含有非天然氨基酸的BAFF蛋白创新疫苗触发抗内源性BAFF自身抗体产生并缓解胶原诱导性关节炎

《ACS Omega》：Innovative Vaccine Composed of the BAFF Protein Containing an Unnatural Amino Acid Triggers the Production of Autoantibodies against Endogenous BAFF and Alleviates Collagen-Induced Arthritis

　　

B细胞激活因子（BAFF）在B淋巴细胞存活与稳态中发挥基础性作用，其信号传导异常与多种自身免疫疾病密切相关。尽管基于单克隆抗体和工程受体的被动免疫策略在治疗自身免疫疾病方面已取得一定成功，但持续给药的成本及潜在免疫原性等问题仍然存在。研究人员报道了一种创新的抗BAFF主动疫苗，该疫苗通过位点特异性掺入非天然氨基酸对硝基苯丙氨酸（pNO₂-Phe）至可溶性小鼠BAFF缺失突变体（DmBAFF）中而构建。该疫苗可触发针对内源性BAFF的体液免疫应答，并在小鼠模型中成功缓解胶原诱导性关节炎（CIA）。对两种品系小鼠（DBA/1(H2^q)和C57BL/6 (H2^b)）中pNO₂-Phe-DmBAFF突变体免疫应答的分析表明，这些突变体破坏了T细胞和B细胞对内源性分子的免疫耐受，并产生了针对野生型mBAFF（WT-mBAFF）相应修饰表位的强效且特异性的抗体。与DmBAFF相比，在Y91或Y139位点含有pNO₂-Phe的DmBAFF进行预防性接种显著降低了关节炎发病率和关节炎症，但对T细胞和B细胞亚群无明显影响。综合这些数据，含有位点特异性pNO₂-Phe的BAFF预防性接种是自身免疫性关节炎有效的预防性干预选择。该疫苗在疾病发作后的治疗潜力仍有待评估。

**研究背景与问题提出**

B细胞激活因子（B-cell-activating factor, BAFF），又称BLyS、TALL-1或TNFSF13B，是调控B细胞功能的关键稳态细胞因子，在先天性和适应性免疫应答调节中具有重要作用。BAFF以膜结合形式表达，在高尔基体中被弗林蛋白酶切割后产生具有活性的可溶性细胞因子，并通过与BAFF-R、TACI和BCMA三种细胞表面受体结合发挥生物学功能。研究表明，系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）及干燥综合征（SS）患者血清中可溶性BAFF水平升高且与疾病活动度相关，提示BAFF信号失调与自身免疫疾病发生发展密切相关。

鉴于BAFF在外周B细胞存活调控中的关键作用，阻断BAFF信号成为自身免疫疾病治疗的潜在策略。贝利尤单抗（belimumab）是首个获批用于治疗活动性、自身抗体阳性SLE的抗BAFF单克隆抗体；atacicept（TACI-Fc融合蛋白）则通过中和BAFF及其同源物APRIL发挥作用，目前针对SLE和RA等疾病的临床研究正在进行中。然而，被动免疫策略存在生产成本高、需持续给药及潜在免疫原性等局限性，因此开发靶向BAFF的替代性治疗策略对于自身免疫疾病的广泛治疗具有重要意义。

主动抗BAFF疫苗作为一种创新性靶向治疗策略具有独特优势：单次或有限次数接种即可诱导持久的自身免疫应答，避免频繁给药。然而，利用BAFF这一自身抗原进行疫苗设计的核心挑战在于如何有效打破机体对自身BAFF的免疫耐受。研究人员提出通过基因密码子扩展技术将非天然氨基酸p-硝基苯丙氨酸（pNO₂-Phe）位点特异性掺入BAFF分子，利用硝基芳基基团的高免疫原性特征创建新的T细胞表位，从而破坏免疫耐受并诱导交叉反应性抗BAFF抗体产生。

**主要技术方法**

研究采用基因密码子扩展技术构建pNO₂-Phe位点特异性掺入的DmBAFF突变体疫苗。具体而言：利用正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA对（来源于詹氏甲烷球菌），通过琥珀终止密码子（TAG）将pNO₂-Phe引入小鼠BAFF缺失突变体（amino acids 115–122替换为两个甘氨酸残基）的特定位点。研究选取Y91、Y100、Y139和R158四个位点进行非天然氨基酸掺入，最终筛选Y91和Y139位点用于CIA模型预防性研究。技术验证包括：生物膜层干涉技术（BLI，Octet RED 96系统）测定BAFF-R亲和力；ELISA检测抗BAFF及抗COII抗体滴度；T细胞再刺激实验测定IFN-γ分泌及细胞增殖；流式细胞术分析淋巴细胞亚群；X射线影像学及骨密度分析评估关节损伤；合成生物素化环肽进行表位图谱分析。

**研究结果**

**DmBAFF及突变体的表达与表征**：WT-mBAFF基因编码可溶性片段，而DmBAFF因缺失115-122位氨基酸并替换为两个甘氨酸残基，在大肠杆菌中表达量提高约20倍，且约40%为可溶性蛋白。pNO₂-Phe掺入的DmBAFF变体经SDS-PAGE验证表达成功，肽段测序确认R158位点掺入（质量偏移约85 Da）。亲和力测定显示DmBAFF及pNO₂-Phe突变体与BAFF-R的亲和力较WT-BAFF降低约100倍，证实其生物活性显著降低，适合作为疫苗候选物。

