个片段完全重现了全长构建体的增强子活性，且正反取向均有效。为了在内源性背景下验证，研究人员利用一对gRNA在HuH7细胞中删除了该精细定位的增强子区域，获得了一个复合杂合缺失的单克隆细胞系。表型分析显示，该细胞系在脂蛋白丰富和缺乏条件下均表现出LDL摄取缺陷和LDLR mRNA水平降低，确证了该129 bp区域作为LDLR第一内含子增强子的功能。

讨论与结论

本研究通过高通量CRISPR筛选在LDLR基因座鉴定了25个功能性CREs，并利用MPRA将其中一个位于第一内含子的强增强子活性精细定位至129 bp的保守区域。该区域包含GWAS关联变异rs57217136，且不含有经典的SREBP结合位点，提示存在不依赖于SREBP的新型调控机制。研究还讨论了CRISPR核酸酶筛选在检测某些CREs时可能存在的局限性，如依赖于SpCas9 PAM序列的分布、gRNA活性的异质性以及indel大小的限制等。尽管如此，这项工作极大地拓展了人们对LDLR基因座非编码区域功能景观的理解，揭示了新的潜在治疗靶点，并展示了高通量基因组工具在解析非编码基因组方面的巨大潜力。论文发表于《PLOS Genetics》。