《Journal of Industrial and Engineering Chemistry》：Scalable production of red cabbage–derived extracellular vesicles via tangential flow filtration with preserved therapeutic properties
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植物外泌体规模化生产关键技术及红甘蓝来源EVs（Rabex）的生物学效应评估。
苏珍康（Su Jin Kang）|尹贞京（Eun Jung Kim）|白吉灿（Gichan Baek）|朴俊硕（Jun Sub Park）|朴恩珠（Eun Ju Park）|朴镇奥（Jin Oh Park）|李元钟（Won Jong Rhee）
生物工程与纳米生物工程系，仁川国立大学，韩国仁川，22012
摘要
植物来源的细胞外囊泡（EVs）作为治疗和商业生物材料引起了广泛关注；然而，可扩展的生产仍是一个主要障碍。传统的基于超滤（UF）的工艺存在通量低和膜污染的问题，这阻碍了红甘蓝来源的EVs（Rabex）的临床应用，尽管Rabex在炎症性肠病（IBD）中显示出抗炎潜力。我们建立并定量评估了一种基于切向流过滤（TFF）的工艺，以促进Rabex的可扩展生产。与标准UF后接尺寸排阻色谱（UF/SEC）的方法相比，TFF/SEC工艺将成本降低了88.6%（在测试规模下从98.1美元降至11.3美元），同时将处理能力提高了7.7倍，且产量保持相当。值得注意的是，TFF/SEC方法生产的Rabex纯度更高，因为显著减少了蛋白质杂质。物理化学表征证实，两种方法生产的颗粒在大小分布、表面电荷、形态和分子组成方面相似。蛋白质组学分析显示，两种方法产生的核心蛋白质具有高度一致性，表明分子完整性得到了保持。体外实验验证表明，TFF法制备的Rabex保留了其固有的生物活性，包括促进成纤维细胞增殖和抑制巨噬细胞炎症的作用。此外，体内评估显示没有系统毒性。这些发现表明TFF是一种经济高效、可扩展的植物来源EVs生产平台，支持其在IBD和其他炎症性疾病中的临床开发。
引言
许多传统药物的治疗效果常常受到药代动力学不佳、生物利用度低和剂量限制毒性的限制。为了克服这些限制，纳米医学领域取得了显著进展，纳米医学采用基于纳米技术的策略来增强疾病预防和治疗[1]、[2]、[3]、[4]。在各种纳米载体中，细胞外囊泡（EVs）作为生物活性分子的天然递送系统越来越受到关注[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。EVs是膜包裹的纳米级囊泡，通过运输蛋白质、核酸和脂质来促进细胞间通讯[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。由于其固有的生物活性、生物相容性以及向目标细胞递送功能性载物的能力，EVs被广泛研究作为治疗剂和药物递送平台[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。迄今为止，已探索了来自哺乳动物、植物和细菌的EVs在临床应用中的潜力[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。
在这些来源中，植物来源的EVs因其天然来源、低免疫原性和可扩展生产潜力而成为特别有前景的候选者[28]、[29]、[30]、[31]。这些囊泡由植物细胞自然分泌，已被证明能够将生物活性分子递送到哺乳动物细胞中，引发特定的生物反应[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]。最近，植物来源的EVs因其来源于可食用物质（如水果、种子、叶子和根）而受到广泛关注，这些物质通常具有较低的免疫原性和良好的安全性。尽管有这些优势，但针对植物来源EVs的大规模生产过程的系统性和标准化研究仍然很少[43]、[44]。特别是，源材料选择、上游处理、分离、浓缩和批次间一致性等关键参数尚未得到充分优化，以满足工业生产的需求。因此，基于EV的治疗剂的临床和工业转化仍面临重大挑战。传统的分离方法（如超速离心）由于产量低、囊泡聚集和工作体积有限而不适合大规模生产。基于色谱的纯化方法（如阴离子交换或多模式流式色谱）可以实现EVs的可扩展生产，但需要复杂的优化并增加工艺成本。相分离策略，包括聚合物盐水两相系统（ATPS）和聚乙二醇（PEG）沉淀法，操作简单，但由于共分离的杂质而常常影响纯度[45]、[46]。总体而言，现有的分离和浓缩技术往往无法达到治疗应用所需的产量和质量，使得在工业层面大规模生产高质量EVs在技术上具有挑战性。