**免疫原性分析**：在DBA/1 (H2^q)和C57BL/6 (H2^b)两种MHC背景小鼠中，pNO₂-Phe91-DmBAFF诱导产生最高滴度的抗WT-mBAFF交叉反应性IgG抗体，pNO₂-Phe100和139组产生中等水平抗体，而pNO₂-Phe158组与DmBAFF组无显著差异。T细胞再刺激实验显示，pNO₂-Phe-DmBAFF免疫小鼠的脾细胞在特异性抗原刺激下产生更高水平的IFN-γ和细胞增殖反应，其中pNO₂-Phe91组反应最强。综合免疫原性排序为Y91 ~ Y100 > Y139 > R158，表明pNO₂-Phe掺入可有效破坏T细胞和B细胞对自身BAFF的免疫耐受。

**预防性接种对CIA的保护作用**：在DBA/1小鼠CIA模型中，于CIA诱导前（day 0）及day 12、day 25分别进行DmBAFF、pNO₂-Phe91-DmBAFF或pNO₂-Phe139-DmBAFF预防性接种。结果显示：对照组DmBAFF接种小鼠出现典型严重关节炎症状，平均临床评分达约7分；而pNO₂-Phe91-DmBAFF和pNO₂-Phe139-DmBAFF组关节炎进展显著抑制，终末期评分分别约为1.5和2分。关节炎发病率方面，所有对照组小鼠在关节炎发作后1周出现爪肿胀，而突变体组仅约半数出现症状。抗体分析显示，突变体组抗WT-mBAFF IgG滴度显著升高，且与抗COII IgG水平呈负相关。X射线及骨密度分析表明，对照组小鼠关节出现明显骨溶解和畸形，而pNO₂-Phe-DmBAFF组大多数未见关节损伤、骨质丢失或畸形。值得注意的是，流式细胞术分析显示疫苗接种对脾脏及外周血T细胞、B细胞比例无显著影响。

**表位图谱分析**：为探究DmBAFF与突变体诱导抗体的差异，研究设计6条环肽（P1-P6）进行表位定位。结果显示，pNO₂-Phe91-DmBAFF和pNO₂-Phe139-DmBAFF免疫小鼠分别特异性产生针对P3（对应WT-mBAFF 79-104位氨基酸，含Y91）和P6（对应WT-mBAFF 138-169位氨基酸，含Y139）的高滴度抗体；而DmBAFF免疫小鼠仅识别P2，且突变体组与DmBAFF组间无交叉反应差异。缺失片段对照肽P4未见抗体结合。该结果证实pNO₂-Phe在Y91或Y139位点的掺入与免疫自身耐受的破坏及相应表位特异性抗体的产生相关。

**讨论与结论**

研究人员讨论了BAFF作为自身免疫疾病治疗靶点的重要性及现有被动免疫策略的局限性，强调开发主动免疫治疗的必要性。研究指出，通过基因密码子扩展技术将pNO₂-Phe掺入DmBAFF可创建T细胞新表位，以MHC依赖和位点依赖方式诱导产生抗WT-mBAFF抗体。预防性接种策略在高风险人群（如自身抗体阳性但尚未出现临床症状者）中具有潜在应用价值，但使用完全弗氏佐剂（CFA）的局限性及临床可接受佐剂的开发是未来转化研究的关键。

研究结论部分指出：该研究中，研究人员评估了BAFF疫苗对自身免疫疾病预防效果。将非天然氨基酸pNO₂-Phe掺入BAFF生物学惰性形式DmBAFF的特定位点，可破坏T细胞对内源性分子的耐受，并产生针对WT-mBAFF相应修饰表位的强效特异性抗体。数据表明pNO₂-Phe-DmBAFF的免疫原性取决于掺入位点和MHC背景，尽管未直接测定对BAFF-R结合及下游信号的影响。此外，与DmBAFF相比，pNO₂-Phe-Y91-或Y139-DmBAFF的预防性接种显著降低关节炎发病率和发病率，并缓解小鼠关节炎模型中的炎症和关节破坏。需要强调的是，这些效果是在使用强效的、非临床佐剂（CFA/IFA）条件下证明的。虽然基于总淋巴细胞计数的初步安全性评估令人鼓舞，但包括B细胞亚群分析、免疫球蛋白谱分析、BAFF水平监测和组织学关节评估在内的全面评价对未来临床前和临床开发至关重要。此外，后续研究必须通过使用临床相关佐剂和严格控制在菌内毒素等潜在混杂因素来解决该方法的转化问题。因此，基于BAFF的疫苗代表了针对自身细胞因子进行主动免疫的新型且有前景的概念验证策略。研究结果值得进一步开发，包括在治疗模型中的评价、BAFF中和及受体阻断机制研究，以及全面的长期安全性评估。该方法可能有助于开发一类新的自身免疫疾病免疫治疗药物。