肠道微生物群代谢组学定量串联液相色谱-串联质谱方法的开发

《ACS Omega》：Development of a Quantitative Serial LC-MS/MS Method for Gut Microbiota Metabolomics

　　

肠道微生物群在人类健康中的重要性日益受到关注，相应的，代谢组学已被用于阐明宿主-微生物群相互作用。液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）因其定量能力而成为肠道微生物群代谢组学分析的理想选择。然而，常规LC-MS/MS需要多根色谱柱、多种流动相以及复杂的程序来为每种目标代谢物优化条件。为解决这些局限性，研究人员开发了一种定量串联LC-MS/MS方法，命名为神户大学单流动相多柱串联LC-MS/MS分析平台（Kobe University Serial LC-MS/MS Analysis using Multiple columns with a Single mobile phase, KUSLAMS）。该平台整合了两根色谱柱（五氟苯基丙基柱（Pentafluorophenylpropyl, PFPP）和C18柱）以及一种衍生化方法，实现对215种代谢物（包括氨基酸、核苷酸、羧酸、胺类和脂肪酸）的无缝、高通量定量分析。 reproducibility通过使用82种细胞内肠道微生物群代谢物进行评估，这些代谢物的新分析方法在本研究中建立。其中，64种代谢物的变异系数（Coefficient of Variation, CV）低于15%。将KUSLAMS应用于含或不含菊粉（inulin）的体外肠道微生物群培养系统，揭示了21种细胞内和14种细胞外代谢物的浓度差异。值得注意的是，几种代谢物表现出细胞内增加而细胞外减少的浓度变化，提示细胞内积累与细胞外耗竭之间可能存在关联，尽管这一解释尚属探索性。这些结果表明，KUSLAMS能够同时监测细胞内和细胞外代谢物动态变化。综上所述，这些发现证明KUSLAMS是一个稳健且多功能的平台，可用于探索与人类健康相关的微生物群衍生代谢物。

肠道微生物群（gut microbiota）是指定植于宿主肠道的全部共生微生物群落及其集体基因组、代谢物和周围环境的总和。人类肠道中栖息着数以亿计的微生物，产生复杂的代谢物网络。近年来，越来越多的证据表明肠道微生物群既与维持人类健康密切相关，也参与多种疾病的发生发展。菊粉型果聚糖（inulin-type fructans）等益生元（prebiotic）可通过促进肠道微生物群产生短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids, SCFAs）来改善活动性溃疡性结肠炎；而肠道微生物群产生的三甲胺-N-氧化物（Trimethylamine-N-Oxide, TMAO）则被证实是心血管疾病的危险因素。因此，调节肠道微生物群已成为维持健康和防治疾病的重要策略，目前常用的手段包括益生菌（probiotic）补充、益生元补充以及粪菌移植（Fecal Microbiota Transplantation, FMT）等。

然而，肠道微生物群调节所产生的治疗效应的确切机制十分复杂，难以阐明。因此，开发更先进的分析方法以明确肠道微生物群调节效应，对于推进益生菌相关研究至关重要。目前，宏基因组学（metagenomics）、表观基因组学（epigenomics）、转录组学（transcriptomics）和代谢组学（metabolomics）等组学技术正被用于探究肠道微生物群与人类健康和疾病的关系。其中，代谢组学尤为关键，因为肠道微生物群产生的代谢物可对宿主生理产生直接影响。例如，微生物来源的吲哚-3-乙酸（Indole-3-Acetic Acid, 3-IAA）已被报道能够调节胰腺癌的化疗效果。

在代谢物检测技术方面，气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS）、毛细管电泳-质谱联用（Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry, CE-MS）和LC-MS/MS均可用于定量肠道微生物群来源的代谢物（包括SCFAs、有机酸、多胺和氨基酸等）。然而，GC-MS和CE-MS在灵敏度和覆盖范围方面可能存在不足，难以实现对肠道微生物代谢物的全面分析。因此，LC-MS/MS因其更高的灵敏度和更广泛的适用性，目前成为首选分析方法，可通过组合适当的色谱柱和流动相条件来分析多种类型的代谢物。

## 研究背景与目的

尽管已有多种分析方法被开发用于定量各类与肠道微生物群相关的重要代谢物标志物，但这些方法普遍存在通量低、操作复杂的问题。例如，多胺通常使用C18柱分析，SCFAs则常需衍生化后才能有效检测，因为未衍生化的SCFAs在反相LC-MS中的保留较弱且电喷雾离子化（Electrospray Ionization, ESI）响应较低。研究人员此前虽已开发了覆盖多种初级代谢物的检测方法，但由于流动相条件的差异，这些分析无法在同一台仪器上连续进行，导致通量降低、实用性受限。二维液相色谱-质谱联用（2D-LC-MS）虽能通过组合两种不同的液相分离来覆盖化学性质多样的代谢物，但存在峰展宽、检测灵敏度降低、流动相选择受限以及操作复杂等缺点，不太适合常规靶向定量分析。

为解决上述问题，本研究旨在开发一种更为简化的定量串联分析方法，用于全面分析肠道微生物群功能相关的多样化代谢物。研究人员从前期研究中筛选了215种代谢物作为候选标志物，涵盖短链脂肪酸产生、氨基酸/吲哚代谢、胆汁酸转化等核心肠道微生物代谢途径，以及先前报道的与微生物组和疾病相关的生物标志物。