超滤（UF）是生物加工中最常用的传统浓缩方法之一[47]、[48]、[49]。然而，作为一种死端过滤系统，它容易发生膜堵塞和污染，从而降低浓缩效率并延长处理时间[50]、[51]。此外，UF处理过程中产生的高剪切应力可能会损害目标生物材料的回收率和结构完整性，从而降低分离效率。为了解决这些问题，切向流过滤（TFF）作为一种实用且可扩展的替代方法出现了[52]、[53]。由于其交叉流动配置，TFF有效减少了膜污染，并在大体积处理过程中保持了稳定的过滤性能[54]、[55]、[56]。然而，过滤系统本身会产生流体动力剪切力，可能会损害囊泡膜的完整性，导致结构变形或改变生物活性。因此，开发并优化基于TFF的植物来源EVs浓缩工艺不仅需要提高过滤效率，还需要仔细控制流体动力条件，以保持其结构和功能完整性。在本研究中，TFF工艺在受控的低压条件下设计和操作，以尽量减少剪切对囊泡的损害，同时保持可扩展性。为了确保工艺的可行性，必须验证使用TFF浓缩的EVs在物理化学特性和生物活性方面与通过传统浓缩方法获得的EVs相当，同时提供更好的可扩展性和制造实用性。
在这里，我们开发并验证了一个基于TFF的可扩展制造平台，以红甘蓝来源的细胞外囊泡（Rabex）作为模型系统。先前研究表明，Rabex具有强大的生物活性，包括促进细胞增殖和抑制炎症反应，并已在体外和体内模型中作为炎症性肠病（IBD）的治疗候选物进行了研究[32]、[37]。鉴于IBD发病率的上升以及对安全、无免疫原性和低成本抗炎治疗剂的迫切需求，像Rabex这样的植物来源EVs代表了具有临床转化潜力的候选物。尽管具有治疗潜力，但之前的Rabex分离策略依赖于UF后接尺寸排阻色谱（SEC）——这些方法本质上限制了处理通量和可扩展性[57]、[58]。因此，为了促进基于Rabex的治疗剂的临床开发和最终商业化，需要一种能够大量生产EVs同时保持其生物功能性的稳健且可扩展的制造策略。为了解决这一挑战，采用了TFF作为替代的上游浓缩方法。具体来说，使用了中空纤维过滤模块来最小化膜污染，并建立了具有制造相关性和商业可行性的工作流程[59]、[60]。通过UF或TFF浓缩后通过SEC分离的Rabex分别称为UF/SEC和TFF/SEC。重要的是，基于TFF的工艺旨在保持Rabex的生物活性和蛋白质组学特征，同时大幅提高处理能力。此外，系统评估了UF/SEC和TFF/SEC的生物相容性，以确定它们是否适用于大规模和临床相关应用。总体而言，本研究对植物来源EVs的可扩展制造策略进行了全面评估，强调了它们作为下一代生物制剂的潜力。
章节摘录
基于超滤和切向流过滤的Rabex浓缩
红甘蓝（Brassica oleracea var. capitata f. rubra）用蒸馏水清洗三次，以去除灰尘和表面污染物。在室温下使用商用搅拌机将红甘蓝搅拌均匀。汁液依次在8,000?×?g下离心1小时和在4?°C下离心20,000?×?g下离心1小时，以去除大颗粒和颗粒污染物。收集澄清的上清液，储存在-80?°C直至使用，然后通过UF或TFF进行浓缩
使用切向流过滤大规模生产Rabex
为了在不损害Rabex生物完整性的前提下实现大规模生产，开发并优化了一种基于TFF的策略来浓缩红甘蓝汁中的Rabex。传统的UF系统依赖于死端过滤和基于离心的浓缩方法，其处理体积有限，并且容易发生渐进性膜污染，导致渗透率下降和处理时间延长（图1A）。这些限制代表了
结论
本研究展示了一种用于植物来源EVs的可扩展和可重复的制造策略，以Rabex作为代表性模型。这项工作是首次全面评估TFF集成可扩展生产植物来源EVs的案例之一，结合了产量量化、纯度分析、蛋白质组学分析、生物验证和体内系统安全性评估，形成了统一的工作流程。通过采用TFF作为浓缩过程，我们
CRediT作者贡献声明
苏珍康（Su Jin Kang）：撰写——原始草稿、验证、方法学、数据分析、概念化。尹贞京（Eun Jung Kim）：项目管理。白吉灿（Gichan Baek）：概念化、研究、方法学、撰写——审稿与编辑。朴俊硕（Jun Sub Park）：项目管理。朴恩珠（Eun Ju Park）：项目管理、研究。朴镇奥（Jin Oh Park）：项目管理、研究。李元钟（Won Jong Rhee）：撰写——原始草稿、验证、监督、项目管理、方法学
资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）（由韩国政府资助，项目编号RS-2022-NR069930）和2023年仁川国立大学研究基金的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
