肉类产品为人类发育提供必需的营养素。然而，出于经济利益的肉类掺假行为（EMA）——例如用廉价替代品部分或完全替代高价值肉类（Salter, 2018; Zhang & Xue, 2016）——已演变成每年价值数十亿美元的全球非法贸易。虽然常见的掺假行为通常涉及较便宜的牲畜（如猪肉或家禽），但欺诈手段变得越来越复杂，包括未申报地添加非食用动物，特别是猫和狗，这些动物来自流浪动物群体或毛皮贸易（W. Wang et al., 2023; Yang et al., 2022）。这类动物的加入尤其令人担忧，因为它们通常在不受监管的屠宰和检验系统之外进入食物链，从而带来潜在的食品安全和公共卫生风险（Wertheim et al., 2009）。这种不当行为不仅侵犯了消费者权益，还降低了整体质量标准（Y. He et al., 2025），破坏了市场诚信，并违反了宗教或道德饮食规定。为了解决这些问题，实施从农场到餐桌的严格监控系统（Dwinger et al., 2008）并推动检测技术的持续进步以确保肉类的可追溯性和真实性至关重要。可靠的分析工具能够实现快速准确的物种鉴定，对这些努力至关重要。分子水平的诊断技术已逐渐取代了传统的形态学或宏观方法来鉴定肉类种类（Y. Li et al., 2020）。其中，聚合酶链反应（PCR）和实时定量PCR（RT-qPCR）目前被视为工业实践和监管协议中的黄金标准。此外，分子诊断技术的发展朝着高分辨率方向发展，例如下一代测序（NGS）工作流程用于解析复杂的串联重复多态性（B. He et al., 2020）。然而，这些技术依赖于昂贵的实验室设备、复杂的热循环过程以及高度训练的人员，这限制了它们在时间敏感或现场场景中的应用（Chaibun et al., 2021）。延迟或不足的检测会导致掺假产品在市场上流通，增加健康风险，损害消费者信心，并阻碍监管监督。因此，迫切需要开发便携、快速且经济实惠的检测平台，适用于即时检测（POCT）（Kumar & Narsaiah, 2021）。
等温核酸扩增技术（INAATs），如环介导的等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA），已成为PCR的有效替代方案，用于快速分子诊断（Pumford et al., 2020）。RPA因反应速度快、操作简单且设备要求低而在食品分子诊断领域受到越来越多的关注（Cao et al., 2018; S. Wang et al., 2025）。与LAMP不同，RPA只需要一对简单的引物即可针对目标进行扩增，便于实际应用（Cho et al., 2014）。然而，INAATs容易发生非特异性扩增，尤其是在多重检测系统中可能导致假阳性结果（Dong et al., 2024; Fang et al., 2025）。为了解决这些问题，引入了基于CRISPR的核酸检测系统，特别是利用Cas12a的系统，以实现高度特异性的目标识别和报告分子的协同切割（F. Li et al., 2021）。这些系统在多种生物基质中表现出广泛的应用性，从快速病毒诊断（Z. Chen et al., 2022）到食品安全监测（F. Li et al., 2021; Wu et al., 2021）。虽然单独的CRISPR系统通常灵敏度较低，但将其与等温扩增结合使用——如SHERLOCK（Gootenberg et al., 2017）、DETECTR（J. S. Chen et al., 2018）和HOLMES v2（S.-Y. Li, Cheng et al., 2018）等平台所示——显著提高了整体检测性能。已经开发出两种主要的整合策略：一步法和两步法。一步法简化了操作，但多项研究表明，RPA试剂和CRISPR/Cas组分的共存可能导致分子冲突和试剂不兼容（Shu et al., 2024）。特别是在一步法中，Cas12a的过早激活可能通过顺式切割目标DNA干扰扩增产物的积累和稳定性，而其对单链DNA的非特异性切割活性可能破坏报告分子的完整性，并可能在RPA过程中干扰引物的可用性。这些分子干扰以及RPA扩增和CRISPR检测之间的缓冲液和反应条件不兼容性，已被证明会降低检测灵敏度并增加假阳性背景信号（Lin et al., 2022; G. Zhao et al., 2022）。相比之下，两步法将扩增和检测物理分离，从而解耦了这两个过程的独特生化要求。这种分离允许每个反应在最佳条件下进行，从而提高信噪比和分析灵敏度。因此，两步法在痕量检测（如肉类掺假分析）中具有优势。
尽管RPA-CRISPR/Cas12a检测系统具有显著的应用潜力，但多重检测仍然是该领域的主要挑战。大多数现有方法需要物种特异性引物，这增加了设计复杂性并限制了可扩展性（Peng et al., 2024）。此外，CRISPR/Cas12a中对原间隔序列（PAM）的严格要求限制了选择性单核苷酸多态性（SNP）位点的选择，尤其是在亲缘关系密切的物种之间（Kim et al., 2016）。为了提高检测的通用性，人们探索了基于通用引物的策略，这些引物针对保守的基因区域。Gootenberg等人首次展示了这种策略，他们表明基于CRISPR的检测可以与广谱扩增目标（如细菌rRNA基因）结合，以实现物种级别的区分（Gootenberg et al., 2017）。在食品鉴定中，通用引物方法主要与传统的PCR或实时PCR平台结合使用，例如在多物种肉类鉴定检测中（W. Wang et al., 2023）。然而，它们与等温扩增和基于CRISPR的系统的整合仍然有限。因此，针对多种肉类鉴定的通用引物RPA-CRISPR策略在食品安全领域尚未得到充分探索。关键的线粒体DNA（mtDNA）如COI、cytochrome b、16S rRNA和12S rRNA具有保守区域，允许通用引物结合，同时包含适合物种级别区分的可变位点（Fi?er Pe?nikar & Buzan, 2014; Giusti et al., 2017; Kitano et al., 2007）。虽然像COI和cytochrome b这样的蛋白质编码基因是标准条形码，但它们通常需要退化引物来适应序列变异性（Deagle et al., 2014）。然而，退化引物会降低特定匹配序列的有效浓度，从而阻碍重组酶-引物丝的形成，这是高效RPA启动所必需的（Piepenburg et al., 2006）。相比之下，12S rRNA基因包含高度保守的结构基序，允许设计非退化的通用引物。这种策略确保了最佳的RPA动力学，同时在短扩增子内提供了足够的种间多态性，适合CRISPR/Cas12a的区分，这与其在 metabarcoding应用中的广泛应用相一致（Daher et al., 2016; Miya et al., 2015）。
在这项研究中，我们开发了一种两步RPA-CRISPR/Cas12a平台，用于并行鉴定11种肉类（鸡肉、鸭肉、鹅肉、牛肉、猪肉、羊肉、马肉、兔肉、驴肉、猫肉和狗肉）。该方法使用一对通用引物针对12S rRNA基因，然后通过并行CRISPR/Cas12a反应进行特异性检测。结合快速DNA提取协议，该平台为实验室或资源有限的环境中肉类物种的定性筛查提供了实用工具。