## 关键技术方法

本研究采用的核心技术方法包括：（1）基于单个流动相组成（0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液）的自动化色谱柱切换系统，通过切换阀在批次水平切换PFPP柱和C18柱的流路；（2）PFPP柱利用五氟苯基丙基固定相，基于氢键、偶极-偶极相互作用、π-π相互作用和疏水相互作用实现分离，而C18柱主要通过疏水相互作用分离，两根色谱柱的串联使用实现了化学性质多样的代谢物的互补覆盖；（3）3-硝基苯肼盐酸盐化学衍生化方法，用于改善羧酸类等代谢物的检测性能；（4）多反应监测（Multiple Reaction Monitoring, MRM）模式的LC-MS/MS定量分析；（5）使用神户大学人类肠道微生物群模型（Kobe University Human Intestinal Microbiota Model, KUHIMM）作为体外培养系统，该培养系统使用来自健康日本志愿者的粪便样本，在Bio Jr. 8发酵罐中进行厌氧培养，并结合菊粉干预进行代谢组学分析；（6）主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）和火山图分析用于评估代谢物变化，统计显著性采用未校正p值结合倍数变化标准，同时报告Benjamini-Hochberg假发现率（False Discovery Rate, FDR）校正后的p值。

## 研究结果

**215种代谢物串联分析方法的构建**

研究人员开发了一种新型MRM模式的LC-MS/MS定量方法，可同时分析215种目标代谢物，包括氨基酸、核苷、核苷酸、羧酸、胺、脂肪酸及其他小分子。方法整合了化学衍生化步骤和两种不同类型的色谱柱（PFPP和C18），以实现广泛的代谢物类别覆盖和互补分离。其中187种为非衍生化代谢物（168种用PFPP柱分析，19种用C18柱分析），28种为衍生化代谢物（均用C18柱分析）。两根色谱柱在相同的流动相条件下操作（0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液），通过切换阀在批次水平改变流路，无需更换色谱柱或流动相即可实现无缝串联分析。此外，本研究还新增了82种与肠道微生物群代谢组学相关的代谢物分析，包括35种PFPP柱分析代谢物、19种C18柱分析代谢物和28种衍生化-C18柱分析代谢物。KUSLAMS系统在宽广的校准动态范围内实现了灵敏定量，其中31种代谢物的动态范围达到10⁴–10⁵数量级。该方法的灵敏度与前期报道相当，表明串联色谱柱切换分析可提供与独立分析相当的灵敏度和重复性。

**生物样品的分析系统评估**

研究人员使用改良的大肠杆菌提取方法获取肠道微生物群细胞内代谢物，对分析系统的稳健性和重复性进行了评估。在82种新靶标代谢物中，64种被成功检测且具有高度重复性（CV ≤ 15%），其中48种代谢物的CV低于5%。尽管生物基质复杂，KUSLAMS仍表现出优异的重复性。此外，仪器重复性（重复进样）、日间精密度、携带污染、样品稳定性、加标回收率和基质效应等指标均得到了系统评估。

**人肠道微生物群代谢组学应用**

研究采用KUHIMM培养系统，对添加菊粉前后的肠道微生物群进行了代谢组学分析。在代谢组学分析前，通过高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）验证了菊粉效应的可重复性，结果显示最丰富的代谢物乙酸在菊粉补充后显著增加。16S rRNA测序显示，已知产乙酸的双歧杆菌（Bifidobacterium）相对丰度在菊粉补充后增加了约16%，这与前期临床报道一致。研究人员共定量了159种细胞内代谢物，揭示了其浓度的时间变化规律，表明KUSLAMS的灵敏度足以捕获人肠道微生物群中代谢物浓度的动态范围。

PCA分析显示，细胞内和细胞外数据集均呈现CUL组（无菊粉培养）和INU组（含0.3%菊粉培养）之间的分离趋势。在72小时培养后，21种细胞内代谢物和14种细胞外代谢物发生了超过2倍的变化（未校正p值）。共有5种代谢物在细胞内和细胞外同时被检测到变化。值得注意的是，3-苯丙酸（3-phenylpropionic acid）表现出相反的变化趋势：细胞内浓度增加而细胞外水平降低，这提示了细胞内积累与细胞外耗竭之间可能存在关联，但这一解释尚属探索性，需要进一步验证。

## 讨论与结论

本研究开发的KUSLAMS平台通过自动化色谱柱切换，在单一流动相条件下连续使用PFPP和C18柱，实现了多样化代谢物的高通量定量分析。其广泛的代谢物覆盖度和高定量重复性可从液相色谱和质谱两个角度解释：从液相色谱角度，一是充分利用了PFPP和C18柱不同的相互作用机制，二是使用含0.1%甲酸的单一流动相维持了酸性条件（pH ≤ 3.0），抑制了非特异性离子相互作用，改善了分离效果和保留时间稳定性；从质谱角度，在单一流动相下连续切换PFPP和C18柱使离子化条件保持恒定，从而提高了重复性。

KUSLAMS相较于此前仅能定量113种代谢物的单PFPP分离方法，通过串联组合PFPP和C18分离（以及额外的衍生化-C18运行），显著扩展了代谢物覆盖范围，同时简化了操作并提高了实际通量。然而，部分代谢物表现出较高的CV值，这可能是由于样品制备和衍生化过程中的手工操作（如依赖操作者的移液准确性和精度，以及有机溶剂处理）所致，未来可通过自动化来减少这些问题。

研究结论：KUSLAMS能够在单一流动相条件下通过PFPP和C18柱的连续切换实现多样化代谢物的串联定量分析，具有高通量、高覆盖度和高重复性的特点，为肠道微生物群代谢组学研究提供了一个稳健、定量且用户友好的分析平台。